5-(Тозилглицил-L-пролил-L-аргинил)аминонафталин-1-метилсульфонамид в качестве АНСА - субстрата для определения тромбина Советский патент 1993 года по МПК C07K5/06 C12N9/74 

сл

с

Использование: в биоорганической химии в качестве АНСА-субстрата для определения тромбина. Сущность изобретения: 5-(тозилглицил-1 -пролил-1 -ар- гинип)-аминонафталин-1-метилсульфона- мид. Реагент I: тозилглицил-1 -лролин. Реагент II: дигидрохлорид 5-аргиниламинонаф- талин-1-метилсульфонамида. Процесс ведут в диметилформэмиде в присутствии 1-гид- роксибензотриазола и дициклогексилкар- бодиимида при охлаждении, с последующей нейтрализацией триэтиламином, разбавлением водой,экстракцией, упариванием. Выход 82%. C3iH4oNG07S2, т.пл.184-195°С. 20-8.7(.СНзОН), Лпах № (.СНзОН), Лпах254нм.

Изобретение относится к области биоорганической химии, а именно к новому пептидильному производному аминонаф- талинсульфамидов. конкретно к 5-{тозилгли- цил-1 -пролил-1 -аргинил)аминонафталин-1 -метилсульфонамиду формулы

ToS-Gly-PrO-Arg-NH

&§

S02NHCH ,

который может быть использован в химии для получения искусственного хромогенно- го субстрата и в биохимии для определения тромбина методом АНСА-анэлиза.

Целью изобретения является поиск в ряду замещенных пептидильных производных аминонафталинсульфамидов новых соединений, позволяющих при использовании их в качестве АНСА-субстра- тов определить тромбин.

Поставленная цель достигается новым 5-тозилглицил-1 -пролил-Ь-аргинилэминон- афталин-1-метилсульфонамидом в качестве АНСА-субстрата.

Изобретение иллюстрируется примерами.

Пример 1. Дигидрохлорид 5-аргини- ламинонафталин-1-метилсульфонамида.

3,3 г (10 ммоль) Г трет-бутилоксикарбо- нил аргинина (моногидрат) растворяют в 10 мл сухого ДМФА, заливают 30 мл сухого

00

ю сл

00

о

О

толуола. Раствор упаривают при пониженном давлении до 10 мл, охлаждают до 10°С, добавляют 0,8 м (10 ммоль) сухого пиридина и 2,7 мл (15 ммоль) ди-трет-бутилпирокарбо- ната. Перемешивают 1 ч, добавляют порциями в течение 40 мин 2,6 г (11 ммоль) 5-аминонафталин-1-метилсульфонамида. Перемешивают 3 ч при 20°С, после чего добавляют 1,3 мл (7 ммоль) ди-трет-бутилпи- рокарбоната и перемешивают еще 16 ч при 20°С. Реакционную смесь выливают в 100 мл сухого эфира, перемешивают 10 мин, эфир декантируют, остаток заливают 50 мл смеси трифторуксусная кислота - хлористый метилен (1:1) и перемешивают 2 ч при 20°С, концентрируют до 10 мл и заливают 100 мл сухого эфира. Образовавшийся продукт отсасывают, сушат, растворяют в 20 мл воды, отфильтровывают непрореагировавший аминонафталинсульфамид. Водный раствор экстрагируют 80 мл н-бутанола, органический слой отделяют, промывают 5%- ным МаНСОздо рН 7-8 (водного слоя), затем водой (2x10 мл), концентрируют до 15 мл и насыщают сухим HCI. Растворитель упаривают, остаток растирают с эфиром, образовавшийся осадок отсасывают и сушат. Получают 4,3 г (93%) целевого продукта, т.пл. 181-190°С, ,44 (БЦВ 412), l«lD20+7,9 (CI; СНзОН) ПМР (ДМСО):

Найдено, %: С 43,58; Н 5,75; N 18,32; 57,03; CI 15,56.

С17Н26Мб50зС12.

Вычислено, %: С 43,87; Н 5,63; N 18,06; S6.89: CI 15,24.

Пример 2. 5-(тоэилглицил- -пролил- 1 -аргинил)аминонафталин-1-метилсульфо- намид.

0,33 г (1 ммоль) тозилглицил-1 -пролина, 0,14 г (1 ммоль) 1-гидроксибензотриазола и 0,27 г (1,3 ммоль) дициклогексилкарбодиими- да смешивают, добавляют 7 мл охлажденного до -20°С сухого диметилформамида, перемешивают на ледяной бане 0,5 ч. Растворяют 0,47 г (1 ммоль) дигидрохлорида 5-эргиниламинонафтэлин-1-метилсульфон- амида, полученного в прим. 1, в 4 мл диметилформамида, раствор добавляют в реакционную смесь, перемешивают на ледяной бане еще 0,5 ч. Добавляют триэтиламин до рН 7, перемешивают еще 16 ч. позволяя реакционной смеси нагреться до 20°С, отфильтровывают выпавший осадок; реакционную смесь выливают в 100 мл воды. Полученную суспензию экстрагируют четырежды по 10 мл смеси этилацетат-бутанол (1:1). органический слой отделяют и промывают трижды по 5 мт 5%-ным аодным ПаНСО:. 10%-иым KHSCu и подои РЖ тпо

5

ритель аривают, оставшийся маслообраа ный остаток растирают с сухим эфиром, отфильтровывают, промывают эфиром, сушат. Получают 0,57 г (82%) целевого продукта, т.пл, 184-195°С. РЮ,46(БУВ 412). |«|р20-- 8,7 (CI: СНзОН).

Найдено. %: С 55,21; Н 6,13: N 12.18; S9.71.

CaiH4oNe07S2.

Вычислено, %: С 55,34; Н 5.99; N 12,49: 59,53.

ПМР (ДМСО) Tos- Gly -Pro-ArgHN

foToi

SOjNHCHj

1,74 (м, 4Н, 2СН2), 1,83 (м, 4Н, 2СН2), 2,28 (с, ЗН, СНз), 3.25 (м, 2Н. СН2), 3,39 (м, 2Н. СН2).

0 3,61(д,2Н,СН2),4,13(м, 1Н,СН),4.46(м,1Н. СН), 7,28 (g, 2H. 2СН-ароматические), 7,64 (q, 2Н, 2СН-ароматические). 5,30-8,72 (14Н, 6Н- нафталин. 8H-NH).

П р и м е р 3. Анализ тромбина.

5 к 0,3 мл субстратной смеси, содержащей по 3,5 О.Е. ( нм)/мл: 5-(гхГ-тозилг- лицил-1 -пролил-1 -аргинил)аминонафталин -1-(н-бутил)сульфонамида и -метилсульфо- намида, 0,1 О.Е. (А 340 нм) данзилвалина

0 (внутренний стандарт) в 0,05 М трис-HCI буфера рН 7,4 10 ,икл водного раствора тромбина, перемешивают, инициируют 2 мин при 37°С, добавляют СНзСООН до рН 4,3, перемешивают; добавляют 0,5 мл смеси эти5 лацетат-гексан (2:1), опять перемешивают, верхний слой отделяют, высушивают,остаток растворяют в 0,05 М ацетата аммония в 35% ацетонитриле, хроматографируют на колонке Zorbax С-8 (4,6x250 мм) при 40°С и

0 скорости потока 1 мл/мин и определяют 5-аминонафталин-1-сульфонамиды по максимуму поглощение при Я 254 нм. При завершении ферментативной реакции пик исходного субстрата исчезает (99%) и одновременно появляются пики продуктов ферментативного гидролиза 5-аминонафта- лин-1-(н-бутил)-сульфонамида и -1-метил- сульфонамида. Времена удерживания 8,3 мин и 2,3 мин, соответственно.

0 в таблице представлены результаты эксперимента, подтверждающие линейную зависимость определяемых количеств отщепленного амин она фта ли н-( мети л)сульфамида от количества тромбина 5

Исходный раствор фермой гя П 26 мг/мл бычьего тромбина. Времч инкубации 12

5

мин, температура 37°С. В поглощению нм

Д ТРКЦИЯ ПО

т БОК-L-Arg-OH Н20

93%

2HCI H-L-Arg-AHCA(Me)

Tos-Gly-L-Pro-OH, 1-оксибензотриазол, дициклогексилкарбодиимид, триэтиламин

82%

Tos-Gly-L-Pro-L-Arg-AHCA (Me)

Ниже представлена схема синтеза Для ТСХ использованы пластинки Silufol UV-254, спектры ПМР сняты на спектрофотометре Hitachi P-22 (90 МГц, Япония), углы вращения измерены на поляриметре фирмы Бекман, ВЭЖХ - на хроматографе фирмы Дю Пон (США). Формула изобретения 5-(Тозилглицил-1 -пролил-1 -аргинил)ами- нонафталин-1-метилсульфонамид формулы

(т.БОК)20,

АНСА(Ме)

HCI

Tos-Gly-pro-Arg-NH

ОЮ

S02NHCH

ъ

в качестве АНСА-субстрата для определе- 10 ния тромбина.