Способ получения @ -инозиновой кислоты Советский патент 1993 года по МПК C12P19/30 C12P19/30 C12R1/13 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству соединений, родственных нуклеиновым кислотам, и касается способа получения 5-иНозииовой кислоты (5-ИМФ) методом микробиологического синтеза.

5-ИМФ является ценным реактивом, применяемым в разных областях экспериментальной биологии, служит исходным соединением для синтеза аномальных пуриновых производных, используемых как противоопухолевые препараты, а также находит применение в пищевой промышленности как высокоэффективная вкусовая приправа..

Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта.

Применяемый в предлагаемом способе штамм Brevibacterlum ammonfagenes 8НИИгенетика-107 получен из штамма Вг. ammoniagenes ВНИИгенетика-225-5 направленным селекционным путем. Он отличается от родительского штамма устбйчивостью к меркаптопуринрибозиду и обладает повышенным уровнем-биосинтеза 5-1ЛМФ.

Культурально-морфологическая характеристика штамма ВНИИгенетика-.107. Грамположительная палочка, спор не образует. На агаризованной среде Хоттингера и мясопептонном агаре образует колонии круглой формы, гладкие, с ровным краем, бледно-желтого цвета, диаметром 1,0-1,5 мм. Штамм нуждается для роста ваденине. Применяемый в описываемом способе штамм депонирован в Центральном музее культур промышленных микроорганизмов института ВНИИгенетика и имеет регистрационный номер ЦМПМ-В-3172.

Питательная среда в предлагаемом способе содержит в качестве источника фосф1 ра фосфорнокислый калий однозамещенйый (КНгРО) вместо смеси фосфатов калия одно- и двузамещенного, что позволяет исключить дополнительную операцию подкисление среды перед стерилизацией.

В описываемом способе в оптимальных условиях ферментации уровень накопления 5-ИМФ достигает 16,3-26,8 г/л за 144 ч ферментации по сравнению с 10,3 г/л в известном способе. При этом скорость накопления 5-ИМФ составляет 0,18 г/л.ч, а в прототипе 0,07 г/л.ч, экономический коэффициент использования глюкозы 19.1% вместо 10,3% в прототипе. В связи с этим, несмотря на некоторое удорожание среды, связанное с повышением концентрации ее компонентов, преимущества предложенного способа не снижаются.

Способ осуществляют следующим образом.

Культуру штамма Вг. ammoniagenes выращивают на агаризованной среде Хоттингера в течение 24 ч при 28°С, переносят в колбы с посевной средой и выращивают при постоянном перемешивании и аэрации в течение 18-24 ч при 28-30°С. Затем посевной материал передают в ферментационную среду в количестве 10 об.%. Процесс ферментации проводят при в колбах на качалке (240-350 об/мин) при аэрации и перемешивании, обеспечивающих скорость растворения кислорода 2,6-3,8 г Оал-ч, Накопление 5-ИМФ в культуральной жидкости достигает 16,3-26,8 г/л за 144 ч ферментации.

Л р и м е р 1. Культуру штамма Вг. ammoniagenes ВНИМгенетика-107 со скошенного агара Хоттингера переносят на жидкую посевную среду следующего состава, мас.%:

Техническая глюкоза 2,00

Пептон1,00

Дрожжевой экстракт 1.00

NaCt.0,25

ВодаОстальное

Посевной материал выращивают в колбах Эрленмейера емкрстью 750 мл, содержащих 75 мл среды, на качалке делающей 240 об/мин, в течение 24 ч при 28-30°С, Инокулянт передают в количестве 10об.% в ферментационную питательную среду следующего состава, мас.%: Техническая глюкоза 15,0 Кукурузный экстракт (КЭ) 6,0 КН2Р043,0

MgS041,0

Мочевина. 0,84

ВодаОстальное

Среду стерилизуют при 0,8 атм в течение 30 мин. Мочевину стерилизуют отдельно в виде 40%-ного раствора при 0,5 атм в течение 30 мин. После стерилизации рН ферментационной среды доводят 5 н раствором КОН до 7,5 и добавляют раствор мочевины.

Процесс ферментации осуществляют в колбах Эрленмейра емкостью 750 мл, содержащих 30 МЛ среды, на качалке, делающей 350 об/мин, что при аэрации и перемешивании соответствует скорости растворения кислорода 3.8 г Оа/л-ч при 35С. 11осле 144 ч ферментации в культуральной жидкости накапливается 26,8 г/л 5-ИМФ.

Примеры осуществления способа при других параметрах, т.е. на средах другого

состава и при других режимах культивирования, приведены в таблице

Накопление ИМФ в зависимости от соста ва среды

Как видно из таблицы, максимальный уровень накопления ИМФ 26.8 г/л достигается при использовании питательной среды, содержащей 15% глюкозы, 6% кукурузного экстракта и 0,84% мочевины. Уменьшение концентрации указанных компонентов приводит к значительному торможению накопления ИМФ. Увеличение концеитрированности среды неэффективно и нерентабельно, поскольку это приводит к ее удорожанию и к уменьшению выхода целевого продукта.

Максимальный выход ИМФ на среде оптимального состава достигается в условиях .1Нтенсивного снабжения среды кислородом и при определенном, довольно узком интервале температур.

На фиг.1 показана зависимость накопления ИМФ от условий аэрации; на фиг.2 зависимость накопления ИМФ от температуры культивирования.

Как видно из .фиг. 1, наибольший выход ИМФ наблюдается при аэрации, соответствующей скорости растворения кислорода 2,6-3,8 г 02/л.ч. Увеличение степени аэрирова1 я выше этого уровня не представляется возможным по техническим причинам.

Как видно из фиг.2 наиболее активное образование ИМФ происходит при 3235С. Снижение температуры до 28°С вызывает уменьшение выхода ИМФ. Повышение температуры до 37°С резко ингибирует процесс биосинтеза.

(56) Патент Франции № 1465166, кл, С 12 Р 19/30, опублик. 1970. 25 Авторское свидетельство СССР №615130. кл. С 12 Р 19/30, 1975.

Формула изобретения

CnOCQB ПОЛУЧЕНИЯ Б-ИНОЗИНОВОЙ КИСЛОТЫ, включающий культивирование микроорганизмов - продуцентов вида Brevibacterlum ammontagenes на водной питательной среде, содержащей источник углерода, азота, минеральные соли и ростовые факторы в условиях аэрации, выделение .и очистку, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, в качестве продуцента используют штаммBrevibacterium

30 ammonlagene s ВНИИ генетика-107, а питательная среда содержит в качестве источника углерода техническую глюкозу в количестве 12-15 мас.%, в качестве источника азота - мочевину в количе35 стве 0,72 - 0,84 мас.%, в качестве источника ростовых факторов - кукурузный экстракт в количестве 5-6 мас.%, при этом культивирование осуществляют при 32 - 35С, а аэрацию проводят со скоростью растворения кислорода 2,6 - 3,8 г 02 / л -ч. 0,05-0,5 мас.% палладия.