5-(N @ -сукцинил-аланил-аланил-пролил-фенилаланил)-аминонафталин-I-(N-пропил) сульфамид в качестве АНСА-субстрата для определения химотрипсина и 5-(N @ -бензилоксикарбонил-аланил-аланил-пролил-фенилаланил)-аминонафталин-I-(N-пропил)сульфамид в качестве полупродукта для его получения Советский патент 1992 года по МПК C07K5/10 C12N9/76 

(21)4872552/04 (22) 20.07.90 (46)23.10.92. Бюл. №39

(71)Институт биохимии Литовской АН и Институт молекулярной генетики АН СССР

(72)Р А.Янчене. А.И Палайма, А.А.Недоспа- сов и Р.И.Матуляускене

(73)Институт биохимии Литовской АН

(56) Methods in Enzymology vol. 80. Proteolytic Enzymes, Part. C, N - J. London, 1981, ed. by L.Loramt, R. Lottenberg и gp, Assay of coagulation Proteases using Peptide Chromogenie and Flurogenie Substrates, page 341-361.

Недоспасов А.А., Незавибатько В,Н. и др. Возможный подход к анализу смесей протеаз известия АН СССР серия биоло- гич, 1989. т. 15, № 1,с. 128. (54) Б-СЧь-СУКЦИ НИЛ-АЛ АН ИЛ-АЛ АНИ Л- ПРОЛИЛ-ФЕНИЛАЛАНИЛ)-АМИНОНАФ- ТАЛИН-1-(М-ПРОПИЛ)СУЛЬФАМИД В КАЧЕСТВЕ АНСА-СУБСТРАТА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХИМОТРИПСИНА И 5-(Nct -БЕНЗИЛОКСИКАРБОНИЛ-АЛАНИЛ-АЛА- НИЛ-ПРОЛИЛ-ФЕНИЛАЛАНИЛ)-АМИНО НАФТАЛИН-1-(М-ПРОПИЛ}СУЛЬФАМИДВ КАЧЕСТВЕ ПОЛУПРОДУКТА ДЛЯ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ

Изобретение относится к новым химическим соединениям, а именно 5-(М -сукци- нил-А1э-А1а-Рго-Р11е)-аминонафталин-1-(М- пропил)сульфамиду формулы la Я -Ala-Ala-PrO-Phe-Hti

ts

SOjNHCjH7

R Suc(1) R Sue (16)

(57) Использование: в медицинской и биологической химии как АНСА-субстрат для определения химотрипсина. Сущность изобретения: 5-(Мд.-сукцинил-аланил-ала- нил-пролил-фенилаланил)-аминонафталин -1-(М-пропил)сульфамид формулы а:

X-Am-AUl-PPO-Phe-HN-с«сн-с-сн сн

СН С-С-СН С502У НС3Н7

х Sue

и b-(N -бензилоксикарбонил-аланил-аланил- пролил-фенилаланил)-аминонафталин-1 -пропил)сульфамид, 16, (X Z), в качестве полупродукта для получения 1а. Реагент 1: (N -бензилоксикарбонил аланил-аланил- пропил-фенилаланил)аминонафталин-1 -(М-пропил)сульфамид, полученный путем взаимодействия N -бензилоксикарбонил фенилаланина с 5-аминонафталин-1-(М- пропил)сульфамидом, деблокированием полученного продукта, постепенным наращиванием пептидной цепи до соединения 16 и деблокированием последнего. Реагент 2: ангидрид янтарной кислоты. Процесс ведут в смеси ТГФ и ДМФА при 80°С, 1а, 58%,

Сз7Н47Мб50э (aj$ -18,0 (0.5% ДМФА). 16 C/nH NeSOs (a)i5 - 12,47 (1 % ДМФА).

в качестве субстрата для определения химотрипсина и 5-(.-бенэилоксикарбонил- А1а-А1а-Рго-Рпе)-аминонафталин-1 -(N-npo пил)сульфамиду формулы 16 в качестве полупродукта для получения 1а, которые могут найти применение в медицинской и биологической химии.

