Способ твердофазного синтеза олигонуклеотидов Советский патент 1987 года по МПК C07H21/00 

113

Изобретение относится к биоорганической химии и биотехнологии и может быть использовано для твердофазного синтеза олигонуклеотидов как в ручном, так и в автоматизирова ном варианте.

Цель изобретения - повьпиение выхода олигонуклеотидов, ускорение и упрощение технологии, что достигается использованием в твердофазном синтезе носителей на основе целлюлозных тканей.

Пример 1. Приготавливают образцы целлюлозных тканей: из хлопчатобумажного полотна - диски диаметром 1 см и отрезок ленты размере 1x1 см, края которых фиксируют полиэтиленом, из льняного полотна (содержащего около 30% лавсана) - диски диаметром 1 см, края которых фиксируют полиэтиленом, и отрезок нити длиной около 3 см. Часть хлопчатобумажных и льняных дисков обрабатывают концентрированным аммиаком (используют препарат концентрации 25-28%) в течение 3ч, промывают водой (4x1 5 мл) ацетоном (3x15 мл) и высушивают на воздухе в течение ночи. К подготовленные образцам целлюлозных тканей (общей массой около 100 мг) прибавляют 108 мг (0,15 ммОЛЬ) 5 -0-димето- кситритилтимидин-З -0-сукцината, 0,1 мл (1,35 ммоль) 1-метилимидазо- да, смесь упаривают с абс, пиридином (3x10 мл) и прибавляют 1 мл абс. пиридина и 136 мг (0,45 ммоль) 2,4,6- триизопро/(Ш1бензолсульфонил хлорида. Через 1 ч диски промьюают пиридином (4 X 10 мл), прибавляют 0,2 мл 1-метилимидазола, смесь упаривают с абс. пиридином (3x10 мл), прибавляют 0,4 мл свежеперегнанного уксусного ангидрида и 2 мл абс„ пиридина. Че- рез 20 мин диски промьшают пиридином (4-10 мл), хлороформом (3x10 мл)„ пентаном (3x10 мл) и высуишвают на воздухе.

Нагрузку первого нуклеозида определяют спектрофотометрически по количеству диметокситритилкарбинола (499 71700 в смеси хлорная кислота этанол 3:2).

Количество первого нуклеозида (нагрузка) на носителе на основе целлюлозных тканей представлено в таблице,

П р и м е р 2. Два диска (один - .из бумаги Ватман - ЗММ, другой - из хлопчатобумажной ткани), содержащие в качестве первого нуклеозида 5 -0

02

диметокситритил-К,6-бензоил-аденозин, помещают в реактор колоночного типа установки для автоматического синтеза олигонуклеотидов и проводят автоматизированньй синтез олигодезоксири- бонуклеоитида d(TCATTTTTCTATACAAATTA). Удаление диметокситритильной защитной группы и все промывки носителей осуществляют автоматически, раствор

нуклеотидного компонента и конденсирующего реагента в абс. пиридине подают в реактор с помощью шприца.

После проведения последней стадии конденсации, .промьшок и удаления диметокситритильной защитной группы диски (каждый отдельно) обрабатывают 1,5 мл 0,5 М раствора п-нитробен- 3альдоксимата лития (пиридин-вода 8:2) в течение 20 ч, растворитель

упаривают на ротационном испарителе и диски обрабатьшают в 10 мл концентрированного аммиака в течение 20 ч при 45 С. Раствор отфильтровывают, диски прерывают водой (2x5 мл, объединенные фильтраты упаривают до половины объема. Органические примеси экстрагируют хлороформом (2x5 мл), водную фракцию упаривают досуха. Реакционную смесь обессоливают на колонке с биогелем Р-2, Целевой олиго- нуклеотид вьщеляют методом анионооб- менной ВЭЖХ в градиенте калий-фосфатного буфера. Выход олигодезоксирибо- нуклеотида d ( ТСАТТТТТСТАТАСАААТТА)

в расчете на первьй нуклеозид составляет 0,6% для носителя на основе бумаги Ватман-ЗММ (известньй способ) и 1,6% для носителя на основе хлопчатобумажной ткани.

