Изобретение относится к усовершенствованному способу получения пептидов, имеющих аминокислотную последовательность, определяющую биологически активный пептид или протеин, который может найти применение в биохимии и биотехнологии.
Цель изобретения - создание универсального способа получения пептидов.
Обработку соединения Н-Х-Рго-пеп- тид проводят в среде апг)отонного растворите.чя. Примерами апротонных растворителей могут cjryjKMTb; N-метилпирролидон(ОТШ), N.N-диметилформа- мид (ДМФА), диметилсульфоксид (ДМСО), причем наиболее предпочтительным является ММП.
Реакцию в апротонном растворителе проводят в слабокислых условиях с использованием уксусной кислоты. Процесс проводят в температурном интервале 25-50°С.
Выбор температуры реакции зависит от стабильности пептида и природы третьей кислоты в системе Н-Х-Рго- пептид. Предпочтительной является максимально высокая температура, со-
ел
со
00 ел
00
с/
ответствую1цая стабильности и природе третьего аминокислотного остатка.
Реакцию расщепления -перио/шчески контролируют, следя за ходом образования дикетопиперазина. При необходимости реакцию прерывают и получаемый в результате расщепления продукт выделяют из реакционной смеси с использованием известных методов.
Выбранные пептиды, используемые в качестве моделей для предлагаемого способа, получают методами твердофазного синтеза. Их чистоту подтверждают методом жидкостной хроматографии высокого разрешения. Перед расщеплением такие пептиды хранят в виде аморфных лиифилизированных твердых веществ. Число экспериментальны параметров изменяют (показано их влияние на реакцию расщепления).
Ниже приведены оптимизированные условия с использованием органическо и водной сред соответственно и их применение на пептиде Met-Pro-Gly- -Gly-HHj, где NH обозначает присутствие яй)идного фрагмента на С-окон- чании пептида.
Условия органического расщепления
10 мг Met-Pro-Gly-Gly-NH,2. растворяют в 1 мл №Ш, который обезвоживают хранением в течение недели над молекулярными ситами размером 4Л. Смесь выдерживают при 25 С при постоянном перемешивании и реакцию инициируют добавлением 0,33 М ледяной уксусной кислоты (НОАс). За ходом расщепления следят по образованию метионин-пролин-дикетопиперазина и исчезновению исходного пептида, анализируя эти величины методом обрати- мофазной хроматографии. Хроматогра- фическое определение проводят с использованием колонки размером 0,46х х25 см с U1trospere в 0,1%-ной трифторуксусной кислоте (ТФК), применяя в качестве элюента ацетонитриль- ный градиент. Во время каждого анализа реакцию останавливают путем десятикратного разбавления 0,1%-ным раствором ТФК. Дикетопиперазиновый пик собирают и его идентичность подтверждают a rинoкиv.лoтным и масс-спек ральным аналогзом.
В табл. 1 представлены данные по уровню образования дикетопиперазина при различных концентрациях кислоты в УСЛ1ЭВИЯХ расщепления, проводимого при 25° С в среде . Регистрируют замет(ю гкорость реакции и устанав0
5
0
5
0
5
0
5
0
5
ливают, что она зависит от концентрации слабой кислоты. При проведении аналогичной обработки в среде ДМСО установлено уменьпение скорости расщепления.
Как показано в табл. 2, увеличение температуры раси(епления до 40°С в среде ДМСО приводит к повышению скорости реакции до значений, сравнимых с теми, что достигаются в среде ЛМФА при 25°С.
Из табл. 1 следует, что оптимальная концентрация кислоты лежит в интервале 0,25 - 0,5 моль.
В табл. 3 представлены результаты исследования влияния температуры на серии пептидов, в которых изменяют только боковую цепь третьего остатка. Повьпценное стерическое затруднение на этом участке замедляет скорость реакции. Однако во всех случаях отмечается заметное расщепление. / Важным фактором является выбор апротонного растворителя. В качестве растворителя должно быть выбрано вещество, которое промотирует, и.чи по крайпей мере не ингибирует образование дикетопиперазина, что сопровождается расщеплением с образованием желаемого конечного продукта, и в то же время оказывает минимальное деградирующее действие на пептидный продукт.