Известен ряд синтетических хромоген- ных субстратов для определения химотрипсл

С

ч ч

Ј ч

00

со

сина на основе п-нитрознилина, 2-нафтила- мина. и-метокси-2-нафталамина и др. Эти субстраты обычно успешно используют для определения только одного фермента в исследуемой пробе (1).

Описываемое соединение используется в АНСА-анализе.

АНСА-анализ - новый метод анализа смесей протеаз, в том числе как близкой так и различной специфичности. Идея метода состоит в использовании в одном анализе смеси нескольких субстратов, с определением продуктов протеолиза каждого из них.

Для реализации метода в варианте с применением хромотографии предложены хромогениые субстраты с аминонафталин- сульфамидными детектируемыми группами. Наиболее близкими по структуре являются пептидильные производные 5- аминонафталин-1-сульфамидов (2). Например, 5-тозилглицил-пролил-аргинил- аминонафталин-1-(М-пентаметилен)сульфа мид для АНСА-анализа трипсина. Однако трипсин и химотрипсин, являющиеся сери- новыми протеазами. различаются субстратной специфичностью. Указанный пептидильный производный Tos-Gly-Pro- Arg-AHCA, как и другие известные АНСА- субстраты практически не расщепляются химотрипсином. Поэтому они не могут быть использованы в качестве АНСА-субстрата при определении химтрипсина.

Целью изобретения является поиск в ряду замещенных пептидильных производных аминонафталинсульфамидов новых соединений, позволяющих при использовании их в качестве детектируемых групп для АНСА-анализа определить химотрипсин, т.е. увеличить количество анализируемых ферментов методом АНСА-анализа.

Поставленная цель достигается новым б-СМ -сукцинил-аланил-аланил-прол ил-фенил ал анил)-аминонафта лин-1-(М-проп ил) сульфамидом в качестве АНСА-субстрата и использованием нового 5-(М -бензилокси- карбонил-аланил-аланил-пролил-фенилала нил)-аминонафтэлин-1-(М-пропил)сульфа- мида в качестве полупродукта для его получения

Изобретение иллюстрируется примерами (схема синтеза прилагается).

Пример 1.5-{ГЦ,сБензилоксикарбонил- фенилаланил)аминонафталин-1-(М пропил) сульфамид (а). К раствору 2,99 г (0,01 моль) (N -бензилоксикарбонилфенилаланина и 1,4 мл (0,01 моль) триэтиламина в 50 мл абс. тетрагидрофурана (ТГФ) медленно добавляют 1,37 г (0,01 моль) хлорангидрида изобу- тилового эфира муравьиной кислоты при перемешивании при -18°С Реакционную

смесь выдерживают 15 мин. при этой температуре, образуется осадок хлоргидрида триэтиламина, после чего добавляют раствор 2,64 г (0,01 моль) 5-аминонафталин-1-(Мпропил)сульфамида в 20 мл абс. ТГФ. выдерживают 1 ч при -18°С и 2 ч при 20°С. Осадок отфильтровывают, растворитель упаривают досуха, осадок растворяют в эти- лацетате, промывают 1 н. раствором HCI, 5

% раствором NaHCOa и водой, сушат и упаривают досуха. Полученный продукт три раза промывают кипящим эфиром и отфильтровывают, Получают 3,54 г (выход 65 %) соединения (a) (Z-Phe-AHCA-Pr)с т. пл.

196-197°С. Rf 0,72 (СНС1з-этилацетат-ме- танол в соотношении 14:7:1 соответственно).

Найдено, %: С 66,4 Н 5,7 S 5,7 N 7.8 CaoHaiNaOsS.

Вычислено, %: 66,0 5,7 5,9 7,7.

Спектр ПМР ( 6, м.д., растворитель ДМСО-de): 0,64 (СНз, т, ЗН), 1,22 (СН2, С1К., 2Н), 2,69 (NCH2, 2H), 3.02 (CHaPh- 2H). 4,59 (СН, Ж), 5,02 (СНа, с, 2Н), 7,2-8,5 (Ар и NH.

17Н), 10,1 (NH, 1H).

Пример 2. 5-(Фенилаланил)амино- нафталин-1-(1Ч-пропил)сульфамида гидробромид (б), 3,5 г (6,4 моль) соединения (а) (Z-Phe-AHCA-Pr) растворяют в 30 мл 3 н.