Как видно из таблицы, предварительная активация целлюлозной ткани концентрированным аммиаком приводит к значительному увеличению нагрузки первого нуклеозида (в 1,8 раза для

льняньгх и в 5 раз для хлопчатобумажных) , Уменьшение концентрации аммиака в 2 раза (например, использование смеси пиридин - концентрированный аммиак 1:1) дает аналогичные резуль-

таты, Цри этом носители на основе целлюлозных тканей в отличие от бумажных после активации и введения первого нуклеозида не разбухают и сохраняют высокую прочность (механическую

стабильность),

ПримерЗ. Диски из бумаги Ватман-ЗММ или целлюлозной ткани, содержащие ковалентно присоединенньй

5 -0-диметокситритилтимидин, помещают в реактор установки и проводят удаление диметокситритипьной защитно группы с помощью 3%-ной трихлорукСус ной кислоты в хлороформе (контроль визуальный до исчезновения окраски диметокситритилкатиона) и последующу промывку хлороформом до нейтральной реакции элюата (контроль по индикатоной бумаге через каждые 1-1,5 мин промывки). Определяют время, необходимое для завершения этих операций; время полного детритилирования составляет 5-7 мин для бумажных дисков и 3-4,5 мин для дисков из ткани, а время полной отмьшки кислоты хлорофомом составляет 6-8 мин для бумажных дисков и 4-6 мин дня дисков из ткани

Таким образом, в результате сопоставления предлагаемого способа твердофазного синтеза олгонуклеоти- дов с известным способом подтверждается (пример 1) возможность достижения высокой нагрузки первого нуклео- зида на целлюлозных тканях (сравниваемой с нагрузкой на бумажных дисках в известном способе) с помощью предварительной щелочной активации и последующего присоединения первого нуклеозида. Кроме того, в многостадийном олигонуклеотидном синтезе (пример 2) при абсолютно одинаковых реакционных условиях во всех синтетических операциях выход конечного

Хлопчатобумажная ткань

диск

отрезок ленты

Льняная ткань диск

отрезок ленты

ВНИИПИ

Заказ 2479/22 Тираж 347

Подписное

Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

5 продукта (20-мера) на носителе из целлюлозной ткани более чем в 2,5 раза превышает выход, полученный на бумажном диске. При этом диски из целлюлозных тканей (пример 3) прсямы- вают растворителями от реагентов в 1,5-2 раза быстрее, чем диски из бумаги.

Формула изобретения

1.Способ твердофазного синтеза олигонуклеотидов, включающий модификацию сегментного носителя на основе целлюлозы путем присоединения первого нуклеозида с помощью защищенного нуклеозид-З -0-сукцината и последующее наращивание олигонуклеотидной цепи защищенньми нуклеотидными блоками в присутствии конденсирующего реагента, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода олигонуклеотидов, ускорения и упрощения процесса, в качестве носителя используют носитель на основе целлюлозных тканей, предварительно активированный щелочной обработкой.

2.Способ ПОП.1, о тлич аю- 0 Щ и и с я тем, что щелочную обработку осуществляют концентрированным водньм аммиаком или смесью пиридин- концентрированный водный аммиак (1:1 по объему).

0

5

208

148

Подписное

Изобретение относится к сахарам, в частности к твердофазному синтезу олигонуклеотидов (ОНК). Увеличение выхода ОНК, ускорение и упрощение процесса достигаются проведением его в других условиях. Твврдофазный синтез ОНК включает модификацию сегментного носителя (СН) на основе целлюлозных тканей. СН предварительно активизируют щелочной обработкой концентрированным водным аммиаком или его смесью с пиридином (Ijl по объе-. му). Модификацию проводят присоединением первого нуклеозида с помощью защищенного нуклеозид - З -0-сукцина- та. Последующее наращивание олигоиук- леотидной цепи защищенными нуклеотид- ными блоками ведут в присутствии конденсирующего агента. Испытания показывают, что диски из целлюпозных тканей промывают растворителями от реагентов в 1,5-2 раза быстрее, чем диски из бумаги. Кроме того, предварительная активация конц. NH целлюлозной ткани приводит к значительному увеличению нагрузки первого нуклеозида (в 1,8 раза для льняных и в 5 раз для хлопчатобумажных). Способ обеспечивает повышение выхода ОНК в 2,5 раза. 1 з.п. ф-лы, 1 табл. (Л 00 а