Способ определения концентрации жизнеспособных спор бактерий Советский патент 1987 года по МПК C12G1/00 C12N3/00 C12N3/00 C12R1/125 

рпя

Изобретение отно логической быть использовано го определения жизг микроорганизмов в ратах.

Целью изобретенная щение способа и ности процесса

На фиг. 1 установки для на фиг, 2 - поглощения кислорода держивания после av 70°С в течение 10- зависимость скорости

ится к микробио промышле|нности и может

количественно еспособных спор р| аз личных препаявляется упро- сойращение длитель- определения. изображена

рсуще ствления

зaвиcи ость

(О

лорода спорами от при 60, 70 и 80°С; висимость скорости рода от концентрац1 и изменение силы ток

блок-схема

способа скорости от времени вы- тивации и при мин; на фиг. 3 поглощения кис ремени активации на фиг. 4 - за- поглощения кисло спор ; на фиг.5 во времени.

зав симости

Способ заключае 1|ся

Биомассу, в

центрации спор мик1: оорганизмов (0,1-1 г сухого

10 г пасты, или 10ной жидкости), дистиллированной вс)ды

Нижние пределы от чувствительности верхние определяются ности измерений пр поглощения кислоро;,а тарных для высокой роорганизмов,

следующем, от конв ней или 1г культураль- сусйендируют в 100 мл

концентрата

100

разведений зависят установки, а

снижением точ- высоких скоростя в ячейке, харак концентрации микПолученную суспфнзию низируют на микрои лучения однородной суспензии. При исп измельчителя РТ-2 : ществляют 1,5-2 ми) реактивируют путем сублетальной темпе; питательную среду i оптимальной для ро- Отбирают пробу, ус мостатируемую ячей: рость поглощения к: тывают концентраци: ных спор

спор гомоге- мельчителе до по- мелкодисперсной шьзовании микро- омогенизацию осу- . Затем споры прогрева их при атуре, вводят в ; вьщерживают при ixa температуре, анавливают в тер у, измеряют ско- cлopoдa и рассчи 0 (Т) жизнеспособмикроорга измов по формуле

де К Чог

.V(,J

эмпирическ

характериз

микроорган

скорость

рода.

1 )

й коэффициент, ующий культуру дзмов; пЬглощения кислоКоэффициент К определяют экспе- риментэльно. Для этого определяют титр одного образца микробиологическим способом и скорость поглоще6 ния кислорода V;

(oz

данным способом.

Коэффициент К рассчитывают по формуле , п .

;

К -- п

V

(oj

где п - количество образцов.

Данный способ может быть осуществлен для определения количества жизнеспособных спор различных видов мик- роорганизмов,.

Предлагаемый способ осуществляется на установке., представленной на фиг. 1.

Установка состоит из ячейки 1 с мембранными датчиками типа Кларка, полярографа 2, самописца 3, термостата 4 и магнитной мешалки 5.

К pa6o4eNry электроду термостати- руемой ячейки от полярографа подается напряжение, и после выдерживания суспензии реактивированных спор в ячейке в течение 20-30 мин при постоянном перемешивании магнитной мешалкой на самописце регистрируют зменение в ячейке силы тока, которое рямо пропорционально изменению кон- ентрации кислорода в образце.

Скорость поглощения кислорода в образце находят по формуле

35

V,

СО.)

.. ГОг

где о - концентрация кислорода в дистиллированной воде при услориях (температура,, давление) измерения/U ;

-В

1с значения силы тока для

контрольных растворов соответственно дистиллированной воды и бескислородного раствора (0,1 г сульфит натрия на 100 Mji воды), мкА;

45:

-

1 значения силы тока для

исследуемого образца соответственно в моменты времени /, и

Величина

А (константа 1, -1

чейки) характеризует чувствительность используемых датчиков ячейки к кислороду ,1

It((0. у скорость изменеС - о,

НИЯ силы тока в образце в единицу времени, которую находят из поляро- граммы, т.е.

Со.)

A-V

С помощью установки, описанной выше, была исследована зависимость скорости дыхания спор бактерий Bacillus thuringiensis от времени.

Выявленная зависимость скорости поглощения кислорода от времени активации представлена на фиг. 2.