раствора НВг в уксусной кислоте и перемешивают на магнитной мешалке в течение 2 ч. Реакционную смесь разбавляют абс. эфиром и отфильтровывают выпавший осадок, который на фильтре несколько раз промывают эфиром. Получают 2,85 г (выход 90 %) продукта (б)(Phe-AHCA-Pr НВг) с т. пл. 220- 222°С, Rr 0,67 (бутанол-уксусная кислота- вода в соотношении 4:1:2), («)6° - 24.7 (1 % диметилформамид) (ДМР).

15,9.

Найдено, %: С 54,0 Н 5,3 N 8,4 S 6,2 Вг

0

5

С22Н2бМзОз5Вг.

Вычислено: 53,7 5,3 8,5 6,5 16,2.

Спектр ПМР( д, м.д., растворитель Ь ДМСО de): 0.64 (СНз, т, ЗН), 1,24 (СНа, секс, 2Н), 2,31 (NCH2, 2H), 3,2 (CHaPh, 2H). 4,47 (СН, 1Н), 7,32 (Ар, 5Н), 7,32-8.17 (Ар и NH 7Н), 8,44 (NH2. 2H), 10,48 (NH, 1H).

П р и м е р. 3. 5-{N -t-бутилоксикарбо- нил-пропил-фенилаланил)-аминонафталин- 1-(Ы-пропил)сульфамид(в), 1.53 г (7,1 ммоль) N -t-бутилоксикарбонил-пролина и 0,99 мл (7,1 ммоль) триэтиламина растворяют в 30 мл абс. ТГФ, охладжают до -20°С добавляют при перемешивании 0,68 мл (7.1 ммоль) этилхлорформиата и выдерживают при - 20°С 20 мин. К полученному смешанному ангидриду прибавляют предварительно подготовленный (охлажденный и отфильтрованный) раствор 3,5 г (7.1 ммоль) соединения (6) и 0.99 мл (7.1 ммоль) триэтиламина в 40 мл абс. ТГФ. Реакционную массу перемешивают при температуре -20°С 1 ч и 1 ч при комнатной температуре. Реакционный раствор фильтруют, упаривают досуха, остаток растворяют в этилацетате, промывают последовательно 1 н. раствором HCI, 5 % раствором МаНСОз и насыщенным раствором NaCI, сушат, упаривают, заливают абс. эфиром. Выпавший осадок отфильтровывают. Получают 2,15 г (выход 50 %) соединения (в) с т. пл. 126 130°С. Rf 0,35 (хлороформ- этилацетат-метанол в соотношении 14:7:1),

(«)i5 -26.18(1%. ДМ Г).

Найдено, %: С 63,2 Н 6,5 S 5,2 N 8,9.

Сз2НодМ40б5.

Вычислено, %: 63,1 6.65,39,2.

Спектр ПМР ( д, м.д., растворитель ДМСО de): 0,62 (СНз, т, ЗН), 1,16 (СНз, с, и 4СН2. I4H), 1.64 (2СН2, 4Н), 2,68 (СНаМ, кв.. 2Н). 3,1 (CH2Ph, 2Н), 3,28 (СН2, 2Н), 4,07 (СН, 1Н). 4.82 (СН, Ж), 7,24 (Ар, 6Н), 8,49 (NH.g, 1Н). 10.2 (NH. с. 1Н).

Пример 4. 5-(Пропил-фенилэла- нил)эминонафталин-1-(М-пропил)сульфами да гидрохлорид (г). 1,3 г (2 ммоль) соединения (в) растворяют в 15 мл 3 н. раствора HCI в уксусной кислоте и перемешивают в течение 1 ч. Реакционную смесь разбавляют абс. эфиром и отфильтровывают выпавший осадок, который на фильтре промывают свежим эфиром. Получают 1,09 г (выход количественный) хроматографически однородного вещества. Rt 0.4 (бутанол-уксусная кислота-вода в соотношении 4:1:2).

