Способ получения сорбента Советский патент 1982 года по МПК C07F7/18 G01N33/48 C12N9/00 

Изобретение относится к области энэимологии и предназначается для получения сорбента для выделения и очистки кофактор-зависимых ферментов - оксидо-редуказ, киназ и др.

Для выделения и очистки кофакторзависимых ферментов наряду с классическими методами широкое распространение получила и методика биоспецифической хроматографии с использованием групповых сорбентов на основе иммобилизованных производных iкофакторов..

Однако сорбенты данного типа несмотря на их высокую специфичность обладают существенными недостатками: дороговизной, которую определяет дороговизна используемых для синтеза сорбентов носителей и кофакторов, сложность методов активирования и модифицирования кофакторов, низкая химическая стабильность получаемых сорбентов, что в совокупности исключает возможность использования сорбентов для препаративного выделения и очистки кофактор-зависимых ферментов.

Более перспективными для препаративного выделения и очистки кофактор-зависимых ферментов являются

сорбенты, содержащие в качестве ли ганда красители, структурные аналоги коферментов, и -в первую очередь активный краситель цибакрон голубой . Так, известен способ полученивт сорбента на основе агарозной матрицы с присоединенным красителем цибакрон голубым l.

Однако возможность препаратив10ного использования сорбентов со связанными красителями несмотря на химическую стабильность последних ограничена недостатками используемой для синтеза сорбентов агарозной мат15рицы (дороговизна, низкая химическая, микробиологическая и механическая стабильность).

Наиболее близким по технической сущности является способ получения

20 сорбента на основе красителя цибакрон голубого F-jGA и микросферического пористого силикагеля SG 120, включагаций активирование носителя . f-aминoпpoпилтpиэтoкcиcилaнoм, от25дельное от носителя активирование водорастворимого декстрана с BrCN в среде бикарбоната йатрия при рН 9,0 в соотношении-50 мг BrCN на 200 мг декстрана и модифицирование

