Штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI RFL - продуцент рестриктазы Е со 105I Советский патент 1991 года по МПК C12N9/14 C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой штамм, продуцирующий сайт-специфическую эндонуклеазу Е со 105 I, используемую как инструмент для получения фрагментом ДНК, картирования молекул ДНК и конструирования векторных молекул ДНК.

Цель изобретения - получение штамма Escherichia coli RFL ВКПМ В-4500 (105) - продуцента рестриктазы, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5 TACGTA, с высокой активностью.

Штамм Escherichia coli RFL 105 характеризуется следующими признаками.

Морфологическиег клетки палочковидные, окрашенные фуксином клетки располагаются поодиночке, -попарно или в коротких цепочках, грамотрицателъны. Неподвижны.

Культуральные: на питательном агаре чер-ез 18-20 ч. роста образуют круглые, с ровным краем, блестящие, бело- сероватые колонии. При росте на питательном бульоне вызывают равномерное помутнение.

Физиологические и биохимические: -факультативный анаэроб, температурный оптиум 37°CS рН среды 6,8-7,3. Ферментирует до кислотообразования глюкозу, сахарозу и лактозу. Не образует сероводород, образует индол. При росте не усваивает мочевину, на среде Симонса не растет.

Штамм хранится в лиофильно-высу- шенном состоянии-и на мясопептонном агаре под слоем стерильного вазелк нового масла.

Для культивирования E.coli RFL 105 применяют питательную среду елеО

со

ОС

дующего состава, г/л дистиллированной воды:

Пептон ферментативный 10,0 Дрожжевой экстракт 5,0 NaCl10,0

рН7,0-7,2

Культивирование 1 проводят при температуре 37°С, рН 6,8-7,3, с хоробирают посредством центрифугирования на проточной центрифуге типа НЕПЛ (ФРГ) при 23000-25000 об/мин, фасуют ее и хранят при -20±2°С. Урожай клеток составляет 2,7-3,5 г влажной биомассы с 1 л питательной среды.

Пример 2. Выделение сайт- специфической эндонуклеазы рестрик

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано как инструмент для получения фрагментов ДНК, картирования молекул ДНК и конструирования векторных молекул ДНК. Цель изобретения - получение штамма Escherichia coli RFL ВКПМ В-4500 (105) - продуцента рестриктазы, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5 TACGTA, с высокой активностью. При культивировании на питательной среде, содержащей, г/л дистиллированной воды: пептон ферментгт вный 10,0; дрожжевой экстракт 5,0; КяС1 10,0; рН 7С0- 7,2 до конца фазы экспоненциального роста получают бактериальную массу с выходом 2,7-3,5 г с 1 л среды. Из 1 г биомассы получают 2000 ед. рестриктазы Е-со 105 I. 1 табл. «

шей аэрацией до выхода клеток в п

нюю логарифмическую фазу роста.

Штамм Escherichia coli KFL 105 продуцирует в высоких количествах рестриктазу К со 105 I, узнающую и расщепляющую последовательность

нуклеотидов 5 TACGTA.

Рестриктаза характеризуется следующими свойствами: узнает и расщепляет последовательность нуклеотидов 5 ТАСьТА в молекуле ДНК; оптимальное значение рН для действия рестриктазы 7,8-8,0; оптимальная температура действия 37-38°С, для активности рестриктазы требуются ионы опти- мальная концентрация 3-5 мМ.

Пример 1. Получение биомассы E.coli RFL 105.

Для получения биомассы Escherichia coli RFL 105 используют лабора- торный ферментер Биолафит (Франция рН-метр, термостат, круговые качалки спектрофотометр СФ-26, лабораторную центрифугу типа ЦЕПА (ФРГ), бокс ламинарный, автоклав, дистиллятор.

