Способ получения антибиотика 76- @ Советский патент 1986 года по МПК C12N1/10 

Изобретение относится к способам по.пучения антибиотиков. Целью изобретения является способ создания высокоэффективного антикокцидиоидозного препарата, Используемьш микроорганизм принад лежит к роду Actinomadura, штамм Sp. 76-Г1 и способен продуцировать антибиотик 76-11, Штамм Sp 76-11 хранится в Институте ферментационных исследований Ведомства по промышленной науке и технике Министерства меж дународной торговли и промышленности (FERM), Штамму присвоен номер FERM ВР-83. Характеристики штамма Sp 76-11 н различных культуральных средах наблюдают через 20-30 дней после инокуляции:oL-Арабиноза хороший рост D-Ксилоза- D-Глюкоза- D-ФруктозаСахароза L-Инозит рост есть р -Рамноза хороший рост Рафиноза рост есть Маннит очень хороший Штамм SP 76-It может быть охарак теризован следующими признаками. Морфологические признаки, SP 76-lT, как правило, не образу воздушньй мицелий, но иногда образу его по прошествии длительного перио да культивации. Субстратный мицелий является изогнутым, и в последний период культивации делится с образо ванием эллиптических спор, Мицелий грамположительньй и кислотостойкий. Рост на различных средах, Sp.76-11 не растет или плохо рас тет на различных агарах, но агар с овсяной мукой и агар с дрожжевым экстрактом и солодовым экстрактом я ляются для него хорошей культуральной средой. Штамм лучше растет на агаре с ов сяной мукой и образует голубоватоиндигоидный, нерастворимый в воде пигмент в клетках по прошествии 34 недель культивации. Физиологические характеристики. Штамм хорошо растет при 33-37С, слегка разжижает желатин, свертывае и пептонизирует снятое молоко и не образует меланинового пигмента. Использование Сахаров. Штамм хорошо использует ,арабинозу, D-ксилозу, D-глюкозу, D-фруктозу, сахарозу, -инозит,с -рамнозу. рафинозу и маннит на агаре Придхзма и Готлиба в качестве культуральной среды, к которому добавлено 0,1% дрожжевого экстракта. После проведения культивирования на жидкой среде культуральный бульон центрифугируют для отделения клеток от бульона, Полученньй таким путем антибиотик 76-11 может быть выделен из культуральной среды любым общепринятым методом, который обычно используется для вьщеления метаболита. Например, можно применить метод, использукщий различие в растворимости между антибиотиком 76-11 и примесью, или метод, использующий адсорбционное сродство между ними, или их комбинации. Выработанный антибиотик 76-11 присутствует как в культуральном бульоне, так и в клетках, и может быть экстрагирован из культурапьного бульона с использованием этил- или бутилацетатов, хлороформа, бутанола и т,п., в зависимости от их растворимости. Клетки экстрагируют водным ацетоном или водным метанолом, органический растворитель отгоняют при пониженном давлении, и полученный таким путем водный раствор экстраги-. руют этилацетатом и т.п. Экстрагированные растворы комбинируют и конг:: центрируют с получением сьфого экстракта антибиотика 76-П. Поскольку сьфой экстракт содержит большое количество примесей, его подвергают адсорбционной хроматографии с использованием силикагеля, окиси алюминия и т.п., а затем очищают. Например, сырой экстракт, растворенный в небольшом количестве бензола, вводят в колонку с силикагелем, предварительно кондиционированную бензолом, Элюирование проводят с использованием бензола, а затем смесью растворителей бензол - этилацетат, в которой содержание этилацетата постепенно возрастает. Элюат фракционируют с применением коллектора фракций. Собирают фракции, проявляющие биологическую активность, и концентрируют их с получением очищенного порошка. Для дальнейшей очистки повторяют аналогичную процедуру хроматографии на силикагеле. Послегдующую очистку проводят с применением преперативной тонкослойной хроматографии, если это необходимо. Концентрирование при пониженном давлении дает очищенный продукт, который затем растворяют в небольшом количестве метанола и охлаж дают, причем антибиотик 76-11 выделяется в виде бесцветных кристаллов. Кристаллы отделяют фильтрованием и сушат с получением чистого антибиоти ка 76-11. Полученный таким путем антибиотик 76-11 характеризуется следующими физико-химическими и биологическими свойствами. Элементный анализ. Свободная кислота, %: С 62,61; Н 8,27; N 0. Натриевая соль, %: С 60,57; . Н 8,04; N 0. Мол. масса: 843 (измерено методом титрования); 873 (измерено FD-массспектральным методом). Т. пл.: свободная кислота 108112°С; натриевая соль 210-212с (с разл.). Удельное вращение: +36,6°(с 0,382 в хлороформном растворе). Спектр УФ-поглощения. Полосы максимального -поглощения в МеОН и НС1МеОН: „„, 217 мкм (Е |J; 303): 262 мкм (Е,); 301 мкм (Е, 68) . В щелочном МеОН: Х мако 260 мкм (); 308 мкм ()... Основные специфические полосы ИК-поглощения (таблетка КВг). Свободная кислота: 3450, 2960, 1720, 1640, 1610, 1578, 1446, 1380, 1315,1292, 1250, 1209, 1151, 1100, 1035, 975, 940. Натриевая соль: 3390, 2960, 1718, 1640, 1609, 1578, 1450, 1380, 1340, 1316,1250, 1197, 1152, 1108, 1092, 1060, 1040, 1002, 980, 930. . Растворимость в растворителях. Легкорастворим в бензоле, хлорофо ме, этилацетате и ацетоне, растворим в метаноле, этаноле и диметилформами де, слаборастворим в воде и гексане. Реакции окрашивания. Положительно - на калийперманганатную реакцию, но отрицательно на периодатнокислотно-бензидиновую реакцию. Щелочность, кислотность или нейтральность: кислотное вещество, рКа 4, (в 66,7%-ном диоксане). Цвет: бесцветные кристаллы. Антимикробная активность в виде минимальной концентрации для подавления роста различных микроорганизмов на бульоно-агаровой культуральной среде приведена в таблице. Минимальная конПодопытныецентрация для помикроорганизмыдавления роста, мкг/мп ч. Staphylococcus aureus 209 Р 0,4 Staphylococcus aureus (multi resistant)0,4 Bacillus subtilis PC 1219 0,4 Bacillus subtilis H 170,4 Bacillus subtilis m 45 (rec-) 0,4 Mycobacterium 0,4 Sp 6070,4 Mycobacterium phlei0,4 Mycobacterium avium0,4 Escherichia coli 100 Salmonella typhimurium 100 Действие на опухолевые клетки. Антибиотик 76-11 проявляет индукцию дифференцирования в отношении клеток лейкемии Френда и клеток миелоидной лейкемии в концентрации 1100 мкм/мл. Токсичность для мышей. Абдоминальное введение 50, 100 и 200 мг/кг антибиотика 76- I в виде КМЦ-суспензии показало отсутствие токсичности для мышей.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА 76-11, предусматривающий культивирование штамма Actinomadura Sp 76-11 FERM ВР 83 при аэрации на водной питательной среде, содержащей 3% овсяной муки, 1,5% глицерина и 0,5% мясного экстракта, удаление выращенных клеток, выделение антибиотика из культуральной жидкости зтилацетатом с последующей очисткой его методом хроматографии на силикагеле с элюцией антибиотика смесью, состоящей из 50% бензола и 50% этилацетата.