Способ очистки микробных липаз методом аффинной хроматографии Советский патент 1982 года по МПК C12N9/18 

мента в 2-5 раз, удельная активность

возрастает до 160 ед. Выход 50-78%

от активности исходного- материала fl

однако способ характеризуется невысокой степенью очистки и недоста.точной устойчивостью органической матрищл сорбента к влиянию среды и действию микроорганизмов, что приводит к загрязнению выделяемого фермента продуктами разрушения матричного материала.

Цель изобретения - повышение степени очистки ферментов.

Поставленная цель достигается тем что согласно способу очистки микробных липаз путем аффинной хроматографии, включающим сорбцию фермента из раствора на аффинном сорбенте при рН 7-8 и десорбцию фермента органическим растворителем и детергентами, используют сорбент, представляющий собой- силохром с нанесеннЕдм полимерным покрытием из сополимера 2,2-ди-(4-эпоксипропилоксифенил)-пропана и поливинилового спирта и присоединенных с помощью гексаметилендиизоцианата C5-Cio-алкильных групп.

Используют 0,05-0,2 мг.экв/г сорбента с содержанием С -С д-алкильных групп.

Десорбцию фермента обычно проводят 50%-ным раствором этиленгликоля, 0,5%-ным раствором дезоксихолата натрия, 0,1-0,6%-ным раствором тритона х-100.

Предлагаемый способ обеспечивает повышение степени очистки ферментов до 13-23 раз.

Повышение степени очистки обусловлено высокой избирательностью адсорбции ферментов на сорбенте, который содержит лиганды - гидрофобные алкильньае группы, а также гидрофобные группировки молекул эпоксидной смолы, поливинилового спирта и гексаметилендиизоцианата, по отношению . к которым липаза проявляет свою аффинность. Высокая степень гидрофобности сорбента, усиливающая гидрофобное взаимодействие фермента с сорбентом, увеличивает адсорбцию липазы.

Кроме того, сорбент на основе неорганической Матрицы обладает структурной стабильностью (такие носители мало чувствительны к изменениям рН и других условий среды и не изменяют своих .размеров и конфигураций, т.е. являются механически прочными), устойчивостью к действию микроорганизмов, легкостью модификаций, доступностью и сравнительно-низкой себестоимостью.

-Используемый в предлагаемом способе аффинный сорбент представляет ,собой фактически модифицированный силохром, который получают пропиткой силохрома 1-30%-ной эпоксидной

смолой в растворе ацетона и последующим выпариванием растворителя, отверждением смолы 3-5%-ным водным раствором поливинилового спирта в присутствии 1-2% триэтиламина при весовом соотношении силохрома и раствора 1:5-10 и 90-95 0 и последующей активацией .материала 5-20%ным раствором гексаметилендиизоцианата в сухом толуоле при весовом соотношении твердой фазы 1:4-6 и 105-110 с в течение 1 ч и присоединением лиганда обработкой полученного материала алифатическим спиртом с числом углеродных атомов при весовом соотношении матрцы и спирта 1:3-6 и 100-105°С.

Пример. Получение сорбент

В коЛбу загружают 20 г силохрсма и раствор 1 г зпоксидной смолы в 70 мл ацетона. Систему подключают к вакууму на 1-2. мин для удаления воздуха из пор носителя. После выпаривания растворителя добавляют 200 мг 5%-ного водного раствора поливинилового спирта, 2 мл триэтил амина и нагревают на водяной бане при 90-95 с в течение 1 ч. Фильтруют, проишвают горячей водой, ацетоном и сушат.

К полученному продукту добавляют 80 мл 10%-ного раствора гексаметиледиизоцианата в сухом толуоле и перемешивают при 100-110 С в течение 1 ч. Фильтруют, промывают на фильтре толуолом и сушат в вакуум-сушильном шкафу. Содержание изоцианатных

групп 0,06 МГ-ЭК8/Г.

Активированньй силохром загружают в колбу с 80 мл амилового спирта и перемешивают при 100-1Об С в течение 1 ч. Фильтруют, промывают этано.лом и сушат. Содержание амиловых групп приблизительно 0,05 мг-экв/г.

Так как алкильные группы не поддаются прямому определению, то их содержание определяется из расчета, что степень превращения изоцианатных в алкильные около 80%.

П .р и м е р 2. Очистка липазы на сорбенте с октиловой группой с примнением при десорбции ступенчатого градиента концентрации тритона х-10

Приготовление ис.ходного ферментного препарата.

Исходным материалом для очистки служит ферментный препарат, полученный осаждением сульфатом аммония белков из культуральной жидкости микроскопического гриба Jeotrichum asteroides, выращенного.на питательной среде в течение 48 ч при аэрации и 28°с. Препарат имеет активность 14-21 ед/мг белка. За единицу липолитической активности принимают количество фермента, освобождающее 1 мкмоль олеиновой кислоты за 1 мин при 37°С.

К 400 мг сорбента (октилсилохрома добавляют 4 мл ферментного раствора 365 ед,) в 0,01 М фосфатном буфере (рН7,2). Смесь оставляют при на 2 ч, периодически встряхивая, после чего частицы сорбента с гщсорбированной липазой помещают на колонку (10 мм в диаметре) и сорбируют фильтру, Сорбент с адсорбированным ферментом промывают фосфатным буфером до изчезновёния белка в промы--. вных водах. В фильтрате определяют липолитическую активность по методу Ота и Ямада, а также белок по методу Лбури в модификации Хартри. Количество адсорбированного белка и активности определяют по разности со держания белка и активности в исходном материале и в фильтрате, полученном после отделения частиц но сйтеля с адсорбированным ферментом. Адсорбированный фермент элюируют (фракции по 3 мл) по следующей схеме: 50%-ный раствор этилеигликоля 15 мл; 0,5%-ный раствор дезоксихолата натрия 15 мл; тритон х-100 :0,1%-ный раствор 9 мл; 0,2%-ный 12 мл; 0,4%-ный 12 мл; 0,6%-ный 12 мл; 0,8%-ньА 12 мл.

Результаты элюирования представлены в таблице.

Исходный ферментный р-р

Адсорбировано на

носителе

Десорбцияf%

Этиленгликоль Дезоксихолат

Белок и активность при десорбции выргикены в процентах от белка и активности исходного материала. Удельная активность представлена по нгшболее активным фракциям.

Величины активности даны с учетом влияния разных концентраций тритона х-100 на активность липазы.

Тритон х-100 в концентрации 0,10,2% десорбирует 84% липазы с очисткой в 11 раз, в наиболее активных фракциях в 13 раз.

Тритон х-100, оказывающий на липа,зу ингибирукяцее действие в концентрации 0,013% и выше, удаляют ультра100,0

356

21,0 76,4

272

7,5

2,5

фильтргщией через мембрану РИПОР-4 60 (Олайне) при добавлении к фермент. ному раствору глицерина.

Пример 3. Очистка липазы на сорбенте с октиловой группой с применением при десорбции непре{швного 5 градиента концентрации тритона х-100