Глубинное культивирование бактерий проводят на питательной среде (РН 7,3) следующего состава, г/л г / Пептон ферментативный 10,0

Дрожжевой экстракт 5,0

NaCl10,0

Вода дистиллированная Остальное

Инокулят готовят в колбы с 250 мл питательной среды из расчета 0,1- 0,2% суспензии бактерий, полученной при выращивании в 5 мл мясопептон- ного бульона в течение 3-4 ч (засеяно бактериологической петлей), Ночной инокулят в объеме 500 мл засевают в лабораторный ферментер емкостью 20 л (коэффициент заполнения 0,5). Культивирование проводят 4-5 ч до конца фазы экспоненциального роста. В процессе культивирования автоматически поддерживают рН на уровне 7,04 ±-0,3 путем подачи 20%-ного раствора , NaOH и изменения .числа оборотов мешалки с 200 до 400 об/мин, температура 37Ј0,1°С. Бактериальную массу соQ ции Е со 105 I.

5

0

5

0

Для выделения и очистки рестриктазы используют ультразвуковой дезинтегратор УЗДН-2Т (СССР), центрифугу Бекман Ж-21С, холодильную камеру Колора, хроматографические колонки, термостат, аппарат для электрофореза, универсальный источник питания 1УИП-1.

I ДНК фага /Д выделена по известной методике (Saito H. Miura K.J. Biochem. Biophys Acta, 1963, 72, 619-629). Используется гликоль 6000, декстран 500 фирмы Serva.

Активность рестриктазы тестируют методом гидролиза ДНК фага с последующим разделением полученных фрагментов электрофорезом в агарозном геле. Реакционная смесь для гидролиза содержит 10 мМ трис-HCl рН 7.8, 20 мМ NaCl 5 мМ MgCL2, 10 мМ 2-мер- каптоэтанол, 100 мкг/мл альбумина бычьей сыворотки, 2 мкг ДНК фага fl в 40 мкл смеси и 1 мкл фермента. Реакцию проводят при 37°С 10 мин. Электрофорез проводят в 0,1 М натрийборат- 5 ном буфере (рН 8,2) 2 мМ трилон Б, в течение 1,5 ч при напряжении 100 В и силе тока 100 мА. Окрашенные эти- дийбромидом (1 мкг/мл) гели просматривают в УФ-свете.

За условную единицу принимается то количество фермента, которое в оптимальных условиях за 1 ч полностью расщепляют 1 мкг ДНК фага fl .

Все операции по выделению и очистке фермента проводят при +4°С.

10 г влажной биомассы суспендируют в 20 мл буфера А (10 мМ трис-НС1-бу- фер, рН 7,8, содержащий 10 мМ 2-мер- каптоэтанола), озвучивают на дезинтеграторе. В полученный бесклеточный экстракт добавляют полиэтиленгликоль (28,4%) и декстран (7,1%) добавляют NaCl до конечной концентрации 0,5 М. Все хорошо перемешивают на магнитной мешалке и центрифугируют со скоростью 4000 об/мин 30 мин. После центрифугирования верхний слой сливают и диали- зуют против буфера Е (10 мМ калийфос0

