Способ определения задерживающей способности фильтров тонкой очистки Советский патент 1989 года по МПК C12Q1/00 

юителем с низким квантовым входом оресценции в растворе, преимущест IHO аурамином. При оценке фильтров лизирз ют только те частицы, котоИзобретение относится к способам исп ытаний при работе с микроорганизмами, а конкретно к способам -оценки зарерживающей способности фильтров тонкой очистки воздуха, и может быть исгользовано в медицинской и микро- бис логической промьгатенности.

Цель изобретения - повышение точ- но4ти способа и сокращение времени оп1 еделения«

Способ заключается н том, что суспензию клеток метят флуоресцирующи:м

кр Флз ве1 am

ры( содержат клетки, что позволяет задерживающую способность фильтра именно по клеткам.

Введение флуоресцирующего краси- reJiH в клетки, инактивацию клеток и (щксацию в них красителя проводят в оуспен:Л1И, что позволяет достичь

ВЫ

до гл ва

единичных клеток, с помощью простых высокопроизводительных распылителей образом, удается, достичь высокой дисперсности и концентрации тзет-аэрозоля, требующихся для количественной оценки фильтров тонкой очистки (ФТО), установленных в системах очист ки воздуха больщой производительности,

Подсчет- в пробах до и .после Фильтра отдельных флуоресцирующих клеток позволяет получить данные по проницаемости через фильтр аэрозоля близкого к монодисперсному, в силу идентичности размеров, большинства KJteTOK бактериальной культуры.

Коли :ественные данные, полученны пф монодисперсном или близкому к мфнодисперсноыу аэрозолю, имеют по )авнению с данными по полидисперс- . аэрозолю более высокую точност как не зависят от производительности систем, в которых установлены оцениваемые фильтры, температуры и влажности, воздуха, .эффективности пр бротборников и т.д. С другой сторо .нМ повьппение точности предлагаемого срюсоба по сравнению со способом .оценки ФТО по тест-аэрозолю живых бтериальных клеток обеспечивают тем, что при анализе подсчитывают все

;окой дисперсности материала, пре- гврар ает агрегацию клеток в кон- эмераты. Нто обеспечивает генериро ше тест-аэрозоля, состоящего из

5

5

0

K.;iei KH, со.п,( рж,и1и1Рг.я п тест-аэрозоле, а не только жияиеспосоГщые, конпент- рация которых резко убывает после распыления,

В предлагаемом способе с целью получения тест-аэрозоля для испытаний бактериальные клетки прижизненно окрашивают в суспензии, а затем инак- тивируют. Условия инактива)дии обеспечивают фиксацию красителя для его длительного и прочного удерживания в клетке. В результате получается материал, частицы которого при дли тельном хранении и распылении в аэрозоль сохраняют основные функциональ- ные свойства: физический,размер, ин- .тенсивную флуоресценцию и высокую степень дисперсностИо

В табл,1 представлены сравнительные характеристики с.пособов оценки задерживающей способности ФТО по тест-аэрозолю живых бактериальных клеток (известный) и тест-аэрозолю фиксированных флуоресцирующих клеток.

Из табл.1 видно, что предлагаемый способ оценки фильтров значительно быстрее и обладает большей точностью.

При разработке предлагаемого способа для пол -мения тест-аэрозоля апробирована суспензия бактериальной культуры E.coli -штамм М-17, полу- ченная из коллекции ГИСК им. Л.А„,Та- расевича, с размером клеток 1,0 на 1,8 мкм, приготовленная в тех же , условиях, что и суспензия клеток культуры S.marcescens. Клетки E.coli имеют такую же яркую флуоресценцию, что позволяет надежно.просчитывать их в аэрозольных пробах как визуально, так и с помощью сканирующего микрофлуориметра по методике, описанной для клеток Somarcescens.

Единственное различие, выявленное при проведении сравнительных испытаний на одном и том же ФТО, состоит в том, что Kf,p.:. для клеток E.coli в 2,6 раза меньпе, чем для клеток S.marcescens, что объясняется их более крупными размерами и не имеет принципиального значения.

Пример. Материал для тест- аэрозоля готовят из смьша с плот-ной питательной среды суточной культуры Serratia marcescens (размер клеток 0,6 на 1,2 мкм) с концентрацией не менее (3-4Ью клеток/Nm. К суспен 1449586

зии клеток добавляют раствор красителя аурамина до конечной концентрации 0,008% и вьщерживают при комнатной температуре в течение 20 мин. При этом происходит прижизненная окраска белков цитоплазмы,бактериальных клеток. Применяемая концентрация красителя является минимальной, обеспечивающей яркую флуоресценцию отдельных клеток, необходимую для их визуального контроля, и требуемое соотношение сигнал/фон для регистрации клеток с помощью микрофлуори10

После обработки формалином суспензию клеток можно хранить в течение 1 года.

