Способ твердофазного синтеза дезоксиолигонуклеотидов Советский патент 1986 года по МПК C07H21/04 

Изобретение относится к химии, более конкретно представляет собой усовершенствованньш способ твердофазного синтеза дезоксиолигонуклеотидов используемых в биотехнологии,

Целью изобретения является повьшение выхода целевого продукта и сокращение продолжительности процесса.

Поставленная цель достигается за счет использования 1-(мезитиленсульфонил)-3-нитро-1,2,4-триазола в качестве конденсирующего агента и калиевой соли З-нитро-1,2,4-триазола и 18-крауна-6 в качестве катализатора- - .

Пример 1. Получение дезоксиолигонуклёотида d(TTTTTTTTTT).

95 г помещенного в шприц модифицированного силикагеля (силохром С-80), содержащего 4 мкмоль 4,4-диметокситритилдезокситимидина, (CHjO) TrdT, детритилируют 5%-ным раствором трихлоруксусной кислоты в 1 ,2-дихлорэтане {42 мл). Полимер промывают хлороформом(4«4 мл) и абсолютным пиридином (43 мл). Затем к отфильтрованному полимеру добавляю раствор 80 мкмоль 4,4 -диметекситритил-З -п-хлорфенилдезокситимидина, (CHjO) TrdTp(PhCl), 267 мкмоль калие вой соли З-читро-1,2,4-триазола, 267 мкмоль 18-крауна-6- и 400 мкмоль 1-(мезитиленсульфоНИЛ)-З-нитро-1,2,4триазола в 0,8 мл абсолютного пиридина. Реакционную смесь встряхивают 5 мин, полимер отфильтровывают и проьвывают хлороформом (42 мл). Цикл наращивания цепи повторяют.

После завершения последнего цикЛа олигонуклеотид детритилируют, отмывают хлороформом (З.З мл) и пиридином {3«3 мл) и обрабатывают в течени 36 ч 0,5 М раствором п-нитробензальдоксимата тетраметилгуанидиния в смеси пиридин-вода (7:3). Полимер от4мльтровывают и тщательно промывают пиридином (35 мл). Фильтраты объединяют, ynapHBdtoT досуха, растворяют в концентрированном водном аммиаке, вьщерживают в этом растворе при 20 С в течение 12ч, обессоливают на биогеле Р-2 (Bio-Rad Laboratories , США) и хроматографируют на ионнообменной смоле Pajrtisil lOSAX. ,. Получают 189,7 о.е. целевого продукта с обпщм выходом 53,9% (93,3% в расчете на средний цикл наращивания цепи).

962 ,

П р и м е р 2. Получение дезоксиолигонуклеотида d(ATGGTTTTTC).

Детритилируют 83 мг модифицированного силикагеля, содержащего 3,75 мкмоль (CHjO) TrdC. Детритилирование и конденсацию полимер- дезоксинуклеозида (олигонуклеотида) с 3 -пхлорфенилфосфатами (PhCl) защищенных дезоксинуклеозидов, а также выделение целевых продуктов проводят также, как в примере 1. После хроматографирования получают 176,2 о.е. целевого продукта с общим выходом 47,5% (92% в расчете на средний цикл наращивания цепи).

П р.и м е р 3. Получение дезоксиолигонуклеотида d(САСАСАСАТТТТСТССТ)

Детритилируют 73 мг модифицированного силикагеля,содержащего 2,9 мкмоль (CHjO)2TrdC. Детритилирование и конденсацию полимер-нуклеозида (олигонуклеотида) с 3 -п-хлорфенилфосфатами защищенных дезоксинуклеозидов проводят так, как описано в примере , После хроматографирования получают 91 о.е. целевого продукта с общим выходом 18,8% (90% в расчете на средний цикл наращивания цепи). Последовательности дезоксиолигонуклеотидов в синтезированных олигомерах подтверждены стандартным анализом по методу Максама-Гилберта.

П р и м е р 4. Получение дезоксиолигонуклеотида d(ТТТТТТТТТТ).

Детритилируют 95 мг модифицированного силикагеля, содержащего 4 мкмоль (CHjO) TrdT. Детритилированне и промывку полимера осуществляют так, как описано в примере 1. Затем к отфильтрованному полимеру добавляют раствор 80 мкмоль(СНзО) TrdTp(PhCl), 160 мкмоль калиевой соли З-нитро-1, 2,4-триазола, 160 мкмоль 18-крауна-6 и 240 мкмоль 1-(мезитиленсульфонил)-З-нитро-1,2,4-триазола в 0,8 мл абс. пиридина. Реакционную смесь встряхивают 5 мин, полимер отфильтровывают и промывают хлороформом (4 2 мл). Цикл наращивания цепи повторяют . Деблокирование и вьщеление целевого продукта осуществляют так, как описано в примере 1. После хроматографирования получают 180,1 о.е, целевого продукта с общим выходом 51,2% (92,8% в расчете на средний цикл наращивания цепи).

