Способ спектрального определения активности пептидаз Советский патент 1989 года по МПК C12Q1/00 G01N33/52 

1

Изобретение относится к биохимии, конкретнее к способам определения ферментов, гидролизутощих амидные связи, и может быть использовано в медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве, пищевой, гидролизной, фото- и микробиологической промышленности для анализа пептидаз.

Целью изобретения является повышение точности и чувствительности определения пептидазной активности ферментов.

На чертеже приведен график определения чувствительности пептидаз.

Целесообразно использовать метод флюоресценции для количественной регистрации продукта ферментативной реакции - 1-нафтиламин-5-сульфокис- лоты, образующейся при гидролизе

субстратов-1-(аминоацил)-аминонаф- талин-5-сульфокислот.

Для проведения анализа согласно способу целесообразно использовать . для возбуждения флюоресценции источник длиной волны нм, а продукт реакции - 1-нафтиламин-5-сульфокис- лоту - определять при - 505 нм, при этом флюоресценция субстрата ( Ago,5-340 нм, нм) полностью исключается. К реакционной смеси, содержащей субстрат, буферные добавки, вещества, необходимые для нормальной работы фермента (например, комплексоны, ионы магния и пр.), добавляют известное количество определяемого фермента, смесь инкубируют при постоянной температуре, наблюдая за увеличением флюоресценции при

4 О

0:) err

505 нм. По интенсивности роста флюоресценции судят о количестве фермента. Йожно также проводить измерен ния по конечной точке, определяя флюоресценцию однократно по истечении определенного промежутка времени.

Пример 1. Определение активности трипсина по флюоресценции 1-нафтиламин-5-сульфокислоты.

2 мл реакционной смеси, содержащей М 1-(Н-карбобензоксиарги- нил)-аминанафталин-5-сульфокислоты в 0,05 М трис-НС буфере, рН 8,2, помещают в кювету спектрофлюориметра добавляют 10 мкл исследуемого фермента и проводят измерение флюорес ценции при 505 нм, -1 ° отношению прироста интенсивности фгао О1)есценции к временному интервалу судят о количестве фермента, используя в качестве эталона стандартную

кривую, снятую в тех же условиях при известных концентрациях стандартного раствора трипсина.

П р и м е р 2. Определение активного тромбина по флюоресценции 1-аминонафталин-5-сульфокислоты. 2 мл 2«10 М раствора тозш1ГЛИщш-1-про- лил-1-ар гинил-аминон афталин-5-суль- фокислоты в 0,05 М трис-НС1 буфере, рН 8,2 помещают в кювету спектрофлюориметра, добавляют 10 мкл исследуемого образца тромбина, перемешивают и регистрируют рост интенсивности флюоресценции при 505 нм (ВОЭБ 360 нм) во времени. Активность фер мента определяют по тангенсу наклона касательной и кривой зависимости интенсивности флюоресценции от времени

Аналогичным образом может быть проведен анализ других пептидаз, приведенных в таблице.

Изобретение относится к анализу пептидаз по флюоресценции продуктов реакции. Цель изобретения - повышение точности и чувствительности определения пептидазной активности ферментов. В качестве субстратов предложено использовать 1-аминоациламинонафталин-5-сульфокислоты. Продукт ферментативной реакции - 1-аминонафталин-5-сульфокислоту определяют по флюоресценции /98л_возб 360 нм,98л*_фл 505 нм/ непосредственно в реакционной смеси. Флюоресценция субстрата /λ_возб 340 нм,λ_фл 420 нм/ не мешает определению. 1 з.п.ф-лы,1 табл.

Проназа

0,05 трис-НС, рН 7,6

lOfHl

Трипсин Тозил

-gly-Pro-Arg-NH

(оТо

Как в примере 1

Папайи

Тромбин

Комплекс

протеаз

сыворотки

крови

Комплекс протеаз

Как в примере 1

11

25

600

10

25

600

25 37

37 25

600 1800

35 120

60 2

Как видно из чертежа, максимумы чувствительности определения приходятся на длину волны эмиссии 505 нм, при возбуждении 360 нм отклонение от максимумов понижает чувствительность определения.

Формула

изобретени

0,6

0.1

0.2

300

400

фокислоты с количественной регистрацией изменения спектральных характеристик реакционной смеси, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и чувствительности определения пептидазной активности ферментов, количественную регистрацию проводят путем измерения интенсивности флюоресценции.

500

600

X,w/H