Способ получения сорбента для очистки белков Советский патент 1983 года по МПК B01J20/22 

Изобретение относится к получению сорбентов групповой специфичност для очистки киназ ,дегидрогенаэ/ферме тов обмена нуклеиновыых кислот и фракционирования белков и может быть использовано в энзимологии. Известен способ получения сорбентов групповой специфичности, включающий присоединение лигандаароматического азосоединения,содер жащего реакционно-способные монохлор- или дихлортриаэиноЕые группировки в водной среде в присутствии гидроокисей щелочных металлов при рН выше 8,0 к нецеллюлозному носителю, содержащему гидроксильные или аминогруппы с последую щей промывкой полученного сорбента. В качестве лигандов используют активные красители монохлортриазинового ряда - процион красный НЗВ, процион красны НЕЗВ, процион желтый H5G, процион красный H8BN, цибакрон Голубой и дихлортриази нового ряда - процион красный МХ2В процион голубой МХЗ и процион желтый MXR. В качестве водонерастворимых носителей преимущественно используют агарозу, а реакцию присоединения к ней монохлортриазиновых красителей проводят при рН 9,5 в присутствии 0,05-0,2 NaOH при ком натной температуре 40-60 ч, а для дихлортриазиновых красителей при рН 8-12,5 в присутствии 0,005-0,01 NaOH при комнатной температуре 1-4 ч. В обоих случаях в реакционную смесь вводят 0,25-0,5 М хлористого натрия. Концентрация вводимого в сорбент красителя составляет 7,5-15,0 мг/г сухого сорбента ij . Однако согласно условиям реакции присоединения используемых монохлор- и дихлортриазиновык красителе к носителю, известный с.пособ обеспе чивает введение в сорбент 7,0-15,0 красителя на 1 г сухого сорбента. Принимая средний молекулярный вес используемых красителей 800, представленная концентрация составляет 8,75-18,7 мкМ красителя/г сорбента Данная концентрация введенного в сорбент красителя является удовлет ворительной лишь для сорбентов на основе целлюлозы. Однако ее использование в известном способе полностью исключается. Для основного носителя, используемого в известном способе, - сефарозы представленная концентрация красителя 7,0-15,0 мг сухого сорбента составляет всего лишь 0,35-0,75 мкМ красителя на 1 м набухшего сорбента. Столь низкая к центрация вводимого в сорбент крас теля отрицательно отражается на со ционную емкость сорбентов и ограни чивает возможности их использовани для очистки ферментов, обладающих высоким сродством к красителю и использованию сорбент ов для извлечения ферментов из начальных экстрактов, в которых всегда присутствуют примесные белки, мешающие сорбции фермента. Кроме того, использование в качестве лиганда активных красителей монохлор- или дихлортриазинового ряда приводит к получению сорбентов, в которых связь носитель-краситель чувствительна к действию кислых значений рН. в связи с этим возможность использования сорбентов для очистки ферментов или белков, обладающих кислыми значениями изозлектрических точек, является ограниченной. Ограничены также возможности использования для регенерации сорбентов растворов с кислыми значениями рН. Наиболее близким к предложенному по технической сущности и достигаемому результату является способ получения сорбента групповой спеп.ифичности, включающий присоединение лиганда к силохромовому носителю,который предварительно модифицирован эпоксисмолой с последующим отверждением ее водньм раствором поливинилового спирта в присутствии полиэтиленамина, при весовом соотношении носитель:спирт 1:3-6 при 100105°С 2 . Известный способ характеризуется невысокой сорбционной емкостью полученного сорбента в отношении белков и нешироким диапазоном их использования. Цель изобретения - повышение сорбционной емкости полученного сорбента. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу, включающему присоединение лигандов ароматических азосоединений с реакционноспособными винилсульфоновыми группировками к модифицированному силохромному носителю при весовом соотношении носитель, лиганд 1: О, 025--0, 08 , в качестве лиганда используют ароматические азосоединения с регакционноспособными винилсульфоновыми группировками. Кроме того, в качестве ароматических с.зосоединений с реакционноспособными винилсульфоновыми группами используют активные красители производные нафтилазо- или пиразолилазобензола или их медные комплексы. Присоединение ведут при массовом соотношении носителя и лиганда 1:0,025-0,08. По предложенному способу в качестве ароматических азосоединений, содержащих винилсульфоновые группировки и ион меди, используют активный красно-коричневый 2КТ - медный комплекс, 1- (|-сульфатоэтилсульфоНИЛ) -3- t2-oKCH-4- (4-карбоксифениламино)-8-сульфо-нафтилаэо1 -4-оксибензола (МРТУ 6-14-198-69).