30 носителя BrCN-активированным декстраном при рН 9,0 в колонке в соотноше нии 200 мг декстрана на 1,0 г носителя путем рециркуляции активирован ного декстрана через колонку в тече ние 24 ч, промывку модифицированног носителя, присоединение красителя цибакрон голубого и промывку полученного сорбента водой. Обычно промывку модифицированного носителя осуществляют IM раствором NaCP и ВОДОЙ 2.. Однако данный способ получения сорбента имеет ряд существенных недостатков. Во-первых, процесс модифицирования активированного неорганического носителя является нетех нологичным и осложняется использова нием для присоединения декстрана Т40 к носителю BrCN, который является дорогостоящим, ядовитым и опасным веществом при использовании его в препаративных целях, во-вторых при использовании для модифицирования неорганического носителя декстра на, активированного BrCN, образующаяся связь между носителем и декст раном является химически нестабильной 3, что приводит к потере присоединяемого красителя при длительном использовании сорбента и, следовательно, снижению емкости сорбента; в-третьих, существующий -метод модифицирования неорганического носителя обеспечивает возможность введения в сорбент 5-10 мкМ красителя на 1 г сорбента и ограничивает тем самым возможность его использования для выделения и очистки тех кофактор-зависимых ферментов, которые обладают низким средством к красителю С другой стороны, сравнительно невысокая концентрация вводимого кра сителя влияет и на степень сорбционной емкости сорбента в целом по отношению выделяемых с его помощью белков. Цель изобретения - упрощение про цесса получения сорбента (путем сни жения числа стадий, общей трудоемкос ти процесса, а также исключения ис.пользования ядовитых веществ) и повышение сорбционной емкости сорбента Поставленная цель достигается тем что согласно способу получения сорбен та, включающему обработку неоргани ческого кремнеземсодержащего материала f-аминопропилтриэтоксисиланом и модифицирование полученного производного с последующей промывкой и присоединением активного красителя цибакрон голубого , модифицирование производного проводят в тече ние 1-2 ч 25-50-кратным избытком глу таральдегида в отношении NH -групп обрабатываемого продукта. Активный краситель цибакрон голубой F GA используют в количестве 20100 мкМ/г. обрабатываемого продукта. В качестве неорганического кремнеземсодержащего материала используют .пористое стекло или силохром со средним радиусом пор 300-800 А. Промывку модифицированного продукта перед присоединением красителя осуществляют водой, 10-20 объемами 0,09-0., 15 М раствора NaHCO, содержащего 0,2-0,3% боргидрида натрия в течение 2-3 ч. Способ обеспечивает возможность введения в сорбент 10-40 мкМ красителя на 1 г сорбента, т.е. позволяет повысить его сорбционную емкость. Модифицирование носителя, содержащего аминогруппы, проводят глутаральдегидом с последующим восстановителем, что способствует образованию стабильной связи между ним и носителем и образованию стабильной связи между присоединяемым красителем и модифицированным носителем. Метод модифицирования глутаральдегидом является доступным, простым в технологическом оформлении, так как не требует использования труднодоступных и ядовитых веществ, и позволяет подбором соотношения реагирующих веществ регулировать концентрацию вводимого в сорбент красителя и соответственно сорбционную емкость сорбента в широком интервале значений. Способ является более технологичным и простым по сравнению с известным. Неорганическая матрица может быть использована как в виде силохромов и пористых стекол с последующим аминированием -ТГ-аминопропилтриэтоксисиланом, так и в виде готовых NH -содержащих производных, выпускаемых зарубежными фирмами и НПО Виохим-реактив. Оптимальное содержание NH -групп 100-448 мкМ/г. Пример. Получение сорбента на основе силохрома С-80. 10 г силохрома С-80 заливают 10 г абсолютного ацетона, вводят 10 Г -аминопропилтриэтоксисилайа и реакционную смесь перемешивают в течение 24 ч при температуре кипения смеси. Продукт реакции отфильтровывают, промывают 4-5 раз ацетоном (по 50 мл) и высушивают. Получают 9,4 г аминопроизводного силохрома С-80. 2,3 г силанизированного силохрома С-80 (концентрация NH4.-rpynn 120 мкМ/1г) заливают 5,8 мл 25%-ного глутарового диальдегида и 2,6 мл воды, перемешивают 1 ч при комнатной температуре, промывают на фильтре водой, затем небольшими порциями (15-20 мл) 0,1 М NaHCO (200 мл), содержащего 0,2-0,3% ЯаВК(в течение 2 ч и опять промывают водой. К влажному глутаральдегидом модифицированному силохрому С-80 прибавляют 3 мл воды и при перемешивании при вводят по каплям раствор 252,5 мг (234у8 мк .