Пример 5. М -Бензилоксикарбонил- аланил-аланин (д). Раствор 10 г (62 ммоль) аланил-аланина и 11.6 г (109 ммоль) №2СОз в 75 мл воды охлаждают до 0°С и при энергичном перемешивании добавляют 13,64 г (80 ммоль) карбобензоксихлорида. Реакционная смесь в течение всего времени должна оставаться слабощелочной. После 4-часовой выдержки раствор осторожно подкисляют до рН 2 конц. HCI. Осадок отфильтровывают, высушивают, растворяют в этилацетате, промывают 1 н, раствором HCI. водой и экстрагируют раствором №2СОз Экстракт подкисляют конц. HCI, выпавший осадок отфильтровывают и высушивают. Получают 11,6 г (выход 68 %) соединения (д) с т. пл. 147-148°С, Rf 0,47 (СНС1з-этилацетат-метанол в соотношении

14:7:1), (а$ - -1.8 (1 % ДМР).

Спектр ПМР ( д. мд., растворитель ДМСО de): 1.37 (СНз. 2g, 6H). 4,27 (две СН, 2Н). 5.17 (СН2. с 2Н). 7.47 (Ар. с. 5Н), 8.22 (NH 2H)

Пример 6. 5-(Ы -Бензилоксикар6о- нил-аланил-аланип-пролил-фенилаланил )ами- нонафталин-1-(М-пропил)сульфамид (16). 0,65 г (2,2 ммоль) соединения (д) раство5 ряют в 15 мл абс, ДМР, охлаждают до-10°С. добавляют последовательно при перемешивании 0,31 г (2,4 ммоль) оксибензтриазолэ, 0,59 г (2,4 ммоль) IM.N -дициклогексилкарбо- диимида (ДЦК) и выдерживают при -10°С

0 30 мин. Затем к реакционной смеси прибавляют предварительно охлажденный раствор 1.21 г (2,2 ммоль) соединения (в) в 10 мл абс. ДМР. Реакционную массу перемешивают 30 мин., добавляют 0,3 мл (2,2 ммоль) триэ5 тиламина и оставляют на 24 ч. Смесь отфильтровывают, выливают в 0,5 л Н20, продукт экстрагируют зтилацетатом, экстракт промывают раствором и 5 % ЫаНСОз, 1 н. НС и насыщенным раствором NaCI,

0 высушивают над МдЗОз, упаривают, заливают абс. эфиром. Выпавший осадок отфильтровывают. Получают 0,78 г (выход 43%) соединения (б). Rf 0,47 (хлороформ- этилацетат-метанол в соотношении 14:7:1),

5 («)Ь5 -12.47(1 %. ДМР).

Найдено, %: С 62,26 Н 6,49 S 3,81.

GnH-jgNeSOs.

Вычислено, %: 62,55 6,28 4,07.

Спектр ПМР ( (5, м.д., растворитель

0 ДМСО d6): 0,6 (СНз, т. ЗН), 1.12 (две СНз. 2д перекрываются с ЗСН2, 12Н), 2,64 (МСН2, кв., 2Н), 2,89 (CH2Ph, 2H), 3,36 (NCH2. 2H), 3.98 (СН. 2Н), 4,26 (СН, 1Н), 4,76 (СН, 1Н), 4,93 (СН2, с, 2Н), 7,22 (Ар, ЮН), 7,22-8,21

5 (Ар, NH. 9H). 8.46 (NH. д, 1 Н) 10.03 (NHPh. с, 1Н).

Пример 7. 5-(Аланил-аланил-пропил- фенилаланил)аминонафталин-1-(М-пропил) сульфамида гидробромид (е). 7,2 г (8,7 ммоль)

0 соединения (16)(Z-Ala-Ala-Pro-Phe-AHCA) заливают 90 мл 3 н. раствора НВг в СНзСООН и перемешивают 1 час при комнатной температуре. Затем прибавляют 400 мл абс. эфира, продукт выпадает после охлажде ния. Осадок быстро отфильтровывают, промывают несколько раз эфиром и высушивают над P20s в вакууме. Получают 5.4 г (выход 82 %) хроматографически однородного вещества (е) в виде мелкокристаллического порошка, Rf 0,69 (бутанол-уксусная кислота-Н20 в соотношении 4:1:2).

