4
О О О
ел
Изобретение относится к медицинской микробиологии, а имеиио к получению штамма холерного вибриона классического бно- вара серовара Огава. продуцирующего холерный 1ТОКСИИ во внешнюю среду.
Целью изобретения является конструирование нового штамма серовара Ogawa, способного продуцировать специфический холерный экзотоксин в высоких концентрациях.
Штамм V. cholerae cholerae содержит гибридную плазмиду рС0107-2, детерминирующую синтез холерного токсина. Штамм V. colcrae cholerae КМ75 получен путем конъюгативного введения в клетки Гипоток- снгенного штамма V. cholerae cholerae RV 31 ilv arg his Sir серовара Огава гибридной плазмиды рС0107-2, содержащей vct-оперон, детерминирующий синтез холерного токсина.
Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов Института «Л нкроб под номером КМ 75/рС0107-2 и характеризуется следующими призиакамн.
Культурно-морфологические признаки.
Подвижные, слегка изогнутые палочки, спор и капсул не образуют, грамотрица- тельные.
Штамм растет как на простых полноценных средах, так и на средах с добавлением 5 мкг/мл тетрациклина и 50 мкг/мл кана- мицина. На твердых питательных средах формирует гладкие, круглые серовато-голубоватые полупрозрачные колонии размером 1,0-1,5 мм.
Вызывает равномерное помутнение как простых жидких питательных сред, так и среде добавлением антибиотиков, через 18- 24 ч не образует пленки на поверхности бульона.
При выращивания на минимальной среде необходимо добавление нзолейцина, валина, аргинина и гистидина.
Физиологические свойства.
Ферментирует до кислоты без газа маи- нозу, сахарозу, маннит и мальтозу. Не ферментирует лактозу и арабинозу. Не лизирует эритроциты барана, не агглютинирует куриные эритроциты, не растет на щелочном агаре с добавлением 50 мкм/мл полимиксина.
Чувствителен к холерному диагностическому фагу С.
Агглютинируется до титра холерными сыворотками О (1:2000) и Огава (1:800).
Патогенные свойства.
Вирулентен для кроликов-сосунков в дозе. 10 м.кл./мл.
Пример. Высушенную ампульную культуру штамма V. cholerae cholerae КМ75 засевают на агар Хоттингера рН 7,6, содержащий 5 мкг/мл тетрациклина или 50 мкг/мл канамнцина, и инкубируют 18 ч при 37°С.
Для количественного определения холерного экзотоксина используют иммунофер
ментный метод omiELlSA. В качестве контроля и для определения чувствительности метода используют очищенный препарат холерного токсина. Клетки штамма КМ 75 5 в объеме 10 мл выращивают 18 ч при 30°С в 0,1-литровых колбах в среде, содержащей 3% казаминовых кислот и 0,5% дрожжевого экстракта при рН 7,6.
Клетки осаждают центрифугированием,
в супернатанте определяют экзотоксин. Пробы инкубируют в течение часа с сенсибилизированной ганглиозндами поверхностью лунок микроплат. Инкубацию с антнтоксиче- ской противохолерной сывороткой, разве5 денной 1:200, проводят в течение 18 ч при комнатной температуре. После промывания 0,05 М фосфатным буфером рН 7,2 в лунки добавляют по 0,2 мл раствора иммунофер- ментных конъюгатов в разведении Г. 150. Конъюгаты состоят из А-белка стафилококка
0 н пероксидазы. Реакцию учитывают через 30 мни после добавления субстрата - 0,003% перекиси водорода в 0,15 М NaCI и п-фенилендиамина. Чувствительность метода om.ELISA составляет в данной серии
5 опытов I нг/мл. В соответствии с установленной чувствительностью и подсчетом числа BbipocuiHx в процессе культивирования микробных клеток рассчитывают количество продуцируемого холерного токсина у исследуемого штамма КМ75. Штамм V. cholerae
30 RV31 продуцирует 0,0002 мг токсина на 1 л культурального фильтрата, а штамм V. cholerae КМ75, содержащий плазмиду рС0107- 2, - 12 мг токсина на 1 л культурального фильтрата (таблица).
35 Для проверки способности штамма продуцировать экзотоксин методом пассивного иммунного гемолиза колонии щтамма КМ75 переносят методом реплик на чашки с 1% синказным агаром, содерм ащим 1% отмытых в синказном бульоне эритроцитов барана. В качестве контроля на эти же чашки помещают исходный штамм RV31, а также высокотоксигенный штамм V. cholerae cholerae 569(В) Инаба. Посевы выращивают J8 ч при 30°С, заливают слоем 0,5% син45 казного агара, содержащего азид натрия, комплемент морской свинки и монорецеп- торную антитоксическую сыворотку и помещают в термостат (37°С). Через 1-2 ч наблюдают зону лизиса эритроцитов вокруг макроколоний, продуцирующих токсин во
50 внешнюю среду. Исходный штамм V. cholerae cholerae RV3I не продуцирует по этому методу из-за его более низкой чувствительности экзотоксин, поэтому зоны лизиса эритроцитов вокруг макроколоний отсутствуиот. Наличие больших четких зон лизиса эритроцитов вокруг макроколоннй штаммов КМ75 и 569(3) свидетельствует об интенсивной продукции ими токсина.
