Штамм СоRYNевастеRIUм аммоNIаGеNеS - продуцент инозин-5 @ -монофосфата Советский патент 1993 года по МПК C12P19/32 C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается микробиологического синтеза инозин-5 -моно- фосфата (5 -ИМФ). Инозинат натрия находит широкое применение в пищевой промышленности. Он используется как вкусовая приправа, превосходящая по своей эффективности глутамат натрия и обладает синергидным действием в отношении ряда аминокислот, улучшая и усиливая вкусовые качества пищевых продуктов.

Целью изобретения является увеличение выхода 5 -ИМФ, снижение расхода глюкозы на единицу продукции, снижение энергозатрат в процессе культивирования штамма.

Это достигается получением нового штамма Corynebacterlum (Brevibacnerlum) ammochiagenes Ap13, депонированного во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В- 5604.

Ы

Штамм ВКПМ В-5604 получен генетико- селекционным способом после обработки штамма Br. ammonlagenes ВНИИгенетика 225-5 (ВКПМ В-1073) УФ-лучами. Введение в геном родительского штамма последовательных мутаций резистентности к повышающимся концентрациям пенициллина и ампициллина привело к появлению у штамма ряда полезных свойств, улучшающих его технологические,характеристики: увеличение выхода и скорости накопления 5,-ИМФ, повышение эффективности использования глюкозы. В отличие от штамма-прототипа, у которого образование 5,-ИМФ подавляется на .60-70% при повышении температуры свыше 35°С, штамм В-5604 не только сохраняет, но и увеличивает биосинтетическую активность при повышении температуры до 37-38°С.

Устройство заявляемого штамма к высоким концентрациям пенициллина и ампициллина позволяет использовать эти антибиотики для защиты процесса в производственных условиях от инфицмрования посторонней микрофлорой.

Культурно-морфологические признаки.

Грамположительная палочка длиной до 1,5 мкм, шириной 0,6-0,8 мкм, без жгутиков, неподвижная, спор не образует. На агари- зованной среде Хоттингера после 24-48 ч культивирования при 30-34° образует круглые колонии диаметром 2,0-3,0 мм с ровным краем, бледножелтого цвета. Поверхность колоний гладкая, с матовым блеском и слабой концентрической исчерченностью. При посеве петлей на агаризованную среду Хоттингера после инкубации в течение 20-24 ч при 30-34° штрих густой, бледножелтого цвета, с гладкой блестящей поверхностью, Аэроб, При посеве уколом в полноценную агаризованную среду растет только на поверхности укола, при инкубации на жидких полноценных средах при 30-34° без встряхивания рост отсутствует, пленки на поверхности не образуется. При встряхивании через 24 ч инкубации наблюдается значительное помутнение.

. Для роста на жидкой и агаризованной среде требуется добавка аденина, биотина, витаминов Bi и Вз,

Культуру поддерживают на косяках с агаризованной средой Хоттингера с добавкой 10 мг/л аденина.

Физиолого-биоохимические признаки. Штамм В-5604 является ауксотрофом по аденину. Желатину не разжижает. На крахмальном агаре и обезжиренном молоке не растет. На ломтиках картофеля рост умеренный. Клетчатку не разрушает и не усваивает. Нитраты не восстанавливает. Усваивает глюкозу, фруктозу, рибозу, цитрат,

пуриновые и пиримидиновые рибонуклео- зиды. Плохо усваивает сахарозу, сорбит, маннит. Не потребляет лактозу, галактозу, ксилозу, арабинозу, рамнозу, маннозу, фу- марат, сукцинат, глицерин.

Антагонистических свойств не обнаруживает. Непатогенен.

Устойчив к 500 мг/л ампициллина натрия и к 200 мг/л бензилпенициллина. Био- синтетическая активность штамма В-5604 не подавляется при повышении температуры до 37-38°, что отличает его от родительского штамма и штамма-прототипа.

Как следует из данных приведенных в таблице, штамм В-5604 при культивировании при 34° накапливает в культуральной жидкости 32,3 г/л 5 -ИМФ, что на 20,6% превышает уровень накопления 5 -ИМФ штаммом-прототипом. При этом скорость накопления 5 -ИМФ и степень конверсии глюкозы в целом продукт у заявляемого штамма заметно выше, чем у штамма-прототипа.

Как видно из таблицы, преимущества штамма В-5604 по сравнению с прототипом еще более выражены при повышенной температуре ферментами. Если у заявляемого штамма при увеличении температуры до 38° выход 5 -ИМФ повышается до 35,6 г/л, то у штамма-прототипа, напротив, резко подав- ляется - до 8,9 г/л.