Пример 8. 5-(,-Сукцинил-аланил- аланил-пролил-фенилаланил)аминонафта- лин-1-(М-пропил)сульфамид (la). 3.5 г (4,8

° ммоль) соединения (е) (Ala-Ala-Pro-Phe- АНСА-Pr НВг) растворяют в смеси 100 мл абс. ТГФ и 5 мл абс. ДМР, прибавляют 0,48 г (4,8 ммоль) ангидрида янтарной кислоты, нагревают при 80°С 2 ч., раствор охлаждают

0

и прибавляют 350 мл абс. эфира. Выпавший кристаллический продукт отфильтровывают и сушат под Pads. Получают 2,1 г (выход 58 %) (la) (Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-AHCA-Pr), Rf - 0,78 (бутанол-уксусная кислота-Н20 в соотношении 4:1:2), (а$° - -18,0 (0,5 % ДМР).

Найдено, %: С 56.37 Н 6.69 S 4,39.

Сз7Н47Мб50э 2Н20.

Вычислено, %: 56,40 6,52 4,07.

Спектр ПМР ( б, м.д., растворитель ДМСО de): 0,69 (СНз, т, ЗН), 0,93-1,42 (две СНз и три СН2, 12Н), 2,44 (ОССН2СН2СО, перекрываются с сигналом растворителя), 2,62-3.23 (СН2, 6Н), 4,23 (СН. ЗН), 4,78 (СН, 1Н). 7,07-8,14 (Ар и NH, 14H), 8,51 (NH, g, 1H),9,9(NH,c, 1H).

Пример 9. Анализ химотрипсина и трипсина. К 0,35 мл субстратной смеси, содержащей по 3,5 О.Е. (А 300 нм)/мл 5- (МоС-тозил-глицил-пролил-аргинил)амино- нафталин-1 -(М-бутил)сульфамида (субстрат трипсина и тромбина) и Suc-Ala-Ala-Pro- Phe-AHCA (la, субстрат химотрипсина), 0,1 0,Е.(А 340 нм)/мл дансилвалина (внутренний стандарт) в 0.05 М трис-HCI буфера рН 7,4 добавляют 10 мкл водного раствора одного или другого фермента (фермент разводят до концентрации, обеспечивающей гидролиз 1 % субстрата в 1 мин), перемешивают, инициируют 2 мин при 37 С, добавляют СНзСООН до рН 4,3, перемешивают, добавляют 0,5 мл смеси этилацетэт, гексан (2:1), перемешивают верхний слой отделяют, высушивают досуха. Остаток растворяют в 0,05 моль ацетата аммония в 35%-ном ацетонитриле, хроматографируют на колонке Zorbax C-18 (4,6 250 мм) при 40°С и скорости потока 1 мл/мин и определяют АНСА до детекции по поглощению при А 254 им.

При использовании тромбина и трипсина на хроматограмме присутствует только пик 5-аминонафталин-1-(М-бутил)сул ьфамида ( 99 %, время удержания 10,60 мин), при

использовании химотрипсина - только пик 5-аминонафталин-1-( рол ил)сул ьфамида ( 99 %, время удержания 6,65 мин).

Таким образом использование предложенного соединения la в качестве субстрата

позволяет качественно определить химот- рипсин и увеличить количество анализируемых ферментов при АНСА-анализе. а использование соединения 16 в качестве полупродукта - получить необходимый целевой продукт la.

Формула изобретения 1. 5-(-сукцинил-аланил-аланил-про- лил-фенилаланил)-амиионафталин-1-(М-пр опил)сульфамид формулы la

25

Suc-Altt-AUx-PrO-PhB-HN .

@

SOjNHCjH-i

в качестве АНСА-субстрата для определения химотрипсина

2. 5-(1Ч бензилоксикарбонил-аланил- аланил-пролил-фенилаланил)-аминонафта лин-1-(Ы-пропил)-сульфамид формулы 16

Z-Alet-Ala-PrO-Phe-HN

@Ф

S02HHC3H7

в качестве полупродукта для получения АНСА-субстрата химотрипсина формулы 1а.