40
55
Определение продукции холерного токсина методом от, EL1SA
Испытуемый препарат
Концентрация токсина, мг/л
Фильтрат:
1.V. cholerae569B8.5
2.V. choleraeKM75/pCOI07-212.0
3.V.choleraeRV3l0.0002
Полученные в лабораторных условиях пробы экзотоксина, продуцируемого штаммом КМ75. испытывают на наличие холеро- генного эффекта иа крольчатах-сосунках по методу Датта н Хаб бу 10-12-дневным крольчатам весом 130-160 г внутрнкишечно вводят I мл экзотоксина. Контролем служит среда выращивания штамма Vibrio cholerae cholerae КМ75/рС0107-2. Учет результатов проводят через 24-48 ч. Положительный
холерогенный.эффект наблюдают лишь nfiH введении исследуемого экзотоксина.
Таким образом; сконструированный штамм V. cholerae cholerae КМ75/рС0107-2
серовара Огава продуцирует специфический холерный экзотоксин, секретируемый во внешнюю среду, и может быть использован в качестве производственного штамма для получения холерной вакцины холероген- анатоксин. а также синтетических вакцин,
применяемых для профилактики холеры, вызываемой вибрионом. Кроме того, он мо-, жет быть использован как пpoдyцeнf холерного экзотоксина, примеияемого для полу- чейня моноспецифической сыворотки.
15
Формула изобретения
Штамм бактерий Vibrio cholerae cholerae Ogawa, КМ75/рС0107-2. используемый для получения холериого токсина.
Изобретение относится к медицинской микройнологии, а именно к получению штамма xo.iepHoro вибриона классического бис- пира серовара Огпва, продуцирующего холерный токсин во внешнюю среду. Цель изобретения - конструирование нового штамма ссроваря Ogavva, способного продуцировать спец.(|фическнй холерный экзотоксин в высоких концентрациях (до 12 мг/л). Штамм полу чен путем конъюгационного переноса коннтегратной плазмиды рС0107-2. содержащей клонированиые |-ены токсигенности (vct-rcHbi), от клеток ита.мма Е. соП P3-t78 pCOi07-2 клеткам штамма V. cholerae cholerae RV3I и последующего слбора клонов с .мплифицированнымн теи;;мн токсиген- нооти. Депониропан в коллгкиии Института «.Микроб под ипмс(юм КА 75/рС0107-2. Штамм может быть яcIlo.ч..(Jвaн для получения специфического холерного эндотоксина, который используют для но.чуюикя вакцины 1 табл. и монс)специфн геско1 | сыво 1огкн. о (Л
Markel D | |||
Е., Hejtmancik К | |||
Е., Peterson I | |||
W | |||
et | |||
al | |||
«Characterisation of (he anti- genie determinants of cholera oxin subunits J | |||
Infect, fmrnun., 1979, v | |||
Видоизменение пишущей машины для тюркско-арабского шрифта | 1923 |
|
SU25A1 |
КЛАВИШНЫЙ АППАРАТ ДЛЯ РАЗВИТИЯ ТЕХНИКИ ПАЛЬЦЕВ ПРИ ИГРЕ НА СТРУННЫХ ИНСТРУМЕНТАХ | 1922 |
|
SU615A1 |
Mekatanos I | |||
I | |||
Duplication and amplification of toxin genes in Vibri Cholerae I | |||
Cell., 1983, V | |||
Скоропечатный станок для печатания со стеклянных пластинок | 1922 |
|
SU35A1 |
Печь для непрерывного получения сернистого натрия | 1921 |
|
SU1A1 |
p | |||
Прибор для измерения угла наклона | 1921 |
|
SU253A1 |
Джапаридзе M | |||
Печь для непрерывного получения сернистого натрия | 1921 |
|
SU1A1 |
Kapaeisa Л | |||
П., Сумароков A | |||
A и др | |||
Оральная химическая на.к- цииа из токгигснного штамма V | |||
cholerae - серовпра Огава | |||
ЖМЭИ, 1979, 10, с | |||
Способ крашения тканей | 1922 |
|
SU62A1 |
Авторы
Даты
1990-08-30—Публикация
1986-12-08—Подача