Одновременно с увеличением биосинтетической активности заявляемого штамма при 38° возрастают скорость накопления 50- ИМФ и коэффициент конверсии глюкозы. П р и м е р 1. Культуру Corynebacterlum (Brevibacterium) ammonlagenes В-5604 со скошенного агара Хоттингера переносят в жидкую посевную среду следующего состава (мае. %):

глюкоза техническая 2,0 пептон 4,0 дрожжевой экстракт 1,0 NaCI 0,25 вода до 1QO Посевной материал выращива 6т в колбах емкостью 750 мл, содержащих 75 мл среды, на качалке (240-260 об/мин) при 34° в течение 24 ч. Посевной материал в количестве 10 об.% переносят ы ферментацион- ную среду следующего состава, мае. %: глюкоза техническая 15,0 кукурузный экстракт 6,0 КН2Р04 3,0 МдЗОд 7Н20 1.0 мочевина 0,84

водадо 100 Среду стерилизуют при 0,8 атм в течение 30 мин. Мочевину стерилизуют отдельно в виде 40%-ного раствора при 0,5 атм 30 мин. После стерилизации рН среды подводят до 7,3 раствором KOH7N и добавляют раствор мочевины.

Процесс ферментации осуществляется в колбах емкостью 750 мл, содержащих 30 мл среды на качалке, делающей 350 об/мин, что соответствует скорости растворения кислорода 3,8 г Оа/л ч при 34°.

После 144 ч ферментации в культураль- ной жидкости накапливается 32,3 г/л 5- ИМФ. Степень конверсии глюкозы в ИМФ 21,5% (в прототипе 17,8%).

П р и м е р 2. Штамм, условия выращивания посевного материала, составы посевной и ферментационной сред те же, что и в примере 1. Отличия состоят в том, что фер- ментация проводится при 38°.

После 144 ч ферментации в культураль- ной жидкости накапливается 35,6 г/л 5,- ИМФ. Степень конверсии глюкозы 23,7% (в контроле 5,9%).

П р и м е р 3 (контроль). Составы-посевной и ферментационной сред, условия ферментации те же, что в примере 2. Отличия состоят в том, что используется штамм-прототип Brevibacterlum ammonlayeries ВНИИ- генетика 107(ВКПМ В-3172).

После 144 ч ферментации в культураль- ной жидкости накапливается 8,9 г/л 5- ИМФ. Степень конверсии глюкозы 5,9%.

Таким образом, заявляемый штамм Corynebacterlbm (Brev) annonlagenes ВКПМ В-5604 обладает следующими преимуществами по сравнению со штаммом-прототипом:

превосходит штамм-прототип по уровню накопления 5 -ИМФ при температуре 34° на 21 %, при температуре 38° - на 33%:

снижает расход глюкозы на единицу .продукции;

позволяет снизить энергозатраты в процессе культивирования штамма благодаря повышению верхнего предела культивирования до 38°;

позволяет ввиду своей резистентности к ампициллину и бензилпенициллину использовать эти антибиотики для защиты процесса от посторонней микрофлоры в производственных условиях.

Улучшенные технологические свойства штамма В-5604 обеспечивают увеличение экономичности и рентабельности процесса биосинтеза 5 -ИМФ. Так, резистентность к антибиотикам позволяет сократить количество нестерильных операций. Термостабильность биосинтеза 5 -ИМФ у штаммя В-5604 позволяет вести процесс при повышенных температурах, что экономически выгодно в промышленном производстве. И, наконец, повышение эффективности использования глюкозы на образование целевого продукта обеспечивает снижение затрат углеводного сырья на 1 кг ИМФ.

Формула изобретения Штамм Corynebacterium ammonlagenes

ВКПМ В-5604-продуцент ииозин-5 -монофосфата.

Использование: биотехнология и микробиологическая промышленность и касается микробиологического синтеза инозин-5 - монофосфата. Сущность изобретения: штамп Corynebacterlum (Brevlbacterium) ammaniagenes B-5604 получен генетико-селекционным способом после УФ-облучения штамма Brammonlagenes 225-5 и введения в геном родительского штамма последовательных мутаций резистентности к повышающимся концентрациям пенициллина и ампициллииа. В отличие от родительского штамма и штамма-прототипа, у которых об разование 5 -ИМФ; подавляется на 60-70% при повышении температуры свыше 35°С, штамм В-560Д. не только сохраняет, но и увеличивает биосинтетическую активность при повышении температуры до 37-38°С. Штамм В-5604 превосходит штамм-прототип по уровню накопления 5 -ИМФ. За 144 ч ферментации при 34°С или при 38°С штамм в-5604 производит 32,3 г/л или 35,6 г/л ино- зин-5 -монофосфата соответственно. Улучшение технологических свойств штамма позволяет увеличить экономичность и рентабельность процесса биосинтеза целевого продукта. Устойчивость данного штамма к высоким концентрациям пенициллина и ампициллина позволят использовать эти . антибиотики для защиты процесса в производственных условиях от инфицирования посторонней микрофлорой. 1 табл. ел с со о о ю

.Сравнение основных показателей, характеризующих заявляемый штамм

и штамм-прототип