Способ получения сайт-специфической эндонуклеазы @ @ Советский патент 1984 года по МПК C12N15/00 C12N9/10 

Изобретение относится к микробиологии и касается способа получения сайт-специфической эндонуклеазы EcoRI. Рестриктазы широко используются в молекулярно-биологических, генно-инженерных и генетических экспериментах как уникальный инструмент для получения и анализа рекомбинантных ДНК, вьщеления индивидуал ных генов, картирования геномов прокариот, изучения первичной структуры ДНК. Использование рестриктаз основано на том, что эти ферменты являются сайт-специфическими, узнают и расщепляют в двунитевой ДНК определенные уникальные ную1еотидные последовательности - сайты. Первый фермент такого типа выделен в 1970 году Смитом и сотр 1 . В настоящее время вьщелено более 280 рестриктаз, узнающих 85 типов различных последовательностей нуклеотидов 2. В то же время успешное использование рестриктаз для получения рекомбинантных ДНК in vitro, встраивания в векторные молекулы, получения фрагментов ДИК и т.д возможно только в том случае, когда исполь зуемый способ выделения фермента обеспечивает отделение этого препарата от других, присутствующих в объекте рестриктаз. Одной из рестриктаз, наиболее широко используемы во всех видах молекулярно-биологических и генно-инженерных работ, яв.пяется рестриктаза EcoRI. Объектом для вьщеления рестрик тазы EcoRI служат клетки E.coli , содержащи гшазмиду RI, которая детерминирует синтез двух специфических эндонуклеаз (рестриктаз) EcoRI и EcoRI, имеющих родственные сайты узнавания. Рестриктаза EcoRI имеет 5 точек расщепле ния на ДНК фага лямбда и 1 точку расщепления на ДНК плазмиды pBR 322 и узнает уникальную шестичленную последовательность нуклеотидов 5. Оптимальными условиями для действия ре триктазы EcoRI являются высокая ионная сила и нейтральные значения рН. Сайтом узнавания для рестриктазы BcoRl| является четырехчленная последовательность нуклеотидов 5...ААТТ...З, Фермент имеет девять точек расщепления на ДНК плазмиды pBR 322 и более 20 точек расщепления на ДНК фага лямбда, наиболее активен в среде с низкой ионной силой при щелочных значениях рН, в присутствии гицерина и ионов Mh . Однако свежевыделенный фермент в высокой концентрации способен расщеплять субстрат как и рестриктаза EcoRI , в среде с высокой ионной силой при нейтральных значениях рН. Ввиду того, что сайты узнавания для реет-: риктаз EcoRI и EcoRI, частично совпадают, определение активности рестриктазы EcoRI в смеси ферментов EcoRI и EcoRI в следующих случаях невозможно. При совместном (одновременном или последовательном) воздействии на субстрат двумя или несколькими спевдфическими эндонуклеазами, одной из которых является рестриктаза EcoRI. Процедура совместного гидролиза субстрата различными рестриктазами широко используется в молекулярно-биологических экспериментах для картирования вирусных и плазмидных геномов, при определении первичной структуры фрагментов ДНК, при идентификации сайтов, узнаваемых рестриктазами. В таких экспериментах варьирует ионная сила среды, значение рН и набор катионов, вводятся стабилизирующие факторы типа глицерина, что в случае EcoRI и EcoRI , ферментов приводит к резкой активации EcoRI , рестриктазы и полному маскированию действия рестриктазы EcoRI за счет появления большого количества EcoRI -специфических фрагментов ДНК. Появление EcoRI -специфических фрагментов ДНК имеет место при использовании свежевыделенного ферментного препарата. В этих случаях рестриктаза EcoRI , как и ресгрикгаза EcoRI, способна гидролизовать субстрат в среде с высокой ионной силой при нейтральных значениях рН. Из сказанного следует, что получение рестриктазы EcoRI, свободной от сопутствующего фермента E.coRl , является обязательным условием всестороннего использования рестриктазы EcoRI в молекулярно-биологических работах. Способы получения рестриктаз традиционны. Получение рестриктазы EcoRI состоит из ряда этапов: накопление бактериальной массы, разрушение клеток, получение грубого экстракта, освобождение от нуклеиновых кислот, высаливание, катионообменная хроматография на фосфоцеллюлозе рН, анионообменная хроатография на ДЕАЕ-целлюлозе, адсорбционая хроматография на гидроксиапатите, афунная хроматография на ДНК-целлюлозе, стабиизирующий диализ 3. Однако ионообменники и адсорбенты облаают незначительной емкостью, в результате его значительная часть материала либо не вязывается с обменником, либо связывается еспецифически и обнаруживается в оттекающей идкости или при промывке обменника месте с балластным белком, нуклеазами и ротеазами. Такой материал загрязнен, нестаилен и в дальнейших экспериментах не исользуется. Причем разрешающая способность нионообменников и адсорбентов недостаточна для белков со скодными физико-химическими свойствами, а использование афишюй хроматографии не обеспечивает фракционирования белков, обладающих близким сродством к субстрату. Таким образом, указанные типы колоночной хроматографии не обеспечивают разделения специфических эндонуклеаз EcoRI и EcoRl. Предлагаемый способ исключает использовакие ионообменной и адсорб1ионной хроматографии, заменив ее двустадийным фракцио-. нированием. На афинном сорбенте -- голубой сефарозе и изоэлектрофокусированием на амфолинах в градиенте рН и плотности гпицерина. Способ хроматографии на голубой сефарозе является оптимальным на первой стадии ОЩ1СТКИ рестриктирующих эндонуклеаз, так как позвояяет фракционировать ферменты непосредственно из трубого экстракта, исключив традиодонные стадии осаждения нуклеиновых кислот и высаливания белков. Высокая емкость и разрешающая способность голубой сефарозы дают возможность провести с высокой эффективностью очистку фермента от неспецифических нуклеаз из любого заданного кнличества бактериальной пасты. Разделение белков методом изоэлектрофоку сирования основано на способности белков мигрировать в условиях электрофореза в зону рН, соответствующую изоэлектрической точке (ИЭТ) данного белка. Поскольку значение ИЭТ является уникальной характеристико каждого белка, то различные белки отличаютс друг от друга по этому признаку. Высокая разрешающая способность метода иэоэлектрофокусирования позволяет разделять белки, зн чение ИЭТ которых различается на 0,2 ед рН Прищщп фракционирования при условии правильного подбора крутизны градиента обес почивает высокую степень концентрирования индивидуального белка в узкой зоне, высоку емкость колонки, эффективное отделение от балластных и интерферирующих ферментов, высокую чистоту полученного препарага.Выход белка значительно превыщает таковой по сравнению с другими видами колоночной хроматографии, так как процедура исключает потери за счет материала, не связавшегося с обменником или адсорбентом. Использование изоэлектрофокусирования обеспечивает отделение специфической эндопуклеазы Есо RI от специфической эндонуклеазы EcoRI , а также от интерферирующих ферментов - неспецифических эндо- и экзонуклеаз. Изоэлектрофокусирование проводится в градиенте плотности . глицерина,. что позволяет опустить обычную гГри выделении рестриктаз заключительную стадию стабилизирующего диализа с сохранением активности рестриктазы BcoRI в течение года. Целью изобретения является повыше1ше чистоты эндону1.