Перед использованием индикаторный материал разводят дистиллированной водой в соотнощении (1:3)-(1;4)

Готовую суспензию, содержагцую 5-10 - Ыр клеток/мл, распьшяют

с помощью пневматической форсунки на расстоянии 8-10 диаметров газохода до испытуемого фильтра. Расход клеточной суспензии составляет для

- - - - фильтров ФТО-60 и ФТО-500 (2-5) мл/мин, метра. Более низкая концентрация кра- 15 для фильтров ФТО-750 и ФТО-1000 15- сителя в растворе или более короткое 30 мп/мин. время окрапгавания ведут к снижению соотношения сигнал/фон и к невозможности регистрировать сигналы флуоресценции от отдельных клеток. jn

Отношение сигнала регистрации флуоресценции от отдельной клетки к сигналу от фона подложки в зависимости от концентрации аурамина в суспензии и времени окрашивания приведе- 25 10-20 с, после фильтра в импактор но в табл. 2.

Отбор проб производят на щелевой импактор с номинальной объемной скоростью 50 л/мин и. отсечкой (Д5о) равной О,7 мкм (размер сопла 0,45-30 мм). До фильтра о.тбор проб вьтолняют с использованием дозатора аэрозоля с объемной скоростью подачн пробы 0,1 - 0,2 л/мин.в течение

с номинальной объемной.скоростью в течение 10-20 мин, В качестве подложки применяют предметное стекло, покрытое слоем вазелина. Пробу аэрозоля осаждают на стекле в виде полоски размером 0,5-30 мм.

Более высокие концентрации красителя и увеличение времени окраши- .рания не дают существенного увеличе ния соотношения сигнал/фон (только . увеличивают время приготовления и стоимость индикаторного материала).

На второй стадии приготовления индикаторного материала к суспензии клеток добавляют раствор формальдегида до конечной концентрации 1,0% и вьщерживаютпри комнатной температуре 12ч.

Такая обработка обеспечивает прак тически полную инактиватщю суспензии способствует образованию дополнительных связей белков клеток с молекула- ми красителя и прочному удержанию его в клетке при последующем разбавлении суспензии.

Увеличение концентрации формальдегида позволяет уменьшить время выдержки, но приводит к образованию конгломератов клеток, что снижает степень дисперсности клеточной суспезии и соответственно ее качество как индикаторного материала.

При более коротком времени вьщержки суспензии с формалином (4ч) не наблюдается полной инактивации суспензии бактерий при посеве О, 1 мп суспензии на чашку прорастает 3-10 бактериальных колоний.

После обработки формалином суспензию клеток можно хранить в течение 1 года.

Перед использованием индикаторный материал разводят дистиллированной водой в соотнощении (1:3)-(1;4)

Готовую суспензию, содержагцую 5-10 - Ыр клеток/мл, распьшяют

с помощью пневматической форсунки на расстоянии 8-10 диаметров газохода до испытуемого фильтра. Расход клеточной суспензии составляет для

фильтров ФТО-60 и ФТО-500 (2-5) мл/ми для фильтров ФТО-750 и ФТО-1000 15- 30 мп/мин.

10-20 с, после фильтра в импактор

Отбор проб производят на щелевой импактор с номинальной объемной скоростью 50 л/мин и. отсечкой (Д5о) равной О,7 мкм (размер сопла 0,45-30 мм). До фильтра о.тбор проб вьтолняют с использованием дозатора аэрозоля с объемной скоростью подачн пробы 0,1 - 0,2 л/мин.в течение

25 10-20 с, после фильтра в импактор

35

30

. -

где

45

0

с номинальной объемной.скоростью в течение 10-20 мин, В качестве подложки применяют предметное стекло, покрытое слоем вазелина. Пробу аэрозоля осаждают на стекле в виде полоски размером 0,5-30 мм.

Предметное стекло с пробой поме- йцают под флуоресцентный микроскоп с увеличением 900-1200 с возбуждающими интерференционными фильтрами на 436 нм и СС15, светоделительной пластиной на 460 нм и запирающими фильтрами же 11 и Ж 17 и подсчитьшают количество отдельных флуоресцирующих Хлеток в нескольких полях зрения в различных участках аэрозольного рсад- ка, В пробах до фильтра (количество клеток в поле зрения 500-100) подсчитывают клетки в 10-12 полях зре- ния. В пробах после фильтра с коэффициентом проницаемости около количество клеток в аэрозольном осадке колеблется от 2 - 3 клеток в поле зрения до 1 клетки в 10 полях зрения, и подсчет производится в 30-50 полях зрения.

Коэффициент проницаемости фильтра (К„р ) определяется по формуле

F .

