Способ получения сорбента для аффинной хроматографии микробных липаз Советский патент 1982 года по МПК B01D15/08 C08K3/36 C12N9/18 

Изобретение относится к химической и микробиальной промышленности, в частности к получению биоспецифических гидрофобных сорбентов, применяемы для выделения липофильных ферментов, в.частности липаз. Липазы находят применение в пищево и медицинской промышленности, в произ водстве моющих и косметических средств. Известен способ получения сорбента для аффинной хроматографии мик-робг ных липаз, который заключается в присоединении, ли ганда к нерастворимой матрице путем обработки последней BrCN-активированной сефарозы В - алифатическими аминами 1. Недостатками известного способа являются использование полисахаридной матрицы, легко подвергающейся микробиальн)5)му заражению, обладающей низкими гидродинамическими характеристиками, а также недостаточная гидрофобность получаемого сорбента, в связи с чем степень очистки при использовании данного сорбента составляет 25 раза. Известен также способ получения сорбента для аффинной хроматографии микробных липаз, включающий присоединение лиганда к нерастворимой матрице в результате обработки органического материала, например агара хлорангидридами жирных кислот. Реакцию проводят в пиридине или смес-и с ацетоном tl:1) в течение .10-12 ч. Достигаемая степень очистки при использовании данного copбет тa раз 12). Недостатком этого способа является то, что он не способен обеспечить получение сорбента с достаточно высокой гидрофобностью, обеспечивающей эффективность аффинной хроматографии липаз.. Кроме того, общим недостатком описанных способов получения сорбентов является то, что используются оргаиические матрицы, которые имеют сво ственные таким материалам недостатк низкую стабильность, подверженность к микробиальному заражению, неудов. летворительные гидродинамические характеристики вследствие сжимаемости полисахаридных матриц. Это не позволяет достигать высоких результатов при использовании данных сорбентов. Целью изобретения является повыш ние качества получаемого сорбента, т.е. повышение гидрофобноети, стабильности, улучшение эксплуатацион.ных характеристик сорбента. Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения сор бента для аффинной хроматографии ми робных липаз, включающему присоединение лиганда к нерастворимой матрице, в качестве нерастворимой матрицы сорбента используют силохром, который предварительно обрабатывают эпоксидной смолой в количестве 1 30 вес.% с последукмцим ее отверждением 3-51-ным водным раствором поли винилового спирта в присутствии три этиламина при 90-95°С активацией полученного продукта обработкой 5-20%-ным раствором гексамет1 ендии зоцианата при 105 110°С, а присоеди нение лиганда осуществляют обработкой активированной матрицы алифатическим спиртом с числом угреродных атомов 5 -10 при весовом соотношении матрицы и спирта 1:(3-6) и температуре 100-105 С. Предлагаемый способ обеспечивает получение сорбента высокой гидрофоб ности, созданной как присоединением алкильной группы, так и полимерной пленкой на поверхности смлохрома. Получаемый сорбент обладает также высокой мех.анической прочностью, стабильностью, высокими гидродинамическими характеристиками. После введения алкильных групп первичными насыщенными спиртами в состав сорбента входят только те ио низирующиеся вторичные аминогруппы, которые образовались в результате активации гексаметилендиизоцианатом. Общую гидрофобность полученного данным способом сорбента повышают также гидрофобные участки молекул эпоксидной смолы и отвердителя поливинилового спирта, который после Активации гексаметилендиизоциа14натом содержит полностью гидрофобную цепь. Наличие алкильных групп, а также гидрофобных групп эпоксидной смолы и поливинилового спирта подавляет электростатическое действие вторичных аминогрупп. Это обеспечивает селективную адсорбцию липаз на данном сорбенте, которая основана на гидрофобных взаимодействиях, и в результате повышает степень очистки фермента. Выбранные параметры стадий синтеза обеспечивают .наиболее оптимальное протекание всех реакций. Способ заключается в следую1цем. В колбу загружают силохром (удельная поверхность MVT, средний диаметр пор 1000-1300 Л) и раствор эпоксидной смолы в ацетоне. Систему подключают к вакууму на несколько минут для удаления воздуха из пор носителя. После выпаривания растворителя добавляют 3 5%-ный водный раствор поливинилового спирта в соотношении массы силохрома к массе раствора 1:5-10 и триэтиламин до концентрации его в растворе 1-2%. Смесь перемешивают на водяной бане при 9095 С в течение 1 ч. Фильтруют и промывают горячей водой и ацетоном. После высушивания добавляют раствор гексаметилендиизоцианата в сухом толуоле в соотношении массы силохрома к массе раствора , Перемешивают при 105-1Ю С в течение 1 ч. После фильтрования и высушивания добавляют соответствующий спирт в соотношении масс твердой фазы и раствора . Перемешивают в течение 1 ч. Фильтруют, промывают и сушат. Использование получаемого предлагаемым способом сорбента позволят ет достичь степени очистки липаз в 13-23 раза. П р и м е р 1. В колбу загружают 20 г силохрома и раствор 0,2 г эпоксидной смолы в 70 мл ацетона. Систему подключают к вакууму на 1-2 мин для удаления воздуха из пор силохрома. После eunapfHeeHMP растворителя на ротационном испарителе добавляют 100мл водного раствора поливинилового спирта, 2 мл триэтиламина и нагревают на водяной бане при 9095С в течение 1 ч. Фильтруют, промывают горячей водой, ацетоном и сушат. К полученному продукту добев59