В табл. 4 приведены данные по стабильности ряда протеинов и пептидов в условиях их органического расщепления, которую определяют методом обратимофазной жидкостной хроматографии высокого разрешения (HPLC), показано остающееся после воздсзйст- вия на выбранный протеин или пептид количество определенной реакционной среды в течение указанного времени и относительное преимущество по сравнению с ДМФА.
В табл. 3, аналогично табл. 4, представлены результаты по стабильности с использованием метионильного человеческого гормона роста.
В табл. 6 представлены результаты исследования влияния ряда раствори- ,телей на расщепление rtet-Pro-Gly-Gly- -NH.
Как следует из представленных данных, предпочтительными растворителями являются МШ, 1МФА и /C-ICO, представляющие собой апротонные органические растворители.
в табл. 7 приведены результаты исследования влияния температуры на ряд пептидов при использовании в качестве растворителя ДМФА или ЛМСО
Из табл. 1-7 следует, что ДМФА по сравнению с Д1СО оказывает большее влияние на образование дикетопипера- зина и сопровождаюп|ее его расщепление, однако, это соединение оказывает более сильное деградирующее действие на протеиновый или пептидный продукт. Для достижения оптимальных результа18586
желательным растворителем по крайней мере для данного применения.
Оптимальное водное расщепление Met - Pro - Gly - Gly -.NH достигается в результате растворения 1 мг пептида в 1М натрий-фосфатном буфере при рН 8,0. С целью ускорения расщеп24 ч под10
ления температуру в течение (Держивают равной 55 С. Степень рас- щепления определяют по предлагаемому способу для органического расщепления.
Условия водного расщепления. Опти
Изобретение касается получения пептидов, имеющих аминокислотную последовательность, определяющую биологически активный пептид или протеин. Цель изобретения - создание универсального способа. Последний включает расщепление пептида формулы H-X-PRO =пептид, где X-MET, LEU, SER, ASP, PHE
пептид - последовательность аминокислот телячьего панкреатического полипептида, фактора секреции гормона роста, A(SO3-)4-инсулин-А-цепь сульфонат, B(SO3-)4-инсулин-В-цепь сульфонат или проинсулин. Процесс расщепления ведут в слабокислой среде при 25-50°С и концентрации кислоты, например уксусной, 0,25-0,5 моль в апротонном растворителе - N-метилпирролидоне, диметилсульфоксиде, N,N-диметилформамиде, с образованием и расщеплением в момент образования дикетопиперазинового производного с получением пептида и дикетопиперазинового H-X-PRO -остатка. Эти условия позволяют расщеплять белок или пептид, имеющий остаток пролина, и осуществлению этого процесса не мешает присутствие в пептидной цепи метионина, лизина. 2 з.п.ф-лы, 12 табл.
тов следует установить хороший баланс g мальное водное расщепление Met - Pro Gly - Gly - NHj достигается в результате растворения 1 мг пептида в 1М натрий-фосфатном буфере при рН 8,0, С целью ускорения расщепления
24 ч поддержив выборе реакционных условий в отношении конкретного пептидного или протеинового продукта.
В табл. 8 представлены данные, полученные в результате применения условий органического расщепления на модельном пептиде, имитирующем предлагаемое соединение, в котором группа пептида представляет собой человеческий гормон роста. В последнем две первые аминокислоты представляют собой Phe - Pro. Таким образом, возникает возможность образования ди- кетопиперазина из фрагмента Х-Рго
20
температуру в течение
вают равной 55 С. Степень расщепления определяют по предлагаемому способу для органического расщепления.
В табл. 9 приведены значения вы- 25 хода расщепления при рН 7,0 с использованием в качестве субстрата пептида Met - Pro - Gly - Gly - NH.
