Стабилизированный состав для определения мочевины, содержащий уреазу Советский патент 1980 года по МПК G01N31/22 C07G7/02 

(54) СТАБИЛИЗИРОВАННЫЙ СЮСТАВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОЧЕВИНЫ, СОДЕРЖАЩИЙ УРЕАЗУ

1

Изобретение относится к стабилизированным составам на основе уреазы, которые находят применение при определении мочевины.,

Эняим урёаза расщепляет мочевину с образованием угольной кислоты и аммиака. Характерной оссэбенностью этого энзима является то, что в сыром состоянии урёаза чрезвычайно стабильна при хранении, стабильность же очищенной уреазы сильно падает и уже при удельной активности приблизительно от 25 до 100 и/мг является неудовлетворительной.

Обычная продгикная урёаза с удельной активностью около 100 U/мг при полугодовом хранении теряет в холодильнике Уже около .50% своей активности. Хранение при комнатной температуре или в растворенном виде приводит к еще более быстрой потере активности.

Попытки повысить стабильность очищенного энзима в результате изменения значения рН буфера, ионной силы и типа буфера (малеат, цитрат, этилендиаминтетрауксусная кислота, фосфат) или в результате создания составов на основе уреазы, содержащих томимо энзима соединения с

сульфгидрильными группами, такне как цистеин или меркаптоэтанол, оказались