Способ получения ксантозина Советский патент 1983 года по МПК C12P19/00 

Изобретение относится к микробиол гической промышленности в частности к получению производных нуклеиновых кислот, и касается способа получени ксактозика, применяемого в фармакол гин в качестве исходного соединения для синтеза антимикробных метаболитов, а также ксантиловой кислоты и может быть использовано в различн областях экспериментальной биологии Известен способ получения ксанто зина с использованием микробиологического синтеза, основанный на использовании ауксотрофных штаммов Еа с 1- 1 U S S U Ь t i 1 S и т . д. ij Максимальный уровень накопления ксантозина находится в пределах 5,7 8,9 г/л при использовании штаммов Bacillus subtil is, культивируемых на средах, содержащих дорогостоящее сырье, мало доступное для промышлен ности (рибонуклеиновые кислоты, гил ролизат казеина, пуриновые осно.вания, экстракт соевой муки). Другие применяемые микроорганизмы продуцируют ксантозин в количестве до 5 г/л. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ получения ксантозин путем культивирования штамма Вас subtil is 3-35 на ферментационной среде, содержащей глюкозу в качестве источника углерода,, экстракт обезжиренной соевой муки, цитрат натрия, в качестве ростовых вешеств минеральные соли. Выход ксантозина в культуральной жидкости составляет 8,9 г/л за 168 ч ферг.5ентац-ии . Недостаток данного способа, заключается в том что он не обеспеч:ивае высокого выхода ксантозина; так как используеьый штамм Вас 1 us виьсП i 3--35 обладает ..недостаточно высокой, активностью, кроме того, в извеютком способе используются среды, содержащие дефицитное сырье в виде эк стракта соевой муки,, как источника ростового фактора и .пимонно-кислого натрия. Цель изобретеки.я увеличение выхода ксантозина и удешевление про цесса, Поставленная цель достигается тем, что согласно способу, получения ксантозина путем культивирования Г1родуцирую1-;,их его микроорганизмов вида Вас 11 us subtil is в условиях аэрации на питательной среде, содержащей углеводы- Е каг.естве источникауглерода .. источник азота. ,минеральные соли и ростовые вещества j- из вида Bacillus subtllls используют штамм Bacillus su&t i I i s ВНИИгенетика-3r a в качестве ис точника ростовых вешеств - белково-витаминный концентрат. Штамм Bacillus subtMU ВНИИг.енетика-3 получают иэ штамма Вас. subtil is ЦМПМ В-1321 в результате Применения генетико-селекционных методов, в частности путем введения в геном исходного штамма трех мутаций; устойчивости к 8-азаксантину, ауксотрофности и реверсии по урацилу. Штамм депонирован во ВНИИгенетика и имеет номер ЦМПМ . Штамм ВНИИгенетика-3 обладает более высоким уровнем накопления ксантоэина, чем известные и храните в Центральном музее культур промышленных микроорганизмов Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов и имеет регистрационный номер имПМ В-2381. Применение в способе штамма ВНИИгенетика 3 на специально подобранных средах, содержаш.их в качестве, ростового фактора БВК и условиях ферментации позволяет получать до 13,2 г/л ксантозина. ШтадЧ-вд ВНИИгенетика характеризуется следующими морфологическими и культуральными признаками. Морфология. Штамм представляет собой граммположите пьнуюпалочку, размером 4-5 U О , 7-0 ,8 |U , в. отличие от исходного цтамма ЦМПМ В-1321 является аспорогенным. Культурально-морфологические признаки , Мясо-пептонный агар. При инкубации в течение 24 ч при образует бело-желтые колонии,- круглые, диаметром 3-4 мм. Поверхность слизистая с умеренно извилистыг краем, срастается с субстратом (поверхность колонии исходного штамма ЦМПМ В-1321 морщинистая) . Мйсо-пептонный бульон. При инкубации в тече.ние 24 ч при 37 С без встряхивания наблюдают помутнение среды., на поверхности образуется моринистая пленка. При стоянии образуется осадок. Агазированная среда Хоттингера, ри инкубации в течение 24 ч, при 31°С образует бело-желтые колонии,, лизистые, диаметром Рвл с умеенно извилистым краем, срастается субстратом, - Синтетическая среда с минеральым азотом. Рост отсутствует. .Штамм уждается в добавке аденина, гистидиа, тирозина, Физиолого-биохимические признаки. рамположительный, аэробный, рост оверхностный. Желатину разжижает. РСрахмал гидролизует. Молоко пептонизирует

Отношение к источникам углерода. Усваивает глюкозу, галактозу, фруктозу, мальтозу, маннозу, рамнозу, рибоэу, сахарозу, арабинозу, глицерин, маннит.