Активный красно-фиолетовый 2КТ (МРТУ 6-14-202-690 - меднйй комплекс 1-(р-сульфатоэтилсульфонил)-3- | 2-окси-3-ацетамидо-5, В-дисульфонафтилазо -4-окси-бензола, активный желтый светопрочный 2КТ (ТУ 6-14-1057-74) медный комплекс 1-(|i-сульфатоэтилсульфонил)(4-сульфо)-/-метил-Б-окси-пиразолилЗ -aaoj-4-окси-бензола и активный желтый 2КТ (ТУ 6-14-1057-74) и -1-((}-сульфатоэталсульфонил) - 3-{ (4-сульфо -3 метил-5 окси-пиразолил}-азо}-4-метокси-бензол. В качестве модифицированных силохромных носителей используют аминопропилсилохроммы С-80 или СХ-2,5, модифицированные глутаровым альдегидом или водорастворимыми по лисахаридами . Использование в качестве лигандов ароматических азосоединений,которые содержат в своей структуре реакционноспособные винилсульфоновые группировки, позволяет получать сорбенты с высокой устойчивостью к кислым значениям рН за счет образования связи между винилсульфоновой группировкой и носителем. Наличие иона меди с одной стороны повышает устойчивость связи лиганд-носитель с другой стороны ион меди является дополнительным центром селективности по отношению белков или фермертов, что в свою очередь расширяет области использования сорбентов включая ферменты класса оксидо-редуктаз, трансфераз, обмена нуклеиновых кислот и белки плазмы крови. Способ осуществляют .следующим образом. Силохромный носитель модифицируют глутаровым альдегидом или декстраном, к модифицированному силохрому добавляют раствор азокрасителя при весовом соотнсяпении 1:0,025-0,08, смесь перемешиваю при нагревании. Полученный после фильтрации сорбент промывают водой. Пример 1. Получение сорбен тов групповой специфичности на осно ве неорганических носителей, модифи цированных глутаровьвй альдегидом. К 4,26 г силанизированногб силохрома С-80 (концентрация -NHj-групп-120 мкМ/г) прибавляют 5,1 мл 25%-ного глутарового альдегида (ренал; ВНР) и 7,0 мл воды и реакцион ную смесь перемешивают 1 ч при комнатной температуре, после чего носи тель отфильтровывают, промывают водой, 0,1 М NaHCOj содержащим 0,2-0,3% боргидрида натрия в течение 2 ч и водой. К модифицирован-. ному таким образом силохрому С-80 прибавл т 5 мл воды, смесь нагревают до оС и при перемешивании прибавляют небольшими порциями раствор 105,66 мг (131,2 , 30,79 мкМ/1 г носителя) активного красителя, красно коричневого 2КТ в 5 мл воды. Реакционную смесь перемешивают при 0,5 ч, прибавляют 1,8 г На СЕ перемешивгцот 1ч, температуру смеси повышают до , прибавляют 156,0 мг NOtjCOj и перемешивают при 3 ч. Смесь фильтруют и полученный сорбент промывают водой до прекращения вымывания красителя. Концентрацию красителя в сорбенте определяют из разницы между взятым его количеством по навеске и . найденным в промывных водах измерением оптической плотности растворов при максимуме поглощения, красителя 530 нм, используя молярный коэффициент экстинкции 13500М см. Концентрация крйейтеля в сорбенте составляет 26,2 мкМ/г,или 10,1 мкМ/1 мл или 21,2 мг красителя/1 г сорбента. Пример 2. К3,9г силаниэированного силохрома С-80, модифицированного глутаровым альдегидом,как описано в п- эре 1, прибавляют 99,66: мг (3,16 мкМ, 31,6 мкМ/г носителя) активного красителя краснофиолетового 2КТ в 4,0 мл воды. Реакцию присоединения красителя к носителю проводят аналогично примеру 1, с тем различием, что количества NO се и МогСОз составляют соответственно 1,7 г и 150 мг. Концентрация красителя в сорбенте,, определенная по примеру 1, используя коэффициент экстинкции для краснофиолетового 2КТ-34000М при и max - 545 нм является равной 22,5 мкМ/г или 8,8 мкМ/мл или 18,2 мг красителя/1 г сорбента. Пример 3. К15,0г силанизированного силохрома С-80, модифицированного глутаровым альдегидом,как описано в примере 1, прибавляют 310,8 мг (453,1 мкМ,30,2 мкМ/г носителя) активного красителя желтого светопрочного 2КТ в 15 мл воды. Реакцию присоединения красителя к носителю проводят аналогично примеру 1, с тем различием, что количества ЦаСб и На составляют соответственно 6,.О г и 537 мг. Концентрация красителя в сорбенте, определенная по примеру 1, используя коэффицие1 т экстинкции для желтого светопрочного 2КТ-24100Мсм является равной 24,8 мкМ/г или 9,2 мкМ/мл или 17,0 мг красителя/1 г сорбента. Пример 4,. Получение сорбентов групповой специфичности на основе неорганических носителей, модифицированных растворимыми полисахаридами.. .