П р и м е р 5. Получение дезоксиолигонуклеотида, d(CCCCCTTTTTTTA). 3 Детритилируют 50 мг модифицирова ного силикагеля, содержащего 3 мкмоль (CHjO)j TrdA. Детритилирова ние и промывку полимера осуществляют так, как описано в примере I, Затем к отфильтрованному полимеру прибавляют 18 мк|4оль (CHjO)2.(PhCl), 60 мкмоль калиевой соли З-нитро-1,2 4-тиазола, 60 мкмоль 18-крауна-6 и 90 мкмоль 1-(мезитш1енсульфонил)-3нитро-1,2,4-триазола в 0,18 мл абс. пиридина. Реакционную смесь встряхивают 5 мин, полимер отфильтровьгоают и промьгоают хлороформом ( мл). Цикл наращивания цепи повторяют. Де блокирование и выделение целевого продукта осуществляют так, как описа но в примере 1. После хроматографирования получают 112,7 о.е. с общим выходом 33,1% (91,2% в расчете на средний цикл наращивания цепи). Использование соотношения полимер дезоксинуклеозид: 3 -п-хлорфенил защищенный дезоксинуклеозид меньше, чем 6:1 невозможно по техническим причинам, поскольку для полного смачивания носителя необходимо не менее 150-180 мкл реакционной смеси. Приме нять избыток Р-компонента более, чем 20-кратный, не имеет смысла, посколь ку. в таком большом избытке он уже не влияет ни на скорость, ни на вькод, и расход реагента не рационален. Принципиальным отличием изобретения является использование в качестве иуклеофильного катализатора реакции конденсации обнаженного аниона - З-нитро-1,2,4-триазолия, который образуется при смешивании эквимолярных количеств калиевой соли З-нитро-1,2,4-триазола и 18-крауна-6 Применять соотношение калиевой соли З-нитро-1,2,4-триазола и 18-крауна-6 964 иные, чем 1:1, не имеет смысла, поскольку одна молекула краун-эфира сольватирует один катион калия. Таким образом, уменьшение времени реакции конденсации в одном цикле приводит к сущесивенному сокращению времени синтеза конечного продукта при сборке олигонуклеотидов с длиной цепи более 10 нуклеотидных звеньев. Высокий средний выход на один цикл наращивания цепи приводит к значительному повьш1еиию выхода целевого продукта. Указаиные преимущества позволяют применять изобретение в крупномасштабном синтезе олигонуклеотидов. Формула изобретения Способ твердофазного синтеза дезоксиолигонуклеотидов путем конденсации фиксированного на полимерной матрице защищеиного нуклеозида или олигонуклеотида со свободной 5 -гидроксильной группой с 3 -п-хлорфеиилфосфатами защищенных нуклеозидов в абсолютном растворителе, в присутствии конденсирующего агента и катализатора, отличающийся тем, что, с целью повьш1ения выхода и ускорения процесса, конденсацию проводят в пиридине с 6-20-кратным молярным избытком 3 -п-хлорфенилфосфата защищенного нуклеозида, в присутствии 1-{мезитиленсульфонил)-З-нитро-1,2,4триазола в качестве конденсирующего агента и калиевой соли З-нитро-1,2,4триазола и 18-крауна-6 в молярном соотношении 1:I в качестве катализатора, причем соотношение между 3 -пхлорфенилфосфатом, конденсирующим агеном и катализатором в молях составляет 1:(3-5):(2-3).

Изобретение касается нуклеотидов, в частности дезоксиолйгонуклеотидов (НУК), используеьшх в биотехнологии. Способ твердофазного синтеза НУК ведут конденсацией фиксированного на полимерной матрице защищенного нуклеозида или олигонуклеотида со свободной З -гидроксильной группой с 3 -п-хлорфенилфосфатами защищенных нуклеозидОБ, взятых в 620-кратном избытке, в среде абсолютного растворителя - пиридина, в присутствии конденсирующего агента 1 -(мезитиленсульфонил)-3-нитро-1,2,4-триазола. и катализатора - смеси калиевой соли.3-нитро-1,2,4-триазола с I8-крауном-6 в молярном соотношении 1:1, причем молярное соотношение З -П Хлорфенилфосфата, конденсирующего агента и катализатора составляет 1: