Способ очистки белкового токсина бактерий ВоRDетеLLа реRтUSSIS Советский патент 1990 года по МПК C12N11/00 A61K39/10 G01N33/50 C12N11/00 C12R1/01 

Изобретение относится к технической биохимии и биотехнологии, в частности к препаративному выделению белкового токсина бактерий Borrletella .pertussis, и может быть использовано в микробиологии, медицине и иммунологии .

Целью изобретения является повышение эффективности процесса и степени чистоты выделяемого токсина.

Способ осуществляют следующим образом.

Сначала проводят мягкий гидролиз фетуина или гаптоглобина с получением десиалированных производных. Эти производные затем фиксируют на водонерастворимом носителе (органическом или неорганическом) с получением аффинных сорбентов. Эти сорбенты используют для очистки белковых антигенов бактерий Bordetella pertussis.

При осуществлении способа отделяют токсин pertussis, который фиксируется на аффинном носителе, тогда как F-HA остается в растворе, затем элю- ируют токсин pertussis с помотью соответству ошего элюирующего средства.

Также используют данный способ для очистк.ч обогащенной F-HA-фрак- ции, чтобы удалить токсин pertussis, который она может содержать, причем этот последний удерживается афсЬин

05

оо со

см

to

мым носителем. Отделив полученный иоситепь после введения в контакт с ..материалом хроматографии раствора, получают очищенный F-HA-pacTBOp.

Исходным очищаемым раствором может быть надосадочная зсидкость культуры бактерий рода Bordetella или частично очищенный раствор токсина pertussis или F-HA.

Для очистки токсина pertussis на аффинном носителе адсорбционной хро- Иатографией используют исходный раствор, рН которого доведено до значения 6-8, предпочтительно 7. Количество используемого носителя адсорбционной хроматографии зависит от начального объема надосадочной жидкости и/или от концентрации токсина pertussis в культуральпой среде 20 или во фракции, используемой в качестве исходного продукта. Контакт осуществляется в ванне или в колонке

1600633

ра, содержащего 1 мг/мл асиалофету- ина, 0,1 М NaHOO и 0,5 М NaCl.

Смесь оставляют реагировать при в течение ночи при мягком перемешивании. К смеси добавляют 125 мл 5М раствора этаноламина, рН 8,0. После, инкубации при комнатной температуре в течение 4 ч гель последовательно промывают 500 мл 0,1 М буфера на основе ацетата натрия, рН 4,0, содержащего Ш NaCL, затем 500 мл 50 t трис-НС1-буфера, рН 7,5, содержащего Ш NaCl. Этот цикл промывки повторяют три раза.

Гель затем промывают 3 раза по 500 мл 50 мМ трис-НС1-буфера, рН7,5, в присутствии консерванта, такого как мертиолят, с концентрацией 1/10000 (об.ч.).

Гель Сефарозы - АЕ, соединенный с асиалофетуином, хранят при в буфере, таком как 50 мМ трис-НС1-бу- фер, рН 7,5, в присутствии консерван15

при 2-30°С.

Дпя элюирования токсина pertussis, 25 та, например мертиолята. фиксированного на аффинном носителе Используемый в качестве лиганда в можно использовать, например, буфер- ннй раствор, содержащий в достаточной концентрации соли и/или классические

30

хаотропные агенты, например хлорид кагния или карбонатный буфер, имеющий молярность более 25 мМ и рН порядка 8,3-11,6.

адсорбционной хроматографии асиало- фетуин получают следуюгшм образом. Водный раствор фетуина (фетуин типа III, Сигма) гидролизуют с помощью 0,05 н. «2504 в течение 1 ч - при . После гидролиза раствор диешизуют несколькими объемами дистиллированной воды в течение 24 ч при + , чтобы удалить свободные сиаловые кислоты. Раствор асиалофе- туина может быть концентрирован путем ультрафильтрации с помошью мембран, порог разделения которых равен 10000.

Способ иллюстируется следующими примерами.

Пример 1. Очистка токсина pertussis путем адсорбционной хроматографии на сефарозе 4В-асиапофетуине. ,40

а). Адсорбция токсина pertussis

на геле.

Обогащенную токсином pertussis фракцию, полученную после центрифугирования и концентрирования бакте- 45 риальной суспензии Bordetella pertussis (I фаза), культивированной в ферментере на 30 л, пропускают через хроматографическую колонку диаметром 4 см, содержащую 12П мл носите- о

ля Сефароза-4В, соединенного с асиалофетуином, с расходом 6 мп/см /ч. Сефарозу-4В соединяют с асиалофетуином следующим образом. 30 г активированной ССТ.г сефарозы 4В (Phar- macia) подвергают набуханию в 6 л мМ НС1 в течение около 15 мин. Гель затем промывают .3 раза по 6 л 1 мК НС1. К гелю Добавляют 400 мл раствота, например мертиолята. Используемый в качестве лиганда в

адсорбционной хроматографии асиало- фетуин получают следуюгшм образом. Водный раствор фетуина (фетуин типа III, Сигма) гидролизуют с помощью 0,05 н. «2504 в течение 1 ч - при . После гидролиза раствор диешизуют несколькими объемами дистиллированной воды в течение 24 ч при + , чтобы удалить свободные сиаловые кислоты. Раствор асиалофе- туина может быть концентрирован путем ультрафильтрации с помошью мембран, порог разделения которых равен 10000.

Удаление сиаловых кислот контролируется специфическим колориметрическим определением сиаловых кислот белковой фракции до и после гидролиза.

б). Элюирование токсина.

Гель промывают двумя объемами колонки 50 мМ трис-НС1-буфера, ,5 т.е. вплоть до полного исчезновения УФ-поглошения при 278 им, затем одним объемом колонки 50 мМ трис-НС1- буфера, рН 7,5, содержащего 1 М NaCl Токсин pertussis элюируют 400 мл 100 мМ карбонатного буфера, рН 9,6.

Измеряют оптическую плотность и гемагглютинатную активность фракций coбиpae ыx на выходе из колонны.

Содержапше действующее начало фракции, т.е. обладающие.сильной ге

магглютинатной, не ингибируемой холе- стеролом активностью, объединяют,

Токсин pertussis затем осаждают на сульфате аммония с конечной концентрацией, соответствующей 70%-ному насыщению,

Таким образом, очищенный токсин pertussis вызывает сильный лимфоцитов и яел:ает восприимчивыми (сенсибилизирует) мышей CFW к гиста- мину в дозе 0,04 мкг/мышь. Способность токсина pertussis к образованию кластеров на клетках СНО характеризуется удельной активностью порядка 65000-260000, CPU/мкг.

Результаты физико-химических анализов и биологических активностей (колориметрически определяют возможное содержание загрязнений, ДНК, ДНК сахараJ определяют содержание эндотоксина, проведение электрофореза в среде SDS или в кислой среде и т.д.) подтверждают гомогенность готового препарата, включающего очищенное дей- ствующее начало.

Анализы на содержание токсина pertussis в начальной культуральной над- осадочной жидкости и в конечном осадке показывают выход после очистки выше 90%.

Пример 2. Очистка токсина pertussis путем адсорбированной хро- матогр афии на сферосил-ОЕАЕ-декстран- асиалофетуине.

а). Адсорбция токсина на геле адсорбционной хроматографии.

рН фракции, полученной после центрифугирования и концентрирования су с- пензии Bordetella pertussis (фаза 1)

доводят до 7 путем добавления 5 н. раствора соляной кислоты. Фракцию пропускают через колонку диаметром 2 см, содержащую 60 мл носителя Сфе- росил-ВЕАЕ-декстран, соединенного с асиалофетуином, с расходом 60 мп/см /ч.

Сферосил-ВЕАЕ-декстран (носитель, образованный шариками диоксида кремния ХОС 005, покрытыми минимумом сшитого DEAE-декстрана) соединяют с асиалофетуином следуюпим образом.

Сферосил-ВЕАЕ-декстран подвергают осторожному окислению, чтобы получить альдегидные функции, способные реагировать с а1иногруппами лиганда. Асиалофетуин в виде раствора с концентрацией 4 мг/мл в ЮмМ фосфатном буфере, рН 8,0,вводят в

контакт с гелем в течение 15 ч при комнатной температуре. Гбль затем промывают следующими растворами: 10 Ш фосфатный буфер, рН 8,0, 20 г/л гликоколь, 0,17 мМ NaCl , 0,05 М цитрат натрия, рН 2,8, i н. HCi;

О

б). Элюирование токсина pertus10

5

0

5

0

5

sis.

Гель промывают 120 мл 50 мМ трис- -НС1-буфера, рН 7,5, затем 70 мл 50 мМ трис НС1-буфера, содержащего 1М NaCl. Токсин pertussis злюи- 15 руют 50 мМ трис-НС1-буфером, рН 7,5, содержащим 4М MgCl. Измеряют оптическую плотность при 288 нм и гемаг- глютинантную активность собранных на выходе из колонки фракций. Содержаще 20 действующее начало фракции, т.е. обладающие повышенной гемагглютинант- ной активностью, не ингибируемой хо- лестеролом, объединяют.

Полученную смесь обессоливают путем фильтрации через гель в колонне с Сефадексом С-25 { 7,5 i 45 см, Pharmacia) , уравновешенным с буфером 50 мМ трис-НС1, рН 7,5. Элюирование осуществляют с .помощью того же самого буфера.

Измеряют оптическую плотность при 278 нм и гемагглютинантную активность фракций, собранных на выходе из колонки. Содержащие токсин pertussis фракции, т.е. обладающие повышенной гемагглютинантной активностью, объ- .единяют.

Действуютее начало осаждают на сульфате аммония путем медленного добавления при перемепивании Д7 r{NFg) ЗОд на 100 мл раствора. Анализ биологических и физико-химических свойств показывает, что полученный продукт представляет собой высокоочитенное действующее начало.

Пример 3. Удаление следов токсина pertussis из обогащенной F-HA-фракции.

Способы очистки F-HA включают стадию десорбции F-HA из хроматографи- ческого носителя, например оксиапати- та, с помощью 100 фосфатного буфера, рН 7,0, содержащего 0,5 М NaCl.

Измеряют оптическую плотность при 278 нм и гемагглютинантную активность фракций, собираемых на выходе из колонки с оксиапатитом. Фракции, содержащие F-HAj т.е. обладающие по- вьш1енной гемагглютинантной активно0

5

стью и ингибируекые {слестероломз объединяют,

С целью удаления возможно кмек1- щихся следов токсина pertussis смесь фракций, содержащих F-fIA, пропускают через колонку с сефароза 4В-асиало- фетуином. F-HA элюируют непосредственно, тогда как возможные следа: токсина удерживаются к колонке

F-HA затем осаждают сульфатом аммония путем добавлегл-ш медленно и при перемешивании 47 г (Шд)304 на 100 мл раствора.

Таким образом, очиа енный F-HA не вызывает ни лимфоцитоза, нн восприимивости к гистамину в дозе 100 мкг/Мз1шь. ри концентради 100. . F-HA е вызывает мо;сифик.ации в. клеточом слое, образованном клетками яичника хомяка, т.е. отсутствует образование клеточных скоплений (кластеров) , характерных для наличия токсина {pertussis. Его удельная гемаг- глютинантная активность, измеренная на эритроцитах гусей, порядка 250000- 500000 ед, НА/мг щ)отеи:на. Эта активность полностью ингибируется холе- стеролом.

Пример 4. Сравнительное изучение способности токсина pertussis на носителях адсорбционной хроматографии на основе фетуина и асиалофетуина.

Гель для адсорбционной хроматогра- 4ми получают путем иммобилизации аси- алофетуина на активированной CNBt (Pharmacia) сефарозе-4В согласно способу, описанному в примере 1 ,

5

0

Параллельно аналогичным образом получают гель для адсорбционной хроматографии с фетуином, .

Фиксацию фетуина и фиксацию асиалофетуина осуществляют в идентичных экспериментальных условиях для получения на гелях плотностей сравниваемых лигандов.

Каждый эксперимент реализуют параллельно на двух типах носителей, вводят их в контакт с одним и тем же объемом культуральной надосадочной жидкости, содержащей токсин pertussis. Элюирйванное количество токсина pertussis определяют по анализу протеина и иммуноферментативным методом (ELISA).

Проводят сравнительное изучение пригодности шэлуче11;яых гелей. Относительная емкость геля, содержащего фетуин, составляет 79% ст емкоСти геля, содержащего асиалофетуин.

25 Формула изобретения

1.Способ очистки белкового токсина бактерий Bordetella pertussis с помощью аффинной хроматографии, отлич ающкйся тем, что, с цепью повышения эффективности процесса и степени чистоты .выделяемого токсина, используют аффинный сорбент, содержащий стационарный лиганд - десиапированный гликопротеин.

2.Способ поп. ,oтличaю- щ и и с я тем, что используют аффинный сорбент, содержащий в качестве десиалированного гликопротеина асиалофетуин или аспалогаптоглобин. .

Изобретение относится к технической биохимии, в частности к препаративному выделению белковых антигенов бактерий рода Bordetella pertus- sis, и может быть использовано в г-ккробиологии, медицине и иммунологии . Целью изобретения является уве- лз-1чение емкости аффинных сорбентов с одновременным повьппением степени чистоты Еыдапяемых антигенов. Сначала проводят мягкий гидролиз фату- нка или гаптоглобина с получением десяаттлрованньгх производных, которые фиксируют на водонерастворимом носителе (органическом или неорганическом) . Культуральную жидкость бактерий Eordetella pertussis сорбируют на a.-jKbHHHOM сорбенте при рН 6-8, а десорбцию осуществляют либо буфер- раствором, содержащим хлористый натрий, либо хаотропными агентами, либо карбонатным буфером с рН ,8,3- 1 5 6 .. i ч . п. ф-лы. (П