цибакрон голубого в 14,0 мл воды. Перемешивание продолжают еще 0,5 ч прибавляют 2,25 г NaCe, перемешивают 1 ч, затем температуру повы шают до 80°С, прибавляют 200 мг Na, и перемешивают 2 ч. Полученны сорбент отмывают холодной и горячей водой бО-ЭО С до тех пор, пока промывные воды -становятся бесцветными. Концентрацию красителя на .сорбенте определяют по разнице Между взятым его количеством и найденным в промывных водах, используя теоретический коэффициент экстинции Е 13600 М . (X ди 610 нм) . Концентрация цибакрон голубого F GA 37,0 мкМ/г сухого сорбента. П р и м е р 2. Получение группового сорбента на основе пористого стекла CPG 550. 6,7 г силанизированного стекла CPG 550 (концентрация NH,j,-rpynn 100 мкМ/г) заливают 6,7 мл 25%-ного глутаральдегида, прибавляют 23,3 мл воды и пер.емешивают 1 ч при комнатной температуре, промывают на фильт ре водой, затем 400 мл 0,1 М ЫаНСОз (порциями по 30-50 мл), содержащего 0,2-0,3% NaBH,в течение 2 ч вод К влажному модифицированному стеклу прибавляют 10 мл воды и при перемешивании при 60°С вводят по каплям раствор 660, 1 мг (613,9 мкМ) цибакрон голубого ЕЗ GA. Далее реакцию проводят по примеру 1, но количеств прибавляемых NaCE и соответст венно 5,5 г и 493 мг. Концентрация цибакрон голубого 25 мкМ/г сухого сорбента. Для определения пригодности сорбентов для очистки кофактор-зависимых ферментов используют базовый препарат дрожжевой гексокиназы, полученный после автолиза пекарских дрожжей, кислотного фракционирования, двухкратного фракционирования сульфатом аммония, диализа и лиофил ной сушки, согласно начальным стадиям схемы очистки фермента по методике f43 и базовый препарат дрожжевой алкогольдегидрогеназы, полученный после автолиза дрожжей, термической обработки, фракционировани рульфатом аммония, диализа и лиофил ной сушки согласно начальным стадия по методике 5. Удельная активност ферментов в среднем 10-25 ед/мг для гексокиназы и 5-10 ед/мг белка для алкогольдегидрогеназы. Примерз. Очистка дрожжеврй гексокиназы. В хроматографическую колонку (1,,0 см) загружают 1,0 мл сорбе та, полученного по примеру 1 при использовании 25-кратного избытка глутаральдегида с концентрацией красителя 15 мкМ/г сорбента. Сорбент уравновешивают 10 мМ трис-HCf буфером рН 6,5, содержащим 5 мМ МдСр- бН.О и 0,5 мМ ЭДТА, и наносят 1,5 мл раствора фермента в исходном буфере. Концентрация белка 6,0 мг/мл, удельная активность 19,8 ед/мг белка. При элюировании с 50 мл исходного буфера вымываютсябалластные белки. Элюирование гексокинаэы проводят градиентом хлористого натрия от 0-1,0 М в исходном буфере. Удельная активность гексокиназы после десорбции в среднем 72 ед/мг. Выход по активности 98-100%. Емкость сорбента 140 ед/мл. Пример За. В хроматографическую колонку (как в примере 3) загружают 1,0 мл сорбента, полученного по примеру 1 при использовании 25кратного избытка глутаральдегида с концентрацией красителя 40,6 мкМ/г сорбента. Сорбент уравновешивгиот буфером (как в примере 3) и наносят 2,0 мл раствора фермента в ис ходном буфере. Концентрация белка 8,8 мг/мл, удельная активность 16,5 ед/мг белка. При элюции 100 мл исходного буферного раствора вымывают балластные белки; Активная гексокиназа десорбируется линейным градиентом хлористого натрия от 01,0 М в исходном буфере. Удельная активность гексокиназы после-десорбции 82,0 ед/мг белка, выход по активности 100%. Емкость сорбента 225ед/мл. П р и м е р Зб. В хроматографическую колонку (как в примере 3) загружают 1,0 мл сорбента, полученного по примеру 1 при использовании 50кратного избытка глутаральдегида с концентрацией красителя 15 мкМ/г сорбента, уравновешивают исходным буфером и наносят 1 мл раствора гексокиназы с концентрацией белка 8,8 мг/мл и удельной активностью 16,4 ед/мг белка. При элюировании с 80 мл исходного буфера вымываются балластные белки. Активная гексокиназа десорбируется линейным град;иентом NaCf от 0-1,0 М в исходном буфере. Удельная активность гексокиназы после десорбции в среднем 80 ед/мг белка, выход по активности 100%. Емкость сорбента 142 ед/мл. П р и м е р Зв. В хроматографическую колонку (как в примере 3) загружают 1 мл сорбента, полученного по примеру 1 при использовании 50кратного избытка глутаральдегида с концентрацией красителя 37}О мкМ/г сорбента, уравновешивают исходным буфером и наносят 1,5 мл раствора

