Способ получения противоопухолевого средства Советский патент 1987 года по МПК A61K39/00 

Изобретение относится к медрщине, а именно к фармацевтической пpo iьпц- ленности„

Целью Р:(зобретеиия является снижение побочных действий, проявляюпщхся при и радиотерапии.

Спос;об осуществляют следующим образом,

П р и м е р 1„ Получение клеточных стенок „

Жидкостное выращивание соответствующей пропионовой папочки осуществляют Е I-литровой колбе Эрленмейера при 37 С в анаэробных условиях,,

Для массового вырагдивания среду. например среду Diico, инфицируют густой взвесью пропионовых палочек Инфицирующую взвесь готову т путем растирания трехдневной А-агар-кз льтуры пропионовой палочки в 10 мл бульона После культивирования в течение 72 ч клетки отделяют от жидкости путем цептрифуг ирования при lOOOOg в течение 20 мин в центрифуге с охлаждением,, Ссадок промывают трилфы дистил лирован ой водой и затем смешивают с двойным объемом стеклянньк шариков диаметром 0,17-0,18 мм и из feльчaют в клеточной мельнице в течет ие 1- 1,5 ч. После микроскопического контроля ст еклянные шарики отделяют от roMoi ein-tsara с помощью G-1 стеклянно го (Ьильтра с помощью фосфатного буфера (1/15 MNa,,IlPO -2HyO и( М KI-UPO,).

Молочную суспензию (содержащую клеточ}1 |е стенки и цитоплазму) цент- рифуг ируют в течение 20 мин при 40000g я осадок растворяют i фосфатном буфере(рП 7,2) „

ЛЕтслитические фермеМть: инактиви- руют в течение 10 мин кипячением на водяной бане.

Клеточные стенки очио ают путем инкубапии при 37 С в течение 24 ч с помошью трипсина (0,5 мг/мл суспензии) и I мл толуола на 100 мл суспензии для тфедотвращения роста бактерий .

Очищенньге пуч ем трипсиниого переваривания клеточные стенки центрифугируют при 40000 g в течение 30 мин и промывают 3 раза дистиллированной водой затем высушивают вымораясива- ни ем.

+/А-бульон, г:

Bacto Casitom 12

Bacto yeast экстракт 12

5

0

5

0

5

0

0

КН.;Р044

MgSOv7H O1

Глюкоза4

Дистиллированная вода До 1000мл рН7,2

Для А-агараплюс 28 г Bacto агара. Фосфатный буфер 1/15 М х 2Н20 и 1/15 М растворяют каждый в 1000 мл дистиллированной воды, г раствора вторичного фосфата натриясмещивают с 388 г раствора первичного фосфата ка:г1ия и устанавливают рН 7 5 2,

П р и м е р 2, Приготовление суспензий Р, acnes (штамм АТСС 6919), , Р, on.iolum (штамм 0575, КР) и Р„ gra- nulosum (щтамм КР 45).

Лиофилизированные по примеру 1 пропионовые палочки указанного вида суспендируют в буферированном фосфатным буфером растворе поваренной соли указанного вида в концентрации 5,0 или 7,5 мг/мл. Полученная суспензия пригодна в основном для интранерито- н е алъной инъ е к ции.

П р и м е р 3„ Согласно примеру 2 готовят вводимые путем интрапери- тонеальной инъекции суспензии штамма Р. granulosum (КР 45, 95 К), щтамма Р. acnes (АТСС 6919) и штамма Р. oni- olum (0575, КР 40) лз лиофилизирован- ного материала с концентрацией 5 или 7,5 мг/мл клеточного материала

П р и м е р 4, Приготовление вво- инъекций суспензий для дополнительного лечения (обработки) при химиотерапии,

Штамм Р, granulosum (КР 45) готовят согласно примеру 1 Приготавливают суспензию 30 мг клеточного материала в 100 мл pacTBOj)a для внутривенного введения

Исследования ин виво.

1, Гемопоэз (кроветворение) у обработанных п эопионовымн палочками г-ышей после летального облучения.

Три штамма пропионовых палочек (Р„ acnes, Р. granuJ.osum, Р. oniolum) н ;;озе 1,5 мг на мьшш вводили путем интраперитонеальной инъекции летально облученным мышам (850 Р), При этом получили, что Р. granulosuin больше всего удлиняет время переживания облученнЕ 1х мьш1ей.

Используют взрослых самцов мышей штамма Swiss в возрасте 8 недель. Животных кормят по стандартной диете. Воды дают вдоволь, Воду и корм сте

рилнзуют. Вода содержит окситетра- цикдин (1 г на 1000 MJT) .

Мышей облучают во вращающейся ме- такрилатной клетке по 10 м11Ш1ей на клетку при удалении на 50 см от ТСХ 250 - Medicor-единицы, которая работает при 200 кВ и снабжена 0,5 мм Си-фильтром, 650 или 850 Р. Скорость олучения 75 Р/мин определяется СТтермолюминесцентного R-дозиметром.

Для экспериментов применяют штамм Р. ocnes (АТСС 6919), штамм Р. onio- lum (0575, КР 40) и штамм Р. granu- losum (КР 45) в форме умерщвленных целых клеток и в форме клеточных ста нок. Лиофилизированнь1е продионовые палочки суспендируют в фосфатбуферно растворе поваренной соли концентрацией 7,5 мг/мл и вводят путем инъекции 0,2 мл суспензии интраперитоне- ально (1,5 мг на мышь).

I

Исследование экзогенных селезеночных колоний.

За 3,2 или 1 день до трансплантации костного мозга мышам-донорам вводят путем инъекции 1,5 мг Р. granu- losutn. Готовят суспензию клеток костного мозга путем промывки обеих бедренных костей стерильной Parker- средой. Клетки подсчитывают в гемо- цитометре. 5-10 способных размножаться клеток в О,2 мл Parker-среды вводят путем инъекции в хвостовую вену каждой мыши. Мышей за 4 ч до трансплантации костного мозга облучают 850 Р. Контрольным мышам вводят путем инъекции 0,2 мл среды или 5-10 клеток костного мозга нормальных мышей (не обработанных Р. gra- nulosum). Другой группе мышей-доноров вводят как указано выше Р. gra- nulosum, затем животных анестезируют эфиром, из ретробульбарного сплетени берут кровь. Клетки крови подсчитывают в гемоцитометре и аликвотные части крови с 5 10 нуклеированных клеток вводят путем инъекции в хвостовую вену облученных дозой 850 Р мышей. Контрольные мьши получают такой же объем крови, который взят у нормальных мышей /не обработанных Р. granulosum). Всех мьшей умерщвляют спустя 9 дней после трансплантации крови или костного мозга и взвешивают, вынимают селезенку, снова взвешивают и определяют число колоний на селезенку после фиксации в смеси хлороформ - этанол 1:3.

to

15 20

47364

Исследование эи;ип-енн1,1х селс:и - нсзчных KOJioHuii.

За 3,2, 1 или (1 дней до облучения дозой 650 Р мьпнам интраперитоиеально вводят путем ин1зекиии Р. granulosum. Контрольные Mi-пии получают такой же объем PBS (буфер11роран 1ый (|)осфатом раствор повареяно; ; соли). Спустя 9 днеу после облучения животных умерщвляют и вынимают селезенку, взвешивают и подсчитывают колонии, как и в случае предыдущего теста, для определения экзогенных селезеночных колоний,

Тест на выживание.

Мышей разделяют

групп, причем

распределяют по 15 ышей на группу и облучают дозой 850 Р. Спустя 4 ч после облучения животиы ; вводят путем инъекции клеточные стенки пропионовых палочек и,ии целые клетки. Контрольные мыши получают такой :;е объем PBS. Количество переживших жИ1Вотнь Х в каждо группе подсчить вают на 10-й

день после облучения.

Все три iiponHotsoi bix Псшочек приводят по сравнению с кoIITpoJlь lы И животными к значительному удлинению промежутков переживания. Р. graniilosum в форме препарата из целых клеток и в форме препарата из клеточных стенок активнее, чем Р. acnes и Р, avio- lum.

В табл. 1 показано влияние Р, granulosum на эндогенные селсзс 0чпыс колонии ( КР 45) „

Относительпый вес селезенки облученных ышeй увеличивается только тогда, когда Р, granulosum вводят за 1 день или спустя 4 ч после облучения дозой 650 Р,

Число экзогенных селезеночных колоний значительно увеличивается в случае всех обработок.