Во всех случаях роста на полноценных средах присутствует запах, характерный для культур вида ВасПI us subtIlls.

Спосо.6 осуществляется следующим образом.

Культуру штамма Вас i П us subt I fIs ВНИИгенетика-3 выращивают на агаризованной среде Хоттингера или МПА в течение 20-24 ч при , переносят Е юлбы с посевной средой и выращивают при постоянном перемешивании и аэрации в течение 18-24 ч при 28-30°С. Затем посевной материаш переносят в ферментационную среду в количестве 4-6 об.%. Процесс биосинтеза осуществляют в колбах на качалке (240-260. об/мин) при аэрации и перемешивании,обеспечивающих скорост t acTBOpeHHH кислорода 2,4-3,8 . Оптимальная температура процесса фер ментации 32-34с.

I

Посевные и ферментационные- среды содержат в качестве источника углерода техническую глюкозу, источника азота - азотнокислый аммоний, источника ростовых факторов - БВК, пептон минеральные соли ( HgSO , NaCI), мел. Все компоненты питательных сред смешивают и стерилизуют.

Накопление ксантозина в культурал ной жидкости достигает 13,2 г/л за 144 ч ферментации, помимо ксантозина штамм накапливает до 5 г/л инозина.

Пример 1. Культуру со скошейного агара Хоттингера переносят на жидкую посевную среду следуклцего (Состава, %;

Глюкоза техническая 2,О

БВК1,0

Пептон1,0

NaCl 0,25

Посевной материал выращивают в колбах емкостью 750 мл, содержащих 100 мл среден, на качалке, делающей 220-240 об/мин в течение 24 ч, при 28-30 С. Ьнокулят передают в ферментационную среду в количестве 4,0 об.%.

Состав ферментационной среды, %:

12,0

Глюкоза техническая 2,5

БВК - 2,5

СаСО 2,0

М|С 1, 0,5

Вода водопроводн:1я, рН среды до стерилизации устанавливают на уровне 7,0 с помощью едкого кали. Глюкозу стерилизуют совместно со средой

Процесс ферментации проводят в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл, содержащих 30 мл среды, соответствующей скорости растворения кислорода 2,4-3,8 rOj/л в час при 28-30С на качалке, делающей 220-240 об/мин. После 144 ч ферментации в культуральной жидкости накапливается 9,6 г/л ксантозина, а также 3,1 г/л инозина.

Пример 2. Штамм, состав посевной и ферментационной сред, условия выращивания посевного материала и условия ферментации аналогичны примеру 1. Отличие заключается в том что ферментацию проводят при повышенной температуре, т.е. 32-34 С. Через 144 ч культивирования в культуральной жидкости накапливается 13,2 г/л ксантозина, а также 4,8 г/л инозина.

Выделение ксантозина осуществляется известными способами.

Таким образом, предлагаемый способ и использование штамма ВНИИгенетика-3 позволяет получать выход целевого продукта до 13,2 г/л за 144 ч ферментации на ферментационной питательной среде, содержащей доступное сырье в виде технической глюкО;зы и БВК, при повышенной температуре и достаточной аэрации.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КСАНТОЗИНА путем культивирования продуцирующих его микроорганизмов вида Bacillus sub tills в условиях аэрации на питательной среде, содержащей углеводы в качестве источника углерода, источник азота,минеральные соли и ростовые вещества, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта и удешевления процесса, из вида Bacillus subtil Is используют штамм Bacillus subtnis ВНИИгенетика-3, а в качестве источника ростовых веществ белково-витаминный концентрат. 2. Способ по п. 1, отлича ющ и и с я тем, что культивирование ведут при 28-34 С и скорости растворения кислорода в среде 2,4-3,8 г Ол/л в час.