гексокиназы с концентрацией белка 8,5 мг/мл и удельной активностью 21,1 ед./мг белка. При проведении хроматографии в условиях идентичных примеру 3 удельная активность фермента 69 ед/мг белка с йыходом активности 72%. Емкость сорбента 224,5 ед/мл.

П р и м е р 3г. В хроматографическую колонку (как в примере 3) загружают 2,8 мл сорбента, полученного на основе пористого стекла (как в примере 2) с использованием 50-кратного избытка глутаральдегида и концентрацией красителя 15 мкМ/1г сорбента. После уравновешивания сорбента исходным буфером наносят 3 мл раствора гексокиназыс концентрацией белка 9,6 мг/мл и удельной активностью 33 ед/мг белка.. При проведении хроматографии в условиях идеитичных примеру 3 удельная активность десорбированного фермента достигает 150 ед/мг белка с выходом активности 80%. Емкость сорбента 333 ед/мл.

П р и м е р 4. Очистка дрожжевой алкогольдегидрогеназы.

В хроматографическую колонку (1,5-3,0 см), заполненную 2,0 мл сорбента, синтезированного (как в примере 2) с использованием 25-кратного избытка глутаральдегида с концентрацией красителя 15 мкМ/г сорбента, и уравновешенную 10 мМ трисНСС буфером рН 6,5, содержащим . 5 мМ MgCe,j;6H5 0,. 0.,5 мМ ЭДТА И 0,05 м меркаптоэтаноля, наносят 3,0 мл ферментного раствора элкогольдегидрогеназы. Концентрация балка 14,7 мг/м удельная активность 7,9 ед/мг белка. При промывании колонки исходным буфером (140 мл) вьамываются балластные белки. Элюирование фермента осуществляют специфически линейным градиентом НАД от 0-10 мМ (50 НЯ) в исходном буфере. Активная алкогольдегидрогеназа десорбируется при 3 мМ НАД с удельной активностью 120 ед/мг белка и выходом активности 47%. Сорбционна емкость сорбента 140 ед/мл сорбента.

Прим е.р 4с. В хроматографическую колонку (как в примере 4), заполненную 1 мл сорбента, полученного на основе силохрома С-80 (как в, примере 1) с использованием 25-кратнОго избытка глутаральдегида с концентрацией красителя 15 мкМ/г, уравновешенную исходным буфером, наносят 2 мл раствора алкогольдегидрогеназы с удельной активностью 7,6 ед/мг -белка и концентрацией белка 10,6 мг/мл. При промывании 60 мл исходного буфера вымываются балластные белки. Элюирование алкогольдегидрогеназы проводят линейным градиентом НАД от 0-10 мМ в исходном буфере. Активный фермент десорбировался при 5 мМ НАД

С удельной активностью 55 ед/мг бел и выходом активности 48%.Емкость сор бента 120. ед/мл сорбента.

Прим.. В хроматографическую колонку (как в примере 4), зполненную 1 мл сорбента, полученного на основе силохрома С-80 (как в примере. 1) с использованием 25кратного избытка глутаральдегида с конден -рацией красителя 40,6 мкМ/г, уравновешенную исходным буфером, наносят, 2,0 млраствора алкогольдегидрогеназы с концентрацией белка 11,6 мг/мл и удельной активностью 8,3 ед/мг белка. После промывания 60 мл исходного буфера вымываются балластные белки. Элюирование алкогольдегидрогеназы проводят линейным градиентом.НАД от 0-10 мМ в исходном буфере. Активная алкогольдегидргеназа десорбируется при 5 мМ НАД с удельной активностью 140 ед/мг белка. Сорбционная емкость сорбента 130 ед/мл сорбента.

