Штамм бактерий VIвRIо сноLеRае сноLеRае OGaWa, используемый для получения холерного токсина Советский патент 1990 года по МПК C12N15/00 A61K35/74 C12N15/00 C12R1/63 

Описание патента на изобретение SU1400075A1

4

О О О

ел

Изобретение относится к медицинской микробиологии, а имеиио к получению штамма холерного вибриона классического бно- вара серовара Огава. продуцирующего холерный 1ТОКСИИ во внешнюю среду.

Целью изобретения является конструирование нового штамма серовара Ogawa, способного продуцировать специфический холерный экзотоксин в высоких концентрациях.

Штамм V. cholerae cholerae содержит гибридную плазмиду рС0107-2, детерминирующую синтез холерного токсина. Штамм V. colcrae cholerae КМ75 получен путем конъюгативного введения в клетки Гипоток- снгенного штамма V. cholerae cholerae RV 31 ilv arg his Sir серовара Огава гибридной плазмиды рС0107-2, содержащей vct-оперон, детерминирующий синтез холерного токсина.

Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов Института «Л нкроб под номером КМ 75/рС0107-2 и характеризуется следующими призиакамн.

Культурно-морфологические признаки.

Подвижные, слегка изогнутые палочки, спор и капсул не образуют, грамотрица- тельные.

Штамм растет как на простых полноценных средах, так и на средах с добавлением 5 мкг/мл тетрациклина и 50 мкг/мл кана- мицина. На твердых питательных средах формирует гладкие, круглые серовато-голубоватые полупрозрачные колонии размером 1,0-1,5 мм.

Вызывает равномерное помутнение как простых жидких питательных сред, так и среде добавлением антибиотиков, через 18- 24 ч не образует пленки на поверхности бульона.

При выращивания на минимальной среде необходимо добавление нзолейцина, валина, аргинина и гистидина.

Физиологические свойства.

Ферментирует до кислоты без газа маи- нозу, сахарозу, маннит и мальтозу. Не ферментирует лактозу и арабинозу. Не лизирует эритроциты барана, не агглютинирует куриные эритроциты, не растет на щелочном агаре с добавлением 50 мкм/мл полимиксина.

Чувствителен к холерному диагностическому фагу С.

Агглютинируется до титра холерными сыворотками О (1:2000) и Огава (1:800).

Патогенные свойства.

Вирулентен для кроликов-сосунков в дозе. 10 м.кл./мл.

Пример. Высушенную ампульную культуру штамма V. cholerae cholerae КМ75 засевают на агар Хоттингера рН 7,6, содержащий 5 мкг/мл тетрациклина или 50 мкг/мл канамнцина, и инкубируют 18 ч при 37°С.

Для количественного определения холерного экзотоксина используют иммунофер

ментный метод omiELlSA. В качестве контроля и для определения чувствительности метода используют очищенный препарат холерного токсина. Клетки штамма КМ 75 5 в объеме 10 мл выращивают 18 ч при 30°С в 0,1-литровых колбах в среде, содержащей 3% казаминовых кислот и 0,5% дрожжевого экстракта при рН 7,6.

Клетки осаждают центрифугированием,

в супернатанте определяют экзотоксин. Пробы инкубируют в течение часа с сенсибилизированной ганглиозндами поверхностью лунок микроплат. Инкубацию с антнтоксиче- ской противохолерной сывороткой, разве5 денной 1:200, проводят в течение 18 ч при комнатной температуре. После промывания 0,05 М фосфатным буфером рН 7,2 в лунки добавляют по 0,2 мл раствора иммунофер- ментных конъюгатов в разведении Г. 150. Конъюгаты состоят из А-белка стафилококка

0 н пероксидазы. Реакцию учитывают через 30 мни после добавления субстрата - 0,003% перекиси водорода в 0,15 М NaCI и п-фенилендиамина. Чувствительность метода om.ELISA составляет в данной серии

5 опытов I нг/мл. В соответствии с установленной чувствительностью и подсчетом числа BbipocuiHx в процессе культивирования микробных клеток рассчитывают количество продуцируемого холерного токсина у исследуемого штамма КМ75. Штамм V. cholerae

30 RV31 продуцирует 0,0002 мг токсина на 1 л культурального фильтрата, а штамм V. cholerae КМ75, содержащий плазмиду рС0107- 2, - 12 мг токсина на 1 л культурального фильтрата (таблица).