В табл, 2 показано действие Р. granulosum на образование экзогенных селезерючных колоний (штамм КР 45.

„

Не установлено различия в относительном весе се,пезенки между мышами которым трансплантируют нормальный костный мозг и которым транспланти- РУют KOCTHbrii мозг обработанных P,gra- nulosurn за 2,3 или 1 день до трансплантации животных-доноров.

Обработка приводит к значительному снижению количества экзогенных

колонии в случае оолученяя животных дозой 850 Р по сравнению с животнь/ми которы1 -1 был введен костный Г юзг необработанных ;швотиых-донорс)в, Инъекция крови мытаейд которые обоаботаиы Р „ granulosum, летап)Но подопытным животным тфиводит к зЕшчительпому уве- лячени о относительног о веса селезенки и числа селезеночных колоний по сравнению с инъекцией крови из необработанных животных-доноров (ciM , табл,3)

Наиболее активной при стимуляции образонания селезеночных колоний является кровь, которую отбирают у мышей-доноров., кoтopь i за 2 или 3 дня до транс;гг антации крови вводя путем кнъект{ик Р,. granulosum. Лейкоцитоз в,случае трансгшантированной крови, после обработки Р granulosum за 3, 2 или дентз до взятия крови, повышается.

Активность Р, granulosum, Р, acnes, Р,. aviolum при эксггериментггль- ной онухоли Murine Загсогла--i 80 у ышей,

Все три вида указанньж пропионовых палочек вводят интргперитонеалтьно или в1-гутркопухолево (интратумораль- но) в нескольких дозах на 1 мг на мьппь,, Сп1и оказываются актив1;;ыми при замедлс;ми;-: роста и стимуля1ц-;и регрессии Sarccma-180 у CFW-мышей,, Кроме того, применение пропиоысвых палочек сызывает удлинение переживания мьплей с саркомой-1 80 „

Исследугг-( пропионовые палочки,,

Для экспериме1 тов используют штам;-. Propionibacterium granulosun: (КР 45), иг гамм PropLonibacteriuin acnes (АТСС 6919), штамм Propionibactei-iuiTi onio- luni 0575 КР 40, Указанные пропионовые палочки лкофилз-гзируют и суспетггдируют в фосфаг буферироваином раетЕоре поваренной соли в концентрации 5 мг/мл, 0,2 МП суспензии вводят интраперито- неально или внутриопухолево пораженным мышам.

Используют взрослых caMiiOB CFW- мышей, Опухоли индуцируют, вскрывают у мышей-доноров, опухолевую ткань разрубают, трипсршизируют ( трипсина. 5 мин при 37 С) м фильтруют Число клеток подсчитывают и устанавливают на 1 мл раствора поваренной соли до 0 способных размножаться клеток Oji мл. Эту суспек- зню вводят подкожно путем инъекции внутрилопаточно „ Этот способ работы

приводит к р;;ззт ТИН опухоли спустя примерно 4-5 д,пей, Быстрый pcci хсши нроисхо;:;ит между 4-м и 1 днем после трансплантации, причем летальгшш п;;ступает между 2.0-м и 28-м днем.

Испо.иьзовгт;о 225 самцов CFM-мышей, В тесте по переж гвгиию 105 мышей разделяют на 7 Г рунп (по 15 мышей на

группу) и животным экспериментальных групп 1-VI в дни О, 4, 8, 12 и 16 после имплант а;1ии опухолевых клеток вводят путем п{ъек11ии пропионовые палочки. Вводят путем инъекции P.granulosum, Р или Р„ acnes и траперитонеально (3 группы) или з1-:утриопухолево (3 группы) в дозе 1 мг/мышь. Контрольные мыши получают ивтранеритонеальные и.чи внутрионухолевые инъекции PBS« Число переживших лшвотных подсчитываЮ Т на 16-Й5 день после имплантации опухолевых клеток и затем ка/ядый второй день вплоть до 44-го дня после имплантаПИИ „ Оставшихся 120 животных разделяют па 8 групп и мышам экспериментальных групп (1-YI) и контрольных групп VII и VIII вводят путем инъекции пропионовые палочки PBS о

На 20-й день после имплантации опухолевых клеток всех мышей умерщвляют ; опухоли отсека эт и взвешивают. Среднее арифметическое и стандартные отклонения определяют для

группы, и все опухоли экспериментальных групп, которые лежат более, чем па 2 стандарт1Гь1х отклонения ниже среднего контрольЕюго значения, оценивают как регрессивные. Результаты

анализируют статистнч зски путем

;-теста (опухолевая масса) или Chi- Quadrat-aHajiHsa с помслдью Sates KOp- реки.ий (регрессия опухолей и переживание мьш1ей) Результаты представлены в табл „ 4,

В табл, 5 показано влияние пропио- новых палочек ка рост и регрессию саркомы-180 у СР лТ-мъппей.

При интрапер лтокеальном введении в разовой дозе 1 в случае трех испытанных штаммов пропионовых палочек получается значительное увеличение селезенки на

-и день после

инъекции с дшчьнеипятм увеличением массы селезенки на день.

Это увеличение сешезенки отражает стимуляцию ретикулезной системы и свидетельствует о противоопухолевой активности этих иммуностимуляторов .

Р. granulosum ведет к регрессии более чем 70% в случае исследованных опухолей саркома-180, когда он вво- дится внутриопухолево.

Ин виво цитостатическая активност в случае Murine опухолевых клеток благодаря Р. granulosum.

Изучают цитостатическое действие штамма Propionibacterium granulosum К 45 в случае саркомы L-1 у BAL В/с-мышей (легкие).

Отмечается значительная активност по сравнению с необработанными живот ными.

Антибактериальное действие как дополнительная обработка при химиотерапии первичной или вторичной опухоли легких,,

Выбирают 30 пациентов с первичным или вторичными метастатическимм опухолями легких. 10 пациентов путем внутривенного вливания получают 30 мг Р. granulosum в 100 мл раство- ра для внутривенного введения. Другие 20 пациентов являются контрольными.

Всех пациентов лечат химиотерапев тически для синхронизации пролифе- рации неопластических клеток. Каждый курс длится 3 дня. 1-й день: винкрус тин 1,5 мг внутривенно в 8 ч и в 20 ч; 2-й день: метотрексат 25 мг внутримьшечно в 20 ч; 3-й день: мето трексат 25 мг внутримышечно в 8 ч, также осуществляли введение мето- трексата внутривенно до 25 мг в 14ч и вливание 30 мг/кг циклофосфамида в то же самое время. Это химиотера- певтическое лечение осуществляют трижды 21 день,

Общая химиотерапия состоит из трех вьппеуказанных циклов, которые начинают на 1-й, 22-й и 43-й день.

Во время 3-го, 10-го, 31-го и 52-го дня наблюдения вводят Р. granulosum в дозе 30 мг/100 мл раствора для внутривенного введения в течение 15 мин (в последний день пер- вого химиотерапевтического цикла и затем спустя 1 неделю по окончании каждого цикла).

В случае обработа ;ных только хи- миотерапевтически пациентов обнаружено 5 случаев бактериальной инфекции Гтри пневмонии, один сепсис и 1 случай ангяны в течение бО-дневно- го времени наблюдения, в то время как в случае 10 обработанных с номо- щью химиотерапии и внутривенных введений (влнваний) Р. granulosum пациентов не обнаружено никаких симптомов бактериальной инфекции.

Толерантность пациентов по отношению к внутривенным вливаниям Р. granulosum штамма КР 45 хорошая. Во время вливания в количестве 30 мг Р. granulosum наступают ощущения холода и затем повьпиение температуры до 39 С (2-12 часов спустя пос.пе вливания), которые на следующий день исчезают.

Повторные вливання Р. granulosura не приводят к pasBiiTVM замедленной гиперповьЕпенной чувствительности в течение 60 диевного наблюдения. Внутривенное вливание 30-240 мг Р. granulosum - штамма КР 45 можно ос :)Тдест влять без риска новых побочных действий или осложнений у пациентов.

Общая инструкция для лока тьного введения (рак желудка и кишечника)

10 мг лиофилизированного продукта суспендируют в 1 мг 1%-ного раствора ксилокаина в растворе поваренной сол и вводят путем внутриопухолевой инъекции через кожт (диаметр 1 мм), причем применяется длиной 80 см жесткий полиэтиленовый отвод с прочно расположенной внутримышечной иглой (18 bauge) без эпифиза. Отвод через би- оптический канал вводят в эндоскоп (гастрофиброскоп или колоноскоп), причем пунктир тот (прокалывают) находящуюся под визуальным контролем неопластическую опухоль и иглу вводят на 0,5-1 см в опухолевую ткань. Продукт вводят путем инъеки 1И через отвод и промывают 1-2 ш 1%-ного ксилокаина в растворе поваренной соли.

Внутриопухолевые инъекции 10 мг продукта делают в течение первых Трех дней, затем на 10-й и 17-й день наблюдения.

т а б л и :;

Количество эндогенных селезепочь ых колоний у мышей, KOTOpiiie обиабота;-:ы ): ropioniba(:terium granulosum -- штамм КР 45 (среднее значение - стандартное

отклонение)

тамм

О т носи т е л ь и ый вес селеяенкк

Число эндогенных колоний селезенки

Контрол (650 )

Р, granulosum

за 3 дня до облучения

1,24 + 0,67

10,6 ± 4,45 8,17 ± 3,49 11,2 ± 5,30 14,1 ± 4,70

Табпица2

Количестяо экзогенных колоний после трансфузии костного мозга от обработанных i-, granv -Ойлт - штамм КР 45 мьш:ей (среднее значение ± стандартное отклонение)

i

Костный мозг мышейJ которые за 3 до трансфузии были обработаны Ро granulosum

Костньй ыозг мышей;, который за день до трансфузии были обрэ бота15Ь Р„ granulosiira

1,12 di 0,,2 ± 3,г

± 2,1А20А,0 ± 21,4

± 1,,0 ± 8р7

11,6 i 4, 116,0 ± 44.,2°

0,7 ± 4,3107,0 ± 43,3

Таблица 3

Число экзогенных селезеночных колоний после трансфузии крови от обработанных Р. granulosuin - штамм КР 45 мьппей (среднее значение ± стандартные отклонения)

Кровь нормальных мышей

Кровь мышей, которые за 3 дня

до трансфузии обработаны

Р. granulosum.

Кровь мышей, которые за 2 дня

до трансфузии обработаны

Р. granulosum

Кровь ьалпей, которые за 1 ден

до трансфузии обработаны

Р. granulosum

р 0,01 -р 0,05

,Таблица 4

Переживание пораженных саркомой-180 CFW-мышей при обработке пропионовыми палочками (1 мг/мышь) на 0-й, 4-й, 8-й, 12-й и 16-й день после имплантации опухолевых клеток

Введение

Деиь после имплантации опухолевых клеток

16 I 20 22 24 I 26 j 28 30 132 J34 J36 ГзВ J40 J42 44

Контроль

Р. granulosum

Иитраперитоне- альио Р-. acnes

t5 13 10 7

15 15 15 15 12 12 10 9 976533

НиTPanеритоне-

альио P. aviolum 15 15 15 15 15 lA 12 8 8 8 З . 5 2 1

Интраперитоне- ально P. granulosum

Внутриопухолево P. acnes

Виутриопухолево P. aviolum

Внутриопухолево

151515-14U131110 8 5440

15151515151513121197763

151515151514.1211 9 77752

1515151515151413 10 88643

1,41 ± 0,23 3,8 ± 2,2 1,17+0,28

2,62+0,88 9,16 ±1,4 1,84+0,31

3,45 ± 1,8; 10,2 + 2,6 2,0110,34

3,23 ± 1,48 7,4 + ,& 1,54+0,23

Т a б л и ц я 5

Масса опухоли и число рех редированиых опухолей в случае пораженных саркомой-180 мьплей, которые бьши обработаны пропионоЕыми палочками ( мг/ь-шпль) па 0-й, , 8-й, i 2-й и день после имплаь тации опухолевых клеток

Коптроль26311321 0/15

Р г о р i о г IL b а, с t е г i um

321 ОЛ5

73,3

032:381 6/15

i i26±il2, 5/15

Аид-) 842i:246 10/15

66,6

7311218 9/15

60,0