-леазы EcoRI. Цйть достигается тем, что согласно способу получения сайт-специфической эндонуклеазы EcoRI, включающему культивирование штамма E.Coli R V 13, разрушение клеток, очистку фермента, очистку фермента ведут путем хроматографии субстрата на голубой сефарозе с последующим изоэлектрофокусированием при рН 3,5-10 в градиенте плотности глицерина 0,1-60% и отбором фракций при р1 7,7-8,0. Пример 1. Штамм E.coli RY 13 выращивают на бульоне Хоттингера до начала . стационарпо11 фазы. Клетки осаждают центрифугированием. Выход биомассы по сырому весу 30 г/л. Затем клетки суспендируют в рабочем буфере с рН 7,6, содержащем 0,02 М трис-НСК ионы Mi и /3-меркаптоэтанол, и разрущают на ультразвуковом дезинтеграторе. Обломки клеток удаляют центрифугированием в течение 1 ч при 105000 «1, . Объем недосадочной жидкости доводят до 100 мл рабочим буфером и наносят на колонку. размером 1,2x20 см с голубой сефаразой 4 В (Pharmacia), уравновешенную тем же рабочим буфером. Колонку промывают двумя объемами буфера и фермент элюируют линейным градиентом концентрации NaCl 0,1-1,0 М. Фракции, содержащие активность EcoRI, элюируют 0,35- 0,6 М Nad, объединяют и обессоливают диализом против 0.001 М трис-НС1 буфера, содержан1его 7 мм /з -меркаптоэтанол и 0,5%-ньш тритон. Полученный материал подвергают изоэлектрофокусированию на колонке с ным амфолином в градие 1те плотности глицерина О 1 - 60.. Клетки E.coli RY 13 выращивают в течение 5 ч до стационарной фазы роста, центрифугируют при 5 тыс об/мин, полученную бактериальную массу разрущают с помощью ультразвукового дезинтегратора. Озвученный экстракт подвергают высокоскоростному центрифугированию при 105000 в течение 90 мин. Недостаточная жидкость представляет собой грубый экстракт, который далее подвергают хроматографии на голубой сефарозе. Изо электрофокусирование фракций, содержащих активность EcoRI, проводят на колонке с амфолинами в диапазоне рН 4,0-6,0 в условиях градиента плотности глицерина 60-0,1%. Изоэлектрофокусирование ведут 16 ч при 600 V и затем 48 ч при 1000 V. В результате изо электрофокусирования в таком диапазоне рН 4,2-4,5 обнаруживается пик активности ficoRl , а пик активности Есо RI отсутствует Пример 2. Выращивание клеток, ра рушение клеток, полз чение грубого экстракта и фракционирование на голубой сефарозе ведут по примеру 1. Изоэлектрофокусирование фракций, содержащих активностью EcoRI, про водят на колонке с амфолинами в диапазоне рН 3,5-10 в условиях градиента плотности глицерина 60-0,1%, Изоэлектрофокусировшше ведут 16 ч при 600 V и затем 48 ч при 1000 V. Активность рестриктазы EcoRI присутствует во фракгйях 21-25 градиента, что соответствует изоэлектрической точке белка р1 7,85. Пик активности EcoRI обнаруживается во фракциях 2-6, что соответствует изоэлектрической точке белка р1 4,35. Пример 3. Выращивание и разруше.ние клеток, получение грубого экстракта и фракционирование на голубой сефарозе ведут по примеру 1. Изоэлектрофокусировани фракций, содержащих активность EcoRI, прово дят на колонке с амфолинами в диапазоне рН 3,5-10 в условиях градиента плотности глицерина 60-0,1% в течение 72 ч при 600 V В градиенте обнаруживаются размытые перекрывающиеся пики i EcoRI и EcoRl .активности. Для стандартной процедуры выделения фер мента выбран пример 2. Фермент EcoRI, свободртый от Активности EcoRI , обнаруживается в пяти фракциях 18-22 градиента в диапазоне рН 7,0-8,0 в присутствии 20%-ного глицерина. Предлагаемый способ характеризуется тем, что Изоэлектрофокусирование является единственным методом, с помощью которого можно получить рестриктазу EcoRI, свободную от активности EcoRI . Предлагаемый способ позволяет за 6 дн. пол)шть концентрированный фермент EcoRI с высоким выходом 30000 ед. активности на 1 г пасты. При традиционном способе получения рестриктазы EcoRI из 1 г пасты за 9-10 дн. обработки вь деляЮт 30000. еД. суммарной активности EcoRI и EcoRI ферментов. Активность EcoRI тестируется во фракциях, содержащих 20%-ный глицерин, чтр позволяет исключить стадию стабилизирующего диализа. Ферментный препарат хранится при -10° в течение 12 мес без потери активности. Активность фермента определяют в инкубационной смеси следующего состава: О, М трис-IiCl буфер рН 7, 4, 10 мм 1 мм /5-меркаптоэтанола, 1 мкг ДНК фага лямбда. Инкубацию ведут при 37С I ч. Реакцию останавливают добавлением 5 мкл 50%-ного глицерина с 100 мм ЭДТА и 0,5%-ного бромфенолового синего. Рестриктазную активность тестируют с помощью вертикального электрофореза в агарозном геле. Гель окрашивают раствором этидийбромида в концентрации 3 мкг мл в течение 20 мин и фотографируют в ультрафиолетовом свете при 254 нм с красным светофильтром. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое .для полного расщепления 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 1 ч. Всего из 10 г биомассы получено 300000 ед. активности. Пригодность полученного фермента для структурных исследований ДНК и опытов по конструированию in vitro реаомбинантных молекул ДИК определяют следующим образоР. Освобождение препарата фермента EcoRI от специфической эндонуклеазы HcoRl определяют при инкубации полученного фермента с ДНК фага лямбда в среде, оптимшгьной для проявления EcoRI-активности. Состав инкубационной среды: 0,025 М трио-НСI, 0,002 М MijClj, рН 8,5. Отсутствие неспецифических эндонуклеаз определяют при 6-ти часовой инкубации репликативной формы ДНК фага X 174, не имеющей сайта узнавания «для фермента EcoRI, с 10-ти кратным избытком препарата фермента, далее анализируют электрофоретическое поведение суперспиральной молекулы ДНК. Отсутствие зкзонуклеаз и фосфатаз в предарате фермента определяют по эффективности лигирования линейной формы плазмиды РВР-322, полученной в результате действия на кольцевую- молекулу этой. ДНК исследуемым ферментом, имеющим один участок узнавания на ДНК плазмиды РВ R 322. Лигирование осуществляют с помощью ДНК-лигазы бактериофага Т4. Препарат рестриктазы EcoRI, полученный предлагаемым способом, не содержит примеси EcoRI активности, о чем свидетельствует полное отсутствие фрагментации ДНК фага лямбда в условиях, оптимальных для проявления EcoRI активности:, в низкой ионной силе при щелочных значениях рН, когда фермент EcoRI не активен. Препарат фермента coRI свободен даже от следовых неспецифических эндонуклеаз, о чем можно судить о полному сохранению суперспирализованной труктуры репликативной формы ДНК фага 174. Отсутствие неспецифических эндонукеаз и фосфатаз. подтверждается высокоэффекивным лигированием линейной молекулы ДНК В 322 после расщепления ее полученным ерментом. Правильность восстановления ольцевой формы плазмидной ДНК подтвержается повторным гидролизом рестриктазой coRI с образованием линейной формы.

7П 20019-8

Таким образоК|, предлагаемый препаратколонках вместо 3-5 обычных, минуя предфермента может быть использован в экспери-варительное высаливание ,и освобождение от менте по генетической инженерии и структур-нуклеиновых кислот), уникальная чистота ных исследованиях. Полученный препаратфермента и высокая удельная активность позфермента (специфическая эндонуЛлеаза рестрик- 5воляют более широко иснользовать этот ции EcoRI) превосходит лучшие образцы зару-фермент как укикаттьный инструмент в молебежный коммерческих препаратов ферментов дан-кулярно-биологических, reimo-инженерных и него класса по очистке от рестриктазы ЕсоР ,а так-структурных исследованиях для выделения же по удельной активности и выходу фермента.индивидуальных генов, промоторных. областей,

ТаЛим образом, простота выделения10маркерных зон; а также для получения рекомфермента (две стадии фракнионир(5вш1ия набинантных ДНК.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ ECO Rl, вклюнающий культивирование штамма Ё-СоП RY 13, разрушение клеток, очистку фермента, о т личающийся тем, что, с целью повышения чистоты эндонуклеазы Е.со RI, очистку фермента ведут нутем хроматографии субстрата на голубой сефарозе с последующим изозлектрофокусированием при рН 3,5-10 в градиенте плотности глицерина 0,1-60% и отбором фракций при р1 7,7-8,0.