5

N,-V,

100%,

N4 - среднее количество в поле зрения микроскопа в пробе до фильтра;

5

14

N - среднее количество в поле зрения микроскопа в пробе после фильтра; , ; V, - объемы пробы до фильтра,л;

V - объем пробы после фильт- ; ра, л,

I Предлагаемый способ позволяет оп- реЬелить коэффициент проницаемости фипьтра до и больше. Для серийно вьтускаемых фильтров ФТО-60, ФТО-500, ФТО-750, ФТО-1000 коэффициент проницаемости определенный по пр|едлагаемому способу, колеблется

от 5 до 5

.

Для автоматиза1ЩИ анализа проб используют макетный образец микро- фл гориметра, выполненный на базе мик- рогкопа Биолам-211 с осветителем ОИ-18А и фотометрической насадкой ФМЗЛ-1а. Микрофлуориметр укомплекто ван Сканирующим предметным столиком и яикропрбцессорным блоком управления, обеспечивающим сканирование проб в двух направлениях по программе и накапливающим данные по сигна- ла|м флуоресденчии от отдельных кле- TdK.

Регистрацию сигналов флуоресцен- цк|и от отдельных клеток осуществляют в полосе сканирования измеритель- зонда диаметром 5 мкм. За измерительный цикл длительностью 20 с сканируется площадь, эквивалентная площади восьми полей зрений.

Подсчёт клеток в пробе с помощью (Сканирующего микрофлуориметра про- и водят в 3 - 4 участках по всей дДине аэрозольного осадка

495866

Предлагаемый тест-аэрозоль может быть использован в качестве трассера в исследованиях и испытаниях, связанных с охраной окружающей среды от газовоздушных загрязнений.

Предлагаемый способ исключает ощибки в оценке задерживающей спо-- собности фш1ьтра и обеспечивает бо- 10 лее точный расчет вредности газовоздушных выбросов из технологических линий микробиологического синтеза Это позволяет повысить эффективность мероприятий по улучшению условий 15 труда и обеспечению охраны окружающей среды. Формула изобретения

20

25

Способ определения задерживающей способности фильтров тонкой очистки, предусматривающий распыление суспензии бактериальных клеток тест-аэрозоля в воздушном потоке, направленном на фильтр, отбор проб тест-аэрозоля до и после фильтра и оценку результатов тест-аэрозоля в пробах отличающийся тем, что, С целью повышения точности способа и сокращения времени определения, бак- 30 териальные клетки тест-аэрозоля прижизненно окрашивают в суспензии аурамином в концентрации 0,005 - О,01 мас,% и вьдерживаются в течение 15 - 20 мин, затем инактивируют и фиксируют краситель в течение , 10-12 ч в 0,8-1,0%-ном растворе формалина, а оценку результатов проводят путем подсчета отдельных флуоресгщрующих клеток,

35

0

5

Способ определения задерживающей способности фильтров тонкой очистки, предусматривающий распыление суспензии бактериальных клеток тест-аэрозоля в воздушном потоке, направленном на фильтр, отбор проб тест-аэрозоля до и после фильтра и оценку результатов тест-аэрозоля в пробах отличающийся тем, что, С целью повышения точности способа и сокращения времени определения, бак- 0 териальные клетки тест-аэрозоля прижизненно окрашивают в суспензии аурамином в концентрации 0,005 - О,01 мас,% и вьдерживаются в течение 15 - 20 мин, затем инактивируют и фиксируют краситель в течение , 10-12 ч в 0,8-1,0%-ном растворе формалина, а оценку результатов проводят путем подсчета отдельных флуоресгщрующих клеток,

Т а б л и ц а 1

5

Изобретение относится к способам испытаний при работе с микроорганизмами, а более конкретно к способам оценки задерживающей способности фильтров тонкой бчистки воздуха, и может быть использовано в медицинской и микробиологической промьгашен- ности. Цель изобретения - повышение точности и сокращение времени определения. Способ заключается в:том, что бактериальные клетки прижизненно окрацивают в суспензии путем введе- ния флуоресцентного красителя с низким квантовым выходом собственной флуоресценции в растворе, преиму- щественно аурамина, в концентрации 0,005-0,01%, затем инактивируют и фиксируют в них краситель в 0,8- t,0%-HOM растворе формалина в теч е- ние 10-12 ч, а определение концентрации тест-аэрозоля проводят путем подсчета отдельньк клеток. Для автоматизации подсчета клеток в пробе используют сканирующий микрофлуори- метр в режиме регистрации сигналов от отдельных клеток. 2 табл. с fS (Л (и со СП 00 о

Известный ФТО-бО

25 0,52-10 0,16МО-

ФТО-750

0,7 1,1410 0,2540

25 1,6-10

,-4

0,58- 10

,Предлагаемый

0,7 3,7-10

31

0,2540

0,58- 10

,4

18 22

-40,32-10

,-4

1,2 1,9 2,2

I4/ 458fi8

Таблица 2

. 1,2 4,3 4,6