Реакцию проводят при трех различных температурах с использованием
предлагаемого соединения и нахождения .JQ различных концентраций двух буферных
следующей формы дикетопиперазина из инициируюо;его фрагмента Phe - Pro, полученного в результате применения человеческого гормона роста.
В табл. 8 приводится сравнение Met - Pro - Phe - Thr - He - NHj с Phe - Pro - Thr - He - NH. Полученные результаты свидетельствуют о медленном образовании дикетопиперазина из последнего вещества.
Таким образом, условия обработки предлагаемого соединения Met - Pro - человеческий гормон роста могут быть точно установлены с тем, чтобы максимизировать первичное образование дикетопиперазина и сопровождающее его расщепление при минимальном вторичном образовании дикетопиперазина. В этом отношении ММП представляет собой наиболее желательный растворитель, поскольку в его присутствии уровень образования дикетопиперазина значительно выше, чем в случае ДМСО, и близок к значениям, достигаемым в ДМФА на поздних стадиях реакции. Учитывая повьш1енную стабильность гормона роста в NMIl по сравнению с ЛМФА (табл. 5), можно сделать вывод, что первое из указанных веществ является
35
40
45
50
55
солей. Полученные результаты показывают, что фосфатный буфер является предпочтительным по сравнению с ацетатным, причем наилучшие результаты обеспечивает концентрация 1,ОМ.
В табл. 10 представлены результаты исследования влияния рН на образование метионин-пролин-дикетопипе- разина из Met - Pro - Gly - Gly - N11 при 40°G в буферной водной среде. В качестве буферной соли применяют фосфат натрия. Полученные результаты свидетельствуют о предпочтительности щелочных значений рН. Поскольку такие нежелательные побочные реакции, как деамидирование и десульфурирова- ние, ускоряются при повышенных значениях рН, предпочтительным является рН 8.
В табл. 11 приведены резу.тьтаты изучения влияния различных буферных солей на степень рас 1Рпления Met - Gly - Gly - m при рН 8,0 и 40°С. Предпочтительным буфером является фосфат натрия.
В табл. 12 представлены результаты исследования влияния температуры на образование метионин-пролин-дике- топиперазина из ряда пептидов, в Kf
24 ч поддержи20
температуру в течение
вают равной 55 С. Степень расщепления определяют по предлагаемому способу для органического расщепления.
В табл. 9 приведены значения вы- хода расщепления при рН 7,0 с использованием в качестве субстрата пептида Met - Pro - Gly - Gly - NH.
Реакцию проводят при трех различных температурах с использованием
различных концентраций двух буферных
солей. Полученные результаты показывают, что фосфатный буфер является предпочтительным по сравнению с ацетатным, причем наилучшие результаты обеспечивает концентрация 1,ОМ.
В табл. 10 представлены результаты исследования влияния рН на образование метионин-пролин-дикетопипе- разина из Met - Pro - Gly - Gly - N11 при 40°G в буферной водной среде. В качестве буферной соли применяют фосфат натрия. Полученные результаты свидетельствуют о предпочтительности щелочных значений рН. Поскольку такие нежелательные побочные реакции, как деамидирование и десульфурирова- ние, ускоряются при повышенных значениях рН, предпочтительным является рН 8.
В табл. 11 приведены резу.тьтаты изучения влияния различных буферных солей на степень рас 1Рпления Met - Gly - Gly - m при рН 8,0 и 40°С. Предпочтительным буфером является фосфат натрия.
В табл. 12 представлены результаты исследования влияния температуры на образование метионин-пролин-дике- топиперазина из ряда пептидов, в Kf
торых изменяют только боковую цепь третьего остатка от N-окончания. Как и в случае исследования, результаты которого представлены в табл. 3, ясно, что усиление стерических затруднений на участке третьего остатка замедляет реакцию. Однако во всех случаях,кроме двух, наблюлается заметное расщепление, Повьшение температуры от 40 до 55 С заметно увеличивает скорость и степень расщепления всех четырех испытанных тетрапепти- дов.