35 Для проверки способности штамма продуцировать экзотоксин методом пассивного иммунного гемолиза колонии щтамма КМ75 переносят методом реплик на чашки с 1% синказным агаром, содерм ащим 1% отмытых в синказном бульоне эритроцитов барана. В качестве контроля на эти же чашки помещают исходный штамм RV31, а также высокотоксигенный штамм V. cholerae cholerae 569(В) Инаба. Посевы выращивают J8 ч при 30°С, заливают слоем 0,5% син45 казного агара, содержащего азид натрия, комплемент морской свинки и монорецеп- торную антитоксическую сыворотку и помещают в термостат (37°С). Через 1-2 ч наблюдают зону лизиса эритроцитов вокруг макроколоний, продуцирующих токсин во

50 внешнюю среду. Исходный штамм V. cholerae cholerae RV3I не продуцирует по этому методу из-за его более низкой чувствительности экзотоксин, поэтому зоны лизиса эритроцитов вокруг макроколоний отсутствуиот. Наличие больших четких зон лизиса эритроцитов вокруг макроколоннй штаммов КМ75 и 569(3) свидетельствует об интенсивной продукции ими токсина.

40

55

Определение продукции холерного токсина методом от, EL1SA

Испытуемый препарат

Концентрация токсина, мг/л

Фильтрат:

1.V. cholerae569B8.5

2.V. choleraeKM75/pCOI07-212.0

3.V.choleraeRV3l0.0002

Полученные в лабораторных условиях пробы экзотоксина, продуцируемого штаммом КМ75. испытывают на наличие холеро- генного эффекта иа крольчатах-сосунках по методу Датта н Хаб бу 10-12-дневным крольчатам весом 130-160 г внутрнкишечно вводят I мл экзотоксина. Контролем служит среда выращивания штамма Vibrio cholerae cholerae КМ75/рС0107-2. Учет результатов проводят через 24-48 ч. Положительный

холерогенный.эффект наблюдают лишь nfiH введении исследуемого экзотоксина.

Таким образом; сконструированный штамм V. cholerae cholerae КМ75/рС0107-2

серовара Огава продуцирует специфический холерный экзотоксин, секретируемый во внешнюю среду, и может быть использован в качестве производственного штамма для получения холерной вакцины холероген- анатоксин. а также синтетических вакцин,

применяемых для профилактики холеры, вызываемой вибрионом. Кроме того, он мо-, жет быть использован как пpoдyцeнf холерного экзотоксина, примеияемого для полу- чейня моноспецифической сыворотки.

15

Формула изобретения

Штамм бактерий Vibrio cholerae cholerae Ogawa, КМ75/рС0107-2. используемый для получения холериого токсина.

Похожие патенты SU1400075A1

название год авторы номер документа
Штамм бактерий VIвRIо сноLеRае сноLеRае серовара Инаба,используемый в качестве продуцента холерного токсина 1987
  • Смирнова Нина Ивановна
  • Ливанова Людмила Федоровна
  • Гинцбург Александр Леонидович
  • Янишевский Николай Витальевич
  • Вертиев Юрий Викторович
  • Ильина Тамилла Сергеевна
SU1460075A1
Штамм бактерий VIвRIо сноLеRае еLтоR Серовара OGaWa КМ 1446/рС0107-2, используемый для получения холерного экзотоксина 1986
  • Смирнова Н.И.
  • Ливанова Л.Ф.
  • Гинцбург А.Л.
  • Янишевский Н.В.
  • Вертиев Ю.В.
  • Ильина Т.С.
SU1412306A1
Штамм бактерий VIвRIо сноLеRае сноLеRае серовара Огава-продуцент холерного токсина 1987
  • Смирнова Нина Ивановна
  • Ливанова Людмила Федоровна
  • Гинцбург Александр Леонидович
  • Янишевский Николай Витальевич
  • Вертиев Юрий Викторович
  • Ильина Тамила Сергеевна
SU1456468A1
ШТАММ БАКТЕРИЙ VIBRIO CHOLERAE - ПРОДУЦЕНТ ХОЛЕРНОГО ТОКСИНА II ТИПА 2007
  • Щелканова Елена Юрьевна
  • Горяев Артем Анатольевич
  • Заднова Светлана Петровна
  • Смирнова Нина Ивановна
RU2326941C1
АВИРУЛЕНТНЫЙ ШТАММ БАКТЕРИЙ Vibrio cholerae КМ 262 БИОВАРА ЭЛЬТОР СЕРОВАРА ОГАВА - ПРОДУЦЕНТ ПРОТЕКТИВНОГО О1 АНТИГЕНА 2010
  • Стрельникова-Ааб Екатерина Николаевна
  • Ливанова Людмила Федоровна
  • Горяев Артем Анатольевич
  • Заднова Светлана Петровна
  • Смирнова Нина Ивановна
RU2425868C1
АВИРУЛЕНТНЫЙ ШТАММ БАКТЕРИЙ Vibrio cholerae KM 263 БИОВАРА ЭЛЬТОР СЕРОВАРА ИНАБА - ПРОДУЦЕНТ ПРОТЕКТИВНОГО О1 АНТИГЕНА 2010
  • Ливанова Людмила Федоровна
  • Стрельникова-Ааб Екатерина Николаевна
  • Заднова Светлана Петровна
  • Смирнова Нина Ивановна
RU2425867C1
ШТАММ БАКТЕРИЙ VIBRIO CHOLERAE KM 200 - ПРОДУЦЕНТ ХОЛЕРНОГО ТОКСИНА И ТОКСИН - КОРЕГУЛИРУЕМЫХ ПИЛЕЙ АДГЕЗИИ 2001
  • Смирнова Н.И.
  • Заднова С.П.
  • Топорков А.В.
  • Челдышева Н.Б.
RU2193598C1
Рекомбинантная плазмидная ДНК р1ЕМЗ, кодирующая синтез В-субъединицы холерного токсина, способ ее конструирования и штамм бактерий VIвRIо сноLеRае - продуцент В-субъединицы холерного токсина 1987
  • Ильина Т.С.
  • Смирнов Г.Б.
  • Смирнова Н.И.
  • Ливанова Л.Ф.
SU1505022A1
ШТАММ БАКТЕРИЙ VIBRIO CHOLERAE 2414 КЛАССИЧЕСКОГО БИОВАРА СЕРОВАРА ОГАВА - ПРОДУЦЕНТ ХОЛЕРНОГО ТОКСИНА И ТОКСИНКОРЕГУЛИРУЕМЫХ ПИЛЕЙ АДГЕЗИИ 2000
  • Смирнова Н.И.
  • Заднова С.П.
  • Топорков А.В.
RU2169187C1
ШТАММ БАКТЕРИЙ VIBRIO CHOLERAE КМ206 КЛАССИЧЕСКОГО БИОВАРА СЕРОВАРА ОГАВА - ПРОДУЦЕНТ ПРОТЕКТИВНЫХ АНТИГЕНОВ 2002
  • Топорков А.В.
  • Заднова С.П.
  • Смирнова Н.И.
  • Кутырев В.В.
RU2222594C1

