Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к получению сайт-специфических эндонуклеаэ, предназначенных для создания реком- бинантных молекул ДНК, анализа первичной структуры ДНК, создания банков генов.
Целью изобретения является увеличение выхода сайт-специфической эн- донуклеазы С1а I и повьшение степени очистки ее от примесей,
Способ осуществляют следующим образом.
Приготовление носителя с иммоби- линованным цибакроновым синим F3GA. 20 мл сефарозы CL-4B суспендируют в 30 мл HjO, добавляют 110 мг красителя ЕЗСА, затем раствор А М NaCl до конечной концентрации 0,4 М, объем при этом доводят до 45 мл, После 20 мин механического перем,етивания смеси добавляют 0,2 мл 5 М NaOH и инкубируют при . Проверяют количество иммобилизованного красителя по уменьшению оптического поглощения надосадочной жидкости при 610 нм.. После завершения реакции несвязавший ся краситель отмывают на стеклянном фильтре дистиллированной водой до не чезновения синей окраски в промывных водах.
Выделение эндонуклеазы С1а I,
Бёсклеточный экстракт С. latum G, содержащий эндонуклеазу С1а I, L, наносят на колонку, содержащую носител с иммобилизованным красителем F3GA. Колонку промывают 10 мМ калийфосфат- ным буфером, содержащим О91 М WaCl до нулевого оптического поглощения при 280 нм и затем элюируют белки ли нейным градиентом 0,1-1 М NaCl в 10 мМ калий-фосфатном буфере, Эндону клеаза С1а I элюирует в области концентрацией NaCl 0,5-0,8 М.Фракции, содержащие фермент, объединяют, ди- ализируют 6-10 ч против буфера, содержащего 50% глицерина, и хранят
Редактор А.Купрякова
Составитель А.Макаров Техред м.Ходанич
Заказ 739Тираж 520Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР
по делам изобретений и открытий 113035, -Москва, , Раушская наб., д, 4/5
Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4
при -20 С, В полученном препарате определяют активность С1а I, содержание белка и нуклеиновых кислот.
Пример, Определение оптимального содержания иммобилизованного красителя.
Бесклеточный экстракт, содержащий С1а I, наносят на колонки с различным содержанием красителя F3GA и проводят выделение фермента. Зависимость выхода С1а I (на 1 г биомассы) от количества иммобилизованного красителя дана в таблице.
Формула изобретения
Способ вьщеления сайт-специфической эндонуклеазы С1а I, включающий получение бесклеточного экстракта С. lat, L, хроматографию его с-последующей эгаоцией целевого продукта раствором хлористого натрия, о т- личающийся тем, что, с целью повьшения степени чистоты и удельной активности делевого продукта, хроматографию экстракта осуществляют на сорбенте с иммобилизованным лигандом цибакроновым синим F3GA при содержании лиганда 0,9- 2,0 мкмоль/мл, сорбента, а элюцшо проводят в градиенте концентрации хлористого натрия.
Корректор л. Патай
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению сайт- специфических эндонуклеаз, предназначенных для создания рекомбинантных молекул ДНК, анализа первичной структуру ДНК, создания банков генов. Цель изобретения - увеличение выхода сайт-специфической эндонуклеазы Cla I и повышение степени очистки ее от примесей. Для этого готовят носитель с иммобилизованным цибарко- новым синим F3GA. Затем выделяют эн- донуклеазу Cla I. Бесклеточный экстракт С. latum G, содержащий зндону- клеазу Cla I о( наносят на колонку, содержащую носитель с иммобилизованным красителем F3GA. Колонку промывают 10 мМ калий-фосфатным буфером, содержащим 0,1 М NaCl до нулевого оптического поглощения при 280 им. Затем элюируют белки. Эндонуклеаза Cla I элюирует при. концентрации NaCl 0,5-0,8 М. Фракции, содержащие ферг мент, объединяют, диализуют 6-10 ч против буфера, содержащего 50% глицерин, хранят при -20°С. Б полученном препарате определяют активность Cla I содержание белка и нуклеиновых кислот. 1 табл. оо о С5 IsD 
| Mayer Н | |||
| et al., 1981, Nucl Acids Res, V | |||
| Разборный с внутренней печью кипятильник | 1922 |
|
SU9A1 |
| Приспособление для регулирования расстояния между формующей табак ленты и набивной ложечкой в папиросонабивных машинах | 1925 |
|
SU4833A1 |