ляют 80 мл 5 -ного раствора гексаметилендиизоцианата в сухом толуоле и перемешивают при в течение 1 ч Фильтруют, промывают на фильтре толуолом и сушат в вакуум-сушильном шкафу. Содержание изоцианатных групп 0,06 мг-экв/г силохрома.

Активированную основу загружают в колбу с 100 мл амилового спирта и перемешивают при в течение 1 ч Фильтруют, промывают этанолом и сушат. Содержание амиловых групп около О, 05 мг-экв на 1 г сухого сорбента.

Так как алкильные группы не поддаются прямому определению, их содержание определяется из расчета, что степень превращения изоцианатных групп в .алкильные группы составляет около 801.

Пример2. В колбу загружают , 20 г силохрома и раствор г эпоксидной смолы в 70 мл ацетона. Систему подключают к вакууму на 1-2 мин для удаления воздуха из пор силохро;ма. После выпаривания растворителя добавляют 200 мл 5%ного водного раствора поливинилового спирта, 2 мл триэтиламина и нагревают на водяной бане при 90-95С в течение 1 ч. Фильруют, промувают горячей водой, аценом и сушат.

К полученному продукту добавляют 120 мл 20 -ного раствора гексаметилендиизоцианата в сухом толуоле м перемешивают при 105°€ в течение 1 ч Фильтруют, промывают на фильтре толуолом и сушат в вакуум-сушильном шкафу. Содержание изоцианатных групп 0,16 мг- экв/г.

Активированную основу загружают в колбу с 120 мл октилового спирта и перемешивают при в течение

1ч. Фильтруют, гцэомывают этанолом и сушат. Содержание октиловых групп около 0,13 мг-экв/г сорбента.

Примерз. В колбу загружают 20 г силохрома и раствор 6 г эпок Сидней смолы в 70 мл ацетона. Систему подключают к вакууму на 1-2 мин для удаления воздуха из пор смлохрома. После выпаривания растворителя добавляют 200 мл 3 -ного водного раствора поливинилового спирта,

2мл тризтиламина и нагревают на зодяной бане при 90-95°С в течение 1 ч. Фильтруют, промывают гбрячей водой, ацетоном и сушат.

К полученному продукту добавляют 120 мл 10 -ного раствора гексамети16

лендииэоцианата в сухом толуоле и перемешивают при в течение 1ч. Фильтруют, промывают на фильтре толуолом и сушат в вакуум-суиильном шкафу. Содержание изоцианатных групп Q,2k мг-зкв/г.