Реферат патента 1990 года Штамм бактерий VIвRIо сноLеRае сноLеRае OGaWa, используемый для получения холерного токсина

Изобретение относится к медицинской микройнологии, а именно к получению штамма xo.iepHoro вибриона классического бис- пира серовара Огпва, продуцирующего холерный токсин во внешнюю среду. Цель изобретения - конструирование нового штамма ссроваря Ogavva, способного продуцировать спец.(|фическнй холерный экзотоксин в высоких концентрациях (до 12 мг/л). Штамм полу чен путем конъюгационного переноса коннтегратной плазмиды рС0107-2. содержащей клонированиые |-ены токсигенности (vct-rcHbi), от клеток ита.мма Е. соП P3-t78 pCOi07-2 клеткам штамма V. cholerae cholerae RV3I и последующего слбора клонов с .мплифицированнымн теи;;мн токсиген- нооти. Депониропан в коллгкиии Института «.Микроб под ипмс(юм КА 75/рС0107-2. Штамм может быть яcIlo.ч..(Jвaн для получения специфического холерного эндотоксина, который используют для но.чуюикя вакцины 1 табл. и монс)специфн геско1 | сыво 1огкн. о (Л

Формула изобретения SU 1 400 075 A1

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 1990 года SU1400075A1

Markel D
Е., Hejtmancik К
Е., Peterson I
W
et
al
«Characterisation of (he anti- genie determinants of cholera oxin subunits J
Infect, fmrnun., 1979, v
Видоизменение пишущей машины для тюркско-арабского шрифта 1923
  • Мадьяров А.
  • Туганов Т.
SU25A1
КЛАВИШНЫЙ АППАРАТ ДЛЯ РАЗВИТИЯ ТЕХНИКИ ПАЛЬЦЕВ ПРИ ИГРЕ НА СТРУННЫХ ИНСТРУМЕНТАХ 1922
  • Вульф А.А.
SU615A1
Mekatanos I
I
Duplication and amplification of toxin genes in Vibri Cholerae I
Cell., 1983, V
Скоропечатный станок для печатания со стеклянных пластинок 1922
  • Дикушин В.И.
  • Левенц М.А.
SU35A1
Печь для непрерывного получения сернистого натрия 1921
  • Настюков А.М.
  • Настюков К.И.
SU1A1
p
Прибор для измерения угла наклона 1921
  • Бризон Г.Д.
SU253A1
Джапаридзе M
Печь для непрерывного получения сернистого натрия 1921
  • Настюков А.М.
  • Настюков К.И.
SU1A1
Kapaeisa Л
П., Сумароков A
A и др
Оральная химическая на.к- цииа из токгигснного штамма V
cholerae - серовпра Огава
ЖМЭИ, 1979, 10, с
Способ крашения тканей 1922
  • Костин И.Д.
SU62A1

SU 1 400 075 A1

Авторы

Смирнова Н.И.

Ливанова Л.Ф.

Гинцбург А.Л.

Янишевский Н.В.

Вертиев Ю.В.

Ильина Т.С.

Даты

1990-08-30Публикация

1986-12-08Подача