Из представленных данных видно, что через 20 мин для различных образцов, независимо от времени активации наблюдается постоянная скорость дыхания .

Было исследовано влияние температуры и времени активации спор на скорость поглощения кислорода (фиг. 3). Установлено, что при активации спор при 60 С скорость поглощения кислорода достигает максимума через 50 мин нагрева.

Скорость поглощения кислорода при обработке спор при 70 С в течение 20-50 мин максимальная, при увеличении продолжительности более 50 мин отмечается снижение скорости погло- щения, что обусловлено гибелью части спор. Активация же спор при 80 С происходит быстрее, но уже через 10 мин клетки начинают гибнуть.

В связи с полученными данными оптимальными условиями активации спор бактерий Bacillus thuringiensis являются: температура 70 С-, время 20- 50 мин.

Было установлено, что максимальная скорость поглощения кислорода спорами пропорциональна конструкции клеток в исследуемом образце (фиг. 4

Пример 1. Концентрацию жиз- неспособных спор определяют в сухом препарате, полученном культивированием штамма Bacillus thuringiensis var dendrolimus 49-8. Для этого навеску концентрата (0,2 г) разводят в 100 мл дистиллированной воды, гомогенизируют на микроизмельчителе РТ-2 в течение 2 мин. Полученную суспензию прогревают в водяной бане при 70 С в течение 20 мин, затем охлаж

дают проточной водой.

В пробирку заливают 5 мл суспензи обработанных спор и 5 Ыл водной питательной среды, содержащей 0,9% NaCl, 0,9% глюкозы и 0,134% инозина. Полученную суспензию помещают в водяную баню и выдерживают 15 мин. Затем отбирают 1,5 мл суспензии, заливают в ячейку полярографа и через 10 мин (минимальное время выхо на

рабочий режим установки) записывают полярограмму-(рис. 5).

Рассчитывают концентрацию жизнеспособных спор следующим образом.

Находят значение силы тока в моменты времени сГ 21 мин; ,8 мкА; I.

б 25 мин;

,.0,4 мкА;

(0.)

где

0,8-0,4 , 1 , 0,1 мкА/мин

2,27 -10 0,,227. 10 м/мин;

2,2710 м/мкА - константа ячейки.

Ко 5ффициент К для спор бактерий 5 .Bacillus thuringiensis 49-8 равен (0,3510,04)- 10 кл-мин/м-мл; т:„

0,35 1о -2,27- ,9-10 кл/мл С учетом сделанных разведений

титр сухого концентрата Т

СПО

Р

в кон

центрате равен 79,2-10 кл/мг,

П р и м е р 2. Для определения концентрации жизнеспособных спор используют препарат из Bacillus thu- ringiensis штамм 98.

Для этого 1 г концентрата внесли в 100 мл дистиллированной воды. Дальнейшие операции повторили, как в примере 1 .

Экспериментально установлено, что коэффициент К для спор Bacillus thuringiensis № 98 равен 1,1710,08

XlO КГ МИН/МЛ М.

Из полярограммы контрольных растворов находят

1ц-т,..-0,936 мкА.

- 1ь-1с

По формуле А

находят

0

5

А

10

,-4

2,19

-4

10 м/мкА;

0,936

,09 мкА/мин (из полярограммы

Исследуемой суспензии J; 0,19 10 м/мин

Чог) Титр водной суспензии спор

,19-10- - 1,17--10 0,22 х10 кл/мл, при пересчете на сухой концентрат

0 с учетом разведений Т(.44-10 кл/мг. Пример 3. Исследовали споры Вас. subtilis, выращенные на косяках мясо-пептонного агара. Суспензию спор гомогенизировали и выдерживали в во5 дяной бане при в течение

15 мин для активации, затем охлаждали и разводили в отношении i:1 питательной средой следующего состава: 0,9 г NaCl+0,09 г глюкозы + 0,2 г

Ь-о6 аланина на 10 воды. Затем образе|ц статированную при графа, выдерживали ровали скорость по в образце.