Анализ продуктов, полученньпс в результате расщепления образцов пептидов и протеинов, проводят методами анионообменной и обратимофазной хроматографии высокого разрешения. Анионообменную хроматографию проводят на Мопс Q колонке с 0,05 М трис-буфе- ра, рН 8,0, содержащего 30% ацето- нитрила. Элюирование проводят с применением линейного градиента хлористого натрия. Анализ методом обратимо- фазной хроматографии осуществляют на колонке с Zorbax Cg, размер пор 150 Л с использованием ацетонитриль- ного градиента в 0,1 М фосфате аммония при 45 С и рН 7,0.
Предлагаемый способ позволяет расщеплять белок или пептид, имеющий остаток пролина, при этом его осуществлению не мешает присутствие в пептидной цепи метионина и лизина.
Образование метионин-пролин-дикетопиперазика из Met - Pro - Gly - NH, при 25°С
Формула изобретения Способ получения пептидов, имеющих аминокислотную последовательность, определяющую биологически активный пептид или протеин путем расщепления природных пептидов, отличающийся тем, что, с целью создания универсального способа, соединения общей формулы:
Н-Х-Рго-пептид,
5
0
5
0
5
где X - Met, Leu, Ser, Asp, Phe, пептид - последовательность аминокислот телячьего панкреатического полипептида, фактора секреции гормона роста, A(SO)4 -инсулин-А-цепь сульфонат, В (SO)-инсулин-В-цепь сульфонат или проинсулин, подвергают расщеплению в слабокислых условиях при 25-50 с и концентрации кислоты 0,25 - 0,5 моль в апротон- ном растворителе с образованием и расщеплением в момент образования дикетопиперазинового производного с получением пептида и дикетопиперазинового Н-Х-Рго-остатка.
Таблица 1
Образование метионин-пролин-дикетопиперазина из Met - Pro - Gly - NH, при 4П°С
Образование метионин-пролин-дикетопиперазина в 1М уксусной кислоте (ДОФА)
Пептид
Содержание компонента, %, при температуре, С
100 42 79 100
Таблица2
Таблица 3
Таблица 4
37 32 О 36
124 52 98 100
117 90 89 100
119 86 86 96
Телячий панкреатический полипептид РР (Met - Pro -).
GPF - Фактор секреции гормона роста (Met - Pro - ).
A(S07)4 - инсулин-А-цепь 5-сульфонат1
В(80 Г)2 -инсулин-В-цепь S-сульфонат j
Относительный процент остатка, определенный по отношению к необработанному внешнему контролю.
Таблица 5
Определяют методом обратимофазной HPLC. Определяют методом анионообменной HPLC.
Зависимость расходования Met - Pro - Gly - Gly - NH от образования Met - Pro - дикетопиперазина
Количество оставшегося исходного вещества. Определяют при ДО С.
Продолжение табл.4
Таблица 6
Та б л и ц а 7
Образование метионин-пролин-дикетопиперазина в двух выбранных растворителях в присутствии 1М НОАс при 40°С.
Таблица
Влияние различных буферных систем и их концентраций на образование метионин-пролин-дикетопиперазина из Met - Pro - Gly - Gly - NH при рН 7,0
Образование метионин-пролин-дикетопиперазина при 100°С измеряют через 2 ч, образование этого продукта при 40 и 25 С - через 72 ч.
-г--т
24
15153185816
Таблица
Влияние значения рН на образование метионин-пролин- дикетопиперазина в 1,0 М фосфата натрия при
IТаблица
Влияние различньк буферных солей на образование пролин-дикетопиперазина
из Met - Pro - Gly - r,ly - NHj pH 8,0 и 40°C
35 I
Образование метионин-пролин-дикетопиперазина при разных температурах в 1,0 М фосфатном буфере при рН 8,0
10
11
при
Таблица 12
| Переносная печь для варки пищи и отопления в окопах, походных помещениях и т.п. | 1921 |
|
SU3A1 |
| , Любке К | |||
| Пептиды | |||
| : М.: МИР, 1967. | |||