Пример 4-. В хроматографическую колонку (как в примере 4), заполненную 1 мл сорбента, полученного на основе силохрома С-80 (как в примере 1) с использованием 50-кратного избытка глутаральдегида с концентрацией красителя 15 мкМ/г, уравновешенную исходным буфером, наносят 2 мл раствора алкогольдегидрогеназы с удельной активностью 7,6ед/мг белка и концентраци й белка 10,6 мг/мл. После вымывания балластных белков с 60 мл исходного буфера активная алкогольдегидрогеназа десорбируется линейным градиентом НАД от 1-10 мМ в исходном буфере. Удельная активность фермент десорбируемого с 4 мМ НАД 110 ед/мг белка свыходом активности 43%. Ем|КОсть сорбента 90 ед/мл сорбента.

Пример 4. В хроматографическу о колонку (как в примере 4) , заполненную 1,0 мл сорбента, полученного на основе силохрома С-80 (как в примере 1) с использованием 50-кратного избытка глутаральдегида .с концентрацией красителя 37-мкМ/г, наносят 2 мл раствора алкогольдегидрогеназы с удельной активностью 7,6- ед/мг белка и концентрацией белка 10,6 мг/мл. При проведении хроматографии аналогично примеру 4-4алкогольдегидрогеназа десорбируется при 5 мМ НАД С удельной активностью 115 ед/мг белка и выходом активности 41%. Емкость сорбента 112 ед/мл.

Предлагаемый способ получения группового сорбента на основе модифицированного неорганического носите.ля и красителя цибакрон голубого Fj GA обеспечивает по сравнению с известными способами получения сорбентов следунхцие преимущества. Высокую эффективность сорбента по отношению кофактор-зависимых ферментов, т.е. возможность повьпиения уде ной активности очищаемых ферментов за одну стадию сорбции - десорбции среднем 4-15 раз с сохранением активности фермента на 40-100%. Сорбент, получаемый по предлагаемому способу, обладает высокой объемной сорбционной емкостью ферментов, составляющей 90-330 ёд. активности/мл сорбента. Доступность исходных веществ, необходимых для получения сорбента, простота и доступность метода получения сорбента обеспечивают возможность внедрения технологии синтеза в производство для выпуска укрупненных партий сорбента. . Совокупность перечисленных преим ществ определяет эффективность использования предлагаемого способа получения сорбента для его промышле ного производства и использования в технологии получения высокоочищенных кофактор-зависимых ферментов Формула изобретения 1. Способ получения сорбента, включающий обработку неорганическог кремнеземсодержащего материала Т-ам нопррпилтриэтоксисиланом, модифицирование полученного производного с последующей промывкой и.присоединением активного красителя цибакро голубого ,отличающий с я тем, что, с целью упрощения пр цесса и повьииения сорбционной емкости сорбента, модифицирование осу ществляют в течение 1-2 ч глутаровы альдегидом, взятым в 25-50-кратном избытке по отношению к содержанию NHj-групп обрабатываемого продукта. 2.Способ по П.1, отличающийся тем, что активный краситель цибакрон голубой используют в количестве 20-100 мкМ/г обрабатываемого продукта. 3.Способ по ПП.1 и 2, отличающийся тем, что в качестве неорганического кремнеземсодержащего материала используют пористое стекло или силохром со средним ра диусом пор 300-800 А. 4.Способ по пп.1-3, отличающийся тем, что промывку модифицированного продукта перед присоединением красителя осуществляют водой, 10-20 объемами 0,09-0,15 М раствора NaHCQv содержащего 0,20,3% боргидрида натрия в течение 2-3 ч. . Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1.Burgett M.W., GreenEey L.V. Amer.Lab., 1977, 9.78. 2.Anderson P.A., Jervis L. Affinity purification of maCate dehydrogenase and Eactate dehydrogenase from fish muscCe on microsphericaC porous ceramic adsorbents. - Biochem.Soc.Trans., 1977, 5,. 728. 3.Turkova Y. Leakage of coupfed affinant, - J.Chromatography, 1978, 12, 189. 4..Biochem.Biophys., 1973, 158, 451-457. 5.Кочетов Г.A. Практическое руководство по энзимологии. М., Высшая школа , 1978, 128.