Способ определения дегидрогеназ листьев чайного растения Советский патент 1987 года по МПК G01N33/48 C12Q1/26 

11

Изобретение относится к биохимии, а именно к способам изучения изо- ферментов, в частности к способам идентификации дегидрогеназ листьев чайного растения.

Цель изобретения - повышение информативности способа за счет одновременного определения шести дегидрогеназ.

Способ осуществляют следующим об- разом.

Частично очищенные препараты дегидрогеназ листьев чайного растения наносят на полиакриламидный гель и проводят электрофорез. После окончания электрофореза гели инкубируют в буферных растворах с рН 7,1+0,1 - 8,65+0,1 в зависимости от определяемой дегидрогеназы с субстратами, катализаторами и пиридиновыми нукле- отидами при 30-55°С. В качестве красителей используют нитросиний тетра- золий (нет) в присутствии феназинме- тальсуфата (ФМС).

Раствор нет готовится растворение в 1 мл воды 20 мг нет, раствор ФМе - в 1 мл воды 3 мг ФМе. Окращивание происходит при 30-35 е в течение 3 - 7 ч, после чего окрашенные гели фиксируются в 10%-ной уксусной кислоте.

Пример 1. Определение изоцит ратдегидрогеназы. Одним из известных способов получают суммарный препарат белков и ферментов на геле и для избирательного окрашивания изоцитратде гидрогеназы препарат помещают в кювету с раствором, содержащим:

Трис-Не1 буфер 0,05 М

рН 8,5, мл50

Изоцитрат натрия, мг 75

Mgei 2 (10%-ный водный

раствор), мл0,2

НАДФ, мг10

нет (20 мг на 1 мл

воды), мл2

ФМе (3 мг на 1 мл

воды.) , мл0,7

и выдерживают в термостате при З5 е в течение 3ч. Окрашенный препарат

фиксируют в 10%-ной уксусной кислоте

Пример 2 .Определение ксантин- дегидрогеназы. Одним из известных способов получают суммарный препарат

белков и ферментов на геле и для из бирательного окрашивания ксантинде- гидрогеназы препарат помещают в следующую среду:

5

5

О

5

0

5

Трис-Не1 буфер О,1 М рН 7,1, мл Гипоксантин 1 М, мл НА/Г, мг нет (20 мг на 1 МП

воды) , М.П

ФМе (3 мг на 1 мл воды), мл

50 3 30

2,0 0,7 течение 7 ч.

10%-ной уксус0

5

выдерживают при 35 е в после чего фиксируют в ной кислоте.

П р и М е р 3. Определение альфа- глицерофосфатдегидрогеназы.

еуммарный препарат белков и ферментов на геле помещают в кювету с раствором, содержащим:

Транс-Не1 буфер 0,1 М

рН 8,0, МП50

Альфа-глицерофосфат

натрия, мг65

НАД мг15

нет (20 мг на 1 мл

воды),

ФМе (3 мг на 1 мл

воды), мл0,7

выдерживают при З5 е в течение 7 ч, после чего фиксируют в 10%-ной уксусной кислоте.

П р и М е р 4. Определение лактат- дегидрогеназы, еуммарный препарат белков и ферментов на геле помещают в кювету с раствором, содержащим:

Фосфатный буфер О,1 М

рН 7,4, мл50

Лактат натрия 1 М, мл 5

Naei (10%-ный раствор),г 1

Mgei (10%-ный раствор),мл 0,2

НАД , мг15

нет (20 мг на 1 мл

воды), мл1,5

ФМе (3 мг на 1 мл

воды);мл0,7

вьщерживают при 30 е в течение 7 ч. После чего фиксируют в 10%-ной уксусной кислоте.

П р и М е р 5. Определение сорби- толдегидрогеназы. еуммарный препарат белков и ферментов на .-еле помещают в кювету с раствором, содержащим:

55

Транс-Не1 буфер О,1 рН 8,65, мл еорбитол, мг НАД, мг

нет (20 мг на 1 мл воды), мл

М

50

100

10

2,0

ФМС (3 м г н а 1 мл

воды), мл0,7

выдерживают при 35°С в течение 7 ч и фиксируют в 10%-ной уксусной кислоте.

Пример 6. Определение окта- нолдегидрогеназы. Суммарный препарат белков и ферментов на геле помещают в кювету с раствором, содержащим: Транс-НС буфер 0,1 М рН 8,5, МП50

Октанол, мл2

НАД мг25

нет (20 мг на 1 мл воды), мл2,0

ФМС (3 мг на 1 мл . воды), мл0,7

выдерживают 7 ч при и фиксируют в 10%-ной УКСУСНОЙ кислоте. Формула изобретения

Способ определения дегидрогеназ листьев чайного растения путем полуРедактор А, Ревин Заказ 1303/45

Составитель Н. Гуляева

Техред И.Попович Корректор Л.Патай

Тираж 777 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

9374 чения частично очищенного препарата ферментов, нанесения его на полиак- риламидный гель, проведения электрофореза с последующей инкубацией в среде, содержащей буферный раствор, субстрат, нитросиний тетразолий и фе- назинметасульфат и идентификацией ферментов по окрашенным полосам на

геле, отличающийся тем, что, с целью повышения информативности способа за счет одновременного определения шести дегидрогеназ, при инкубации используют буферные растворы с рН 8,5+0,1, 7,1+0,1; 8,0+0,1, 7,4+0,1; 8,65+0,1 и 8,5+0,1 для определения изоцитратдегидрогеназы, ко- антиндегидрогеназы, « -глицерофос- фатдегидрогеназы, лактатдегидрогена- зы, сорбитолдегидрогеназы и ок- танолдегадрогеназы соответственно .

Изобретение относится к биохимии, а именно к способам изучения ферментов и идентификации дегидрогеназ листьев чайного растения. Цель изоб- ретения - повышение информативности способа путем одновременного определения шести дегидрогеназ. Для этого частично очищенные препараты дегидрогеназ листьев чайного растения наносят на полиакриламидный гель, проводят электрофорез. После окончания электрофореза гели инкубируют в буферных растворах с рН 7,1+0,1 - 8,65+ +0,1 в зависимости от определяемой дегидрогеназы с субстрактами, катализаторами и пиридиновыми нуклеотида- ми при 20-55°С, В качестве красителей используют нитросиний тетразолий (ИСТ) в присутствии феназинметасуль- фата (ФМС). Раствор ИСТ готовят, растворяя в 1 мл воды 20 мг нет, раствор ФМС - в 1 мл воды 3 мг ФМС. Окра- ,. шивание ведут при 30-35 С 3-7 ч, пос- ле чего окрашенные гели фиксируют в 10%-ной уксусной кислоте. (Л со о 00 со о: