Способ определения катехоламинов в плазме крови и способ получения флюоресцентно меченого катехоламина Советский патент 1987 года по МПК G01N33/533 C07C91/34 

. Изобретение относится к биохимии и к химии получения новых флюоресцентно меченых соединений и может быть использовано для иммунофлюорес- центного определения катехоламинов в плазме крови.

Цель изобретения - повышение чувствительности определения катехоламинов за счет иммунофлюоресцентного определения при помощи флюоресцентно меченых катехоламиновi

На чертеже приведен калибровочный график зависимости поляризации флюоресценции при 516 нм (Р) от логарифма концентрации катехоламина,

Способ определения катехоламинов в плазме крови осуществляется следующим образом.

Раствор антител к катехох амину смешивают с пробой плазмы, затем добавляют в смесь катехоламин, меченый флюоресцеинизотиоцианатоМд реакционную смесь инкубируют при 20-30°С в течение 40-60 них, после чего определяют поляризацию флюоресценции реакционной смеси при 516 нм. По значению поляризации определяют количество .катехоламина в пробе.

Поляризация флюоресценции обратК 1 мл разведенной в AGO раз анти сьшоротки к адреналину добавляют 0 мкл пробы плазмы крови донора,Затем в смесь вносят мкл раствора,

5 содержащего 5 10 М адреналина, мече ного флюоресцеинизотиоцианатом, и инкубируют при 20 С в течение 40 мин Затем реакционную смесь переносят в кварцевую кювету, помещают в спект

0 рофлюориметр HitachiM-850 и определя ют поляризацию флюоресценции при 516 нм. При этом значение поляризации составляет , По измеренному значению поляризации флюоресценf5 дни, используя калибровочный график, рассчитывают количество адреналина в пробе, которое составляет х X 1 0- М.

Примерз. Определение дофа20 мина,

К 1 мл разведенной в 400 раз анти сыворотки к дофамину добавляют 10 мкл пробы плазмы крови донора. За тем в смесь вносят 5,5 мкл раствора,

5 содержащего 5-10 М дофамина, меченого флюоресцеинизотиоцианатом, и инкубируют при в течение 50 миН, Затем реакционную смесь пере носят в кварцевую кювету, -помещают

но пропорциональна логарифму концент- 30 в спектрофлюориметр Hitachi М-850 к рации катехоламина. Определение ведется по калибровочной кривой с использованием формулы

С 10 ед.с . 101,55,

- концентрация катехоламина; ,55 - коэффициент разведения

35 где С

101 пробы.

Пример 1 . Определение нора- дреналина,40

К 1 мл разведенной в 400 раз анти- сыворотки к норадреналину добавляют 10 мкл пробы плазмы крови донора, Затем в смесь вносят 5,5 мкл раствора,, содержащего 5-10 М нора,аренапи- 45 на,, меченого флюоресцеинизотиоцианатом, и инкубируют при 30°С в течение 60 мин. Затем реакционную смесь переносят в кварцевую кювету, помещают 0 слектрофлюориметр HitachiM-850 и 50 определяют поляризацию флюоресценции при 516 нм. При этом зна;чение поляризации составляет 0,165, По измеренному значению поляризации, используя калибровочный график рассчитывают 55 количество норадреналина в пробе,которое составляет 5,4-10 М,

П р и М е р 2. Определение адреналина.

определяют ноляризадию флюоресценции при 516 нм, При этом значение поляризации составляет ОдЗОО., По изме- ренному значению поляризации флюорес ценции, используя калибровочный график, рассчитывают количество дофамина в пробе, которое составляет 1,08 X 0 ®М.

Чувствительность ш гмунофлюорес- центного способа определения катехоламинов в плазме составляет М.

Способ полут- ения флюоресцентно меченого катехола1У1ина осуществляется следующим образом,

Катехоламии растворяют в обратном буфере рН SjO-IOgOj в раствор добавляют триэтилаг-тин и флюоресцеи- низотиоцианат так, чтобы молярное соотношение катехоламина триэтил- амина и флюоресцеинизотноцианата составляло 1:2:1, смесь инкубируют в течение 30-50 мин после чего выделяют целевой продукт с помощью тонкослойной хроматографии.

Пример 1, Получение флюоресцентно меченого норадреналина

О,, 1 ммоль норадреналина битартра- та растворяют в 1 мл боратного буфера рН 9,0. К этому раствору добавляК 1 мл разведенной в AGO раз анти- сьшоротки к адреналину добавляют 0 мкл пробы плазмы крови донора,Затем в смесь вносят мкл раствора,

содержащего 5 10 М адреналина, меченого флюоресцеинизотиоцианатом, и инкубируют при 20 С в течение 40 мин. Затем реакционную смесь переносят в кварцевую кювету, помещают в спектрофлюориметр HitachiM-850 и определяют поляризацию флюоресценции при 516 нм. При этом значение поляризации составляет , По измеренному значению поляризации флюоресцендни, используя калибровочный график, рассчитывают количество адреналина в пробе, которое составляет х X 1 0- М.

Примерз. Определение дофамина,

К 1 мл разведенной в 400 раз антисыворотки к дофамину добавляют 10 мкл пробы плазмы крови донора. Затем в смесь вносят 5,5 мкл раствора,

содержащего 5-10 М дофамина, меченого флюоресцеинизотиоцианатом, и инкубируют при в течение 50 миН, Затем реакционную смесь переносят в кварцевую кювету, -помещают

в спектрофлюориметр Hitachi М-850 к

определяют ноляризадию флюоресценции при 516 нм, При этом значение поляризации составляет ОдЗОО., По изме- ренному значению поляризации флюоресценции, используя калибровочный график, рассчитывают количество дофамина в пробе, которое составляет 1,08 X 0 ®М.

Чувствительность ш гмунофлюорес- центного способа определения катехоламинов в плазме составляет М.

Способ полут- ения флюоресцентно меченого катехола1У1ина осуществляется следующим образом,

Катехоламии растворяют в обратном буфере рН SjO-IOgOj в раствор добавляют триэтилаг-тин и флюоресцеи- низотиоцианат так, чтобы молярное соотношение катехоламина триэтил- амина и флюоресцеинизотноцианата составляло 1:2:1, смесь инкубируют в течение 30-50 мин после чего выделяют целевой продукт с помощью тонкослойной хроматографии.

Пример 1, Получение флюоресцентно меченого норадреналина

О,, 1 ммоль норадреналина битартра- та растворяют в 1 мл боратного буфера рН 9,0. К этому раствору добавляют 0,2 ммоль триэтиламина и 0,1 ммол флюоресцеинизотиоцианата, Полученную смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин и наносят на хроматографическую пластину Kieselgel, Разделение смеси осуществляют восходящей хроматографией в . системе метанол-уксусная кислота . 100:1. Полосу на хроматограмме, характерную для флюоресцентно меченого норадреналина, после высуживания пластины вырезают. Элюирование флюоресцентно меченого норадреналина с носителя осуществляют дистиллированной водой, подкисленной соляной кис- лотой до рН 2,0, Выход флюоресцентно меченого норадреналина составляет 26,3%.

.П р и м е р 2. Получение флюоресцентно меченого адреналина,

0,12 ммоль адреналина гидрохлорида растворяют в 1 мл боратного буфера рН 10,0, К этому раствору добав- ляют 0,24 Ммоль триэтиламина и 0,12 флюоресцеинизотиоцианата. Полученную смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 40 мин и наносят на хроматографическую пластину Kieselgel, Разделение смеси осуществляют восходящей хроматографией Б. системе метанол-уксусная кислота 100;, Полосу на хроматограмме, ха- рак;терную для флюоресцентно меченого адреналина, после -высушивания пластины вырезают, Элюирование флюо- ресцентно меченого а,дреналина с носителя осуществляют дистиллированной водой р .подкисленной соляной кислотой до рН 2,0, Выход флюоресцентно меченого адреналина составляет 27,0%

П р и м е р 3, Получение флюоресцентно меченого дофамина,

0,15 ммоль дофамина гидроклорида растворяют в 1 мл боратного буфера рН 9,5, К этому раствору добавляют 0,3 ммоль триэтиламина и 0,15 ммоль флюоресцеинизотиоцианата. Полученную

смесь инкубируют при комнатной температуре Б течение 50 мин и наносят на хроматографическую пластину Kieselgel. Разделение смеси осуществля- .ют восходящей хроматографией в системе метанол-уксусная кислота 100 : 1 .Полосу на хроматограммеI характерную для флюоресцентно меченого дофамина| после высушивания пластины вырезают, Элюирование флюоресцентно меченого дофамина с носителя осуществляют дистиллированной водой, подкисленной соляной кислотой до рН 2,О, Выход флюоресцентно меченого дофамина составляет 25,8%.

Формула изобретения

, Способ определения катехолами- нов в плазме крови путем обработки катехоламинов агентами, вызьшающими химическую модификацию с последующим определением флюоресценции, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, получают антитела к определяемому катехоламину, смешивают их с исследуемой пробой плазмы, затем добавляют флюоресцентно Me4eHbni катехоламин смесь инкубируют при 20-30 С в течение 40-60 мин, измеряют поляризацию флюоресценции при 516 нм и по ее значению определяют концентрацию кате- холамина,

2, Способ флюоресцентно меченого катехоламина, отличающийся тем, что, с целью получения флюоресцентно меченого катехоламина, растворяют катехоламин в обратном буфере с рН 9,0-10,0 до конечной концентрации 0,10-0,15 М, добавляют триэтиламин и флюоресцеини- зотиоцианат в молярном соотношении 1:2:1, инкубируют при 20-30 С в течение 30-50 мин и выделяют целевой продукт тонкослойной хроматографией.

-9,5 19 С

Изобретение относится к биохимии, касается способа определения и получения меченых соединений и предназначено для иммунофлюоресцентного определения катехоламинов. Цель изобретения - повышение чувствительности определения катехоламинов. Раствор антител к катехоламину смешивают с пробой плазмы.. Добавляют в эту смесь меченый катехоламин. Смесь инкубируют, Затем определяют поляризацию флюоресценции реакционной смеси и по значению поляризации определяют количество катехоламина в пробе. Поляри- зак;ия флюоресценции обратно пропорциональна логарифму концентрации катехоламина. При получении флюоресцентно меченого катехоламина его растворяют в боратном буфере. Затем в раствор добавляют триэтиламин и флюоресцеинизотиоцианат. Смесь инкубируют, Разделение -смеси осуществляют восходящей хроматографией. Элюиро- вание катехоламина с носителя осуществляют дистиллированной водой, подкисленной соляной кислотой. 2 с.п. ф-лы. 1 ил, SS СО О СП О О ро

Редактор В.Петраш

Составитель Н.Гуляева Техред А.Кравчук

Заказ 2249 : Тираж 776Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д,4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул,Проектная, 4

Корректор М.Шароши