Экспериментальн эффициент К для равен: ,58fO,04

Из полярограмм ров получено 1,-1 рограмм исследуемой

51

чл дистиллированной

помещали в термо- 20°С ячейку поляро- 25 мин и регистри- лощения кислорода

СП эр

э определенный коВас. subtilis 10 кл мин/мл м. контрольных раство- 0,9 мкА, Из поля- суспензии:

V. 0,04 1кА/мин

г, оЛ

to

.85

.,

турные данные.

Скорость поглощения образце равна:

Тог

2,85-10

.-4

0,9

-.С

-4

UO м - кисл

,0..0,,2соответственно Титр образца равен:

I

0,58 МО

х10 кл/мл.

Проверку корре1|яции определения титра вестным способами, биологическим, проводили ми. Для концентрата ringiensis для одюго повторностях опре;;еляли биологическим и бами.

Сравнительные нию концентрации бактерий Bacillus лярографическим и способами

представлены

0,12МО 7

результатов предлагаемым и из в частности микр„.„... двумя путяспор Вас. thu-

образца в сем

титр микро- пйедлагаемым спосо;;анные по определе ;визнеспособных спо thuringiensis по- микробиологически

в табл. 1.

Таблица 1

lO м/мин

л9

Т-10 . кл/мг по способу

0,24 0,24 0,23 0,24 0,22

предлагаемому

85,7 84,7 79,4 83,3 77,7

микробиологическому

70,2 89,1 80,3 63,5 78,0

Продолжение табл.1

±0,1 1

13,9

±8,01

25 Для спор Bacillus subtilis (три образца в двух повторностях) определяли титр микробиологическим и предлагаемым способами. Результаты экспериментальных данных приведены в

Таблица2

5

0

5

0,11 0,12 0,33 0,33 0,26 0,25

6,38

6,95

19,14

19,14

15,08

14,5

5,36

6,12

20,47

21,02

5,64

13,72

50 Данный способ позволяет в 15- 20 раз ускорить процесс определения концентрации жизнеспособных спор, снижает трудоемкость и исключает субъективность.

55

Формула изобретения

1. Способ определения концентрации жизнеспособных спор бактерий.

713

предусматривающий активацию спор путем вьщержки их в питательной среде в течение 15-30 мин и термообработки с последующим определением количе- ства спор расчетным путем, отлича ю щ и и с я тем, что, с целью упрощения способа и сокращения длительности процесса определения, перед выдерживанием спор в среде споры вносят в дистиллированную воду, го- могенизируют, термообработку спор осуществляют при сублетальной температуре в водной суспензии перед внесением в питательную среду, а после выдерживания в среде отбирают сус- пен зию спор и измеряют в ней скорость поглощения кислорода, а концентрацию жизнеспособных спор рассчитывают по формуле

10

(0.)

o,Y

где Т - концентрация жизнеспособных

спор, кл/мг;

К - эмпирический коэффициент, храктеризующий культуру, кл мин/м мл;

- скорость поглощения кислорода, м/мин. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем , что при определении количества жизнеспособных спор бактерий Bacillus thuringiensis в качестве питательной среды используют среду, содержащую 0,9% хлористого натрия, 0,09% глюкозы, 0,134% инозина, остальное - вода, а термообработку осуществляют при 69-7l C в течение 20-50 мин.

Изобретение относится к микробиологической промьшшенности и может быть использовано для количественного определения жизнеспособных спор микроорганизмов в различных препаратах, в частности энтомопатогенных. Цель изобретения - упрощение способа и сокращение длительности определения . Готовят суспензию спор в дистиллированной воде, гомогенизируют до получения однородной мелкодисперсной суспензии, прогревают при суб- летальной температуре 69-75 С, вводят в питательную среду, выдерживают 10-30 мин, отбирают пробу, устанавливают в термостатируемую ячейку по- лярографа, измеряют скорость поглощения кислорода и рассчитывают концентрацию (Т) жизнеспособных спор микроорганизмов по формуле: T K VjQ j где К - эмпирический коэффициент, характеризующий культуру микроорганизмов, кл-мин/мл м; (Ог скорость поглощения кислорода, м/мин. 1 з.п. . ф-лы, 5.ил., 2 табл. о с (Л со о 00 О5

срие.1

Vet

-if. мин

fffSO..

«3

«7

ff.20

/wi//y

/г w

Фиа

jit , цл

аг

те т. мин