5

0

5

51

фатный буфер, рН 7,4, содержащий 1 мМ ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптоэтанола, 1 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF)3 содержащего 0,1 М NaCl. После диализа ферментный раствор наносят на колонку с Фосфоцеллюлозой Р11 (1,5х х12 см), уравновешенной буфером Б, 0,1 М NaCl. Колонку промывают этим же буфером и элюируют линейно повышающейся концентрацией NaCl от 0,1 до 0,6 М и 300 мл буфера Б. Фракции, содержащие основную часть активности объединяют и диализуют в течение 16 против буфера В, 0,1 М NaCl, После диализа ферментный раствор наносят на колонку с ДНК-агарозой (1x12 см), уравновешенной буфером Б, 0,1 М NaCl Промывают этим же буфером и элюируют линейно повышающейся концентрацие NaCl от 0,1 М до 0,5 М в 140 мл буфера Б. Активные фракции объединяют и диализуют в течение 16 ч против буфера Б (10 мМ калийфосфатный буфер рН 7,4, содержащий 1 мМ ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптоэтанола, 1 мМ PMSF). Ферментный раствор после диализа нанося на колонку с гепаринсефарозой (1x8 см уравновешенной буфером Б. Промывают этим же буфером и элюируют линейно повышающейся концентрацией NaCl от О до 0,5 Мв 100 мл буфера Б. Активные фракции объединяют и диализулт в течение 16 часов против буфера 3, 0,1 М NaCl. После диализа ферментный раствор наносят на колонку с голубой се- фарозой (1x7 см) уравновешенной этим же буфером. Колонку промывают буфером Б, 0,1 М NaCl и элюируют линейно повышающей концентрацией NaCl от 0,1 М до 0,7 М в 100 мл буфера Б. Фракции, содержащие основную часть рестриктазной активности, объединяют и дкализуют против буфера Б: 10 мМ трис-HCl рН 7,4,1 мМ ДТТ„ 1 мМ ЭДТА, 0,1 М КС1, 50% глицерина, 1 мМ PMSF и 200 мг/мг альбумина бычьей сыворотки. Ферментный препарат хранят при -20°С. Из 1 г сырой биомассы получают 2000 ед рестриктазы Е со 105 I.

Определение специфичности, Было установлено, что Е со 105 I расщепляет ДНК фага ft и fd в одном месте и не действует на ДНК (f) x 174 и pBR 322. Рассмотрение табличных данных позволило выявить только одну последовательность нуклеотидов

16

5 TACGTA, узнаваемую рестриктазой Sna BI, удовлетворяющую указанным экспериментальным данным.

Совокупность данных, представленных в таблице, убеждают, что субстратом Е со 105 I является гексануклео- тид S -TACGTA.

Наличие сведений о структуре участка, узнаваемого рестриктазой Е со 105 I, послужило предпосылкой для апробации в опытах по определению места расщепления ДГТК этим ферментом подхода, основанного на использовании в качестве субстрата синтетического олигонуклеотида, содержащего сайт узнавания (обведено рамкой) этого . фермента:

20

Е со 105 I

Используют самокоплементарные олигонуклеотиды. Каждый из меченых дуплетов обрабатывали рестриктазой Е со 105 I и продукт расщепления анализировали в тонком слое ДЭАЭ- целлюлозы. В пг паллельных дорожках анализировали частичный 3 -экзонуклеазный гидролкзат Гс-ченого олигонуклеотида, входящего в состав исследуемого дуплекса. Наличие полного статистического набора продуктов экзону- клеазного гидролиза контролировали

путем его анализа методом нуклеотид- ных карт.

Для рестриктазы Е со 105 I меченым продуктом расщепления дуплекса оказался пентануклеотид 5 - Ф GCTAC,

что свидетельствует о расщеплении узнаваемого гексануклеотида в местах

СТА

45

3 -ATGACAT Т

указанных стрелками.

Предлагаемый штамм позволяет по- лучить высокоочищенный ферментный препарат с большим выходом (2000 ед./г биомассы).

Формула изобретения

Штамм бактерий Escherichia coli RFL ВКПМ В-4500 - продуцент рестрик-i тазы Е со 105 I.

Сравнение расчетных и экспериментальных данных характера расщепления фрагментов ДНК фагов fl и fd рестриктазой Е со 105 I

Примечание. Р - величины фрагментов рассчитаны на основе известной

структуры ДНК фагов (Sanger F.J. Mol.Biol., 1982, 162, 729-773) и fd (Beck E.Nucl. Acids Res., 1978. 5, 4495-4503), исходя из предположения, что Е со 105 I узнает гексануклеотид 5 -TACGTA.

Э - величины фрагментов установлены методом относительной электрофоретической подвижности.