К 5,0 мл 10%-ного раствора водорастворимого декстрана, например с молекулярной массой 40000 в 0,5. NOОН вводят 0,24 мг эпихлоргидрида и раствор перемешивают 2 ч при 30°С Затем вводят 1,0 г аминопропилсилохрома .СХ-2,5 (содержание аминогрупп 345 мкМ/г), температуру реакционной смеси поднимают до 7вС и перемешивают 3 ч. По завершении реакции носитель отфильтровывают, прс 1ывают 10 мл воды и выдерживают 15-20 ч при 90-95 С, после чего его пр(1ывают водой, 0,1 N НС1, 0,1 М«ао водой. Берут 20,0 г модифицированногр таким образом носителя,прибавляют 50 мл воды, температурусмеси поднимают до 60 С и при перемешивании прибавляют раствор 1,65 г красителя красно-коричневого 2КТ (82,5 мкМ/г носителя) в 140 мл воды. Перемешивание продолжают 0,5 ч, после чего прибавляют 20,8 г хлористого натрия, реакционную смес перемешивают 1 ч при . Температуру смеси поднимают до 80°С,прибавляют 1,8 г натрия углекислого . (На г COj) и перемешивают при 80с в течение 2,5-3 ч. Продукт реакции отфильтровывают и промывают водой до прекращения вымывания красителя.. Концентрацию красителя в сорбенте определяют как в примере 1.

Концентрация красителя в сорбенте составляет 22 мкМ/г или 7,6 мкМ/мл или 17,6 мг/1 г сорбента

Аналогично примеру 2 получают сорбент на основе силохрома. С-80. Концентрация красителя красно-коричневого 2КТ составляет 23,0 мкМ/г или 7,9 мкМ/мл или 18,4 мг/г сорбента.

Для определения пригодности сорбентов для очистки кофакторзависимых ферментов и белков используют базовый препарат дрожжевой гексокиназы, полученный после автолиза пекарских

дрожжей, фракционирования сульфатом аммония, диализа и лиофильной сушки, (удельная активность гексокиназы 10-25 кд/мгбелка), альбумин человеческой сыворо.тки (Р.еанал, ВНР), 1 емоглобин, (Мерк, ФРГ),цитохром; с (Серва,ФРГ)..

Пример 5. Хроматография дрожжевой гексокиназы. В хроматограФическую колонку (1,0-5,0 см) загружают 1,0 мл сорбента, полученного как в примерах 1-4. Сорбент уравно-. вешивают 10 мМ трис-НСб буфером рН 6,5, содержащим 5 мМ MgCl2 бНлО

и.0,5 мМ ЭДТА. На колонку наносят 0,5-2,0 мл раствора базового препарата фермента в исходном буфере. Концентрация белка 6,0-10,0 мг/мл, удельная активность 16-33 ед/мг

белка. При элюции 50-80 мл исходного буфера отмываются балластные белки. Активный фермент десорбируют линейным градиентом Ко об от 0-1,0 в исходном буфере. Сорбционная емкость

сорбентов по отношению гексокиназы представлена в таблице .

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА ДЛЯ ОЧИСТКИ БЕЛКОВ,включающий присоединение специфического пиганда к модифицированному силохромному носителю, отличающийся тем, ЧТО; с целью повышения сорбционной емкости сорбента, и в качестве лиганда используют ароматические азосоединения с реакционноспособньми винилсульфоновыми группами. 2.Способ ПОП.1, отличающийся тем, что в качестве ароматических азосоединений с реакционноспособньами винилсульфоновыми группами используют активные красители - производные нафтилазо- или пиразолилазобензола или их медные комплексы. 3.Способ по пп. 1и2, отл иО 9 чающийся тем,что присоединение ведут при массовом соотношении (Л 1Носителя и лиганда 1:0,025-0,08,