Активированную основу загружают в колбу с 60 МП децилового спирта и перемешивают при в течение 1 ч, фильтруют, промывают этанолом и сушат. Содержание дециловых групп около 0,2 нг-экв/г сорбента.

Пример. 2вг активированного силохрома по примеру 2, содержащего 0,1б мг-зкв/г изоцианатных групп, загружают в колбу с 120 мл амилового спирта и перемешивают при в течение 1 ч. Фильтруют, промывают этанолом и сушат. Содержание амиловых групп около 0,13 мг-экв/г сорбента.

Пример 5« 20 г активированного силохромэ по примеру 2, содержащего 0,16 мг-экв/г изоцианатных групп, загружают в колбу с 80 мл децилового спирта и перемесмвают при 105-110°С в течение 1 ч. Фильтруют, промывают этанолом и сушат. Содержание дециловых групп около 0,13 мг-экв/г сорбента.

Результаты присоединения алкильных групп к матрице приведете в таблице.

Пример 6. К 800 мг сорбента с октиловы « группами добавляют 6 мг ферментного раствора липазы (725 ед.) в 0,01 И фосфатном буфере. Смесь оставляют лри на 2 ч, периодически встряхивал, после чего частицы носителя с адсорбированной липазой ото(.1льтровывают, помещают в колонку (10 в диаметре ) и промывают буфером до исчезновения белка в Промывных водах. В фильтрате определяют липолитическую активность по методу Ота и Ямада, а также белок по методу Поури в модификации Хартри. Количество адсорбированных белка и активности определяют по разности содермкания белка и активности в исходном материале и в фильтрате, полученном после отделения частиц носителя с адсорбированным белком. Адсорбированный белок элюируют 15 мл 50 fe-oro раствора ; тиленгли: оля и 15 мл 0,5%-ного раствора дезоксихолата натрия оЭлюирование тритоном х-100 проводят в условиях непрерывного градиента концентрации (0,01-0,2)

7

150 мл. Получают увеличение удельной активности (степень очистки) в 23 pdsa в наиболее активных фракциях, выход активности составляет 525. .

Пример. К100 мг сорбента с дециловыми группами добавляют 2 мл ферментного раствора (96 ед.) в 0,01 М фосфатном буфере (рН 7,6). Условия адсорбции и десорбций такие же, как в примере . Выход фермента 81% от активности исходного матрриала, увеличение удел-ьной активности в 20 раз в наиболее активных фракциях.

18

Технико-экономическая эффективность предлагаемого способа состоит в улучшении качества получаемых сорбентов - повышении гидрофобности, стабильности и других характеристик, что позволяет достигнуть высоких степеней очистки липаз. Липазы высокой степени очистки находят широкое применение в народном хозяйстве: медицине, в производстве моющих и косметических средств, в пищевой промышленности.

Предполагаемый экономический эффект от внедрения способа составит около 100 тыс.руб. формула изобретения Способ получения сорбента для аффин ной хроматографии микробных липаз, включающий присоединение лиганда к нерастворимой матрице, отличающ и и с я тем, что, с целью повышения гидрофобности, стабильности, улучшения эксплуатационных характеристик сорбента, в качестве нерастворимой матрицы сорбента используют силохром, который предварительно обрабатывают эпоксидной смолой в количестве 130 весД с последующим отверждением ее водным раствором поливинилового спирта в присутствии триэтиламина при 90-95С и активацией 93 12 полученного продукта обработкой 520%-ным раствором гсксаметилендиизоцианата при 105-110 0, а присоединение лиганда осуществляют обработкой активированной матрицы ал)1фатическим спиртом с числом углеродных атомов 5-10 при весовом соотношении матрицы и спирта 1:(3-6j и температуре 100-105°С. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1.Патент США h 013512, кл.195-66, 1977. 2.Патент США t 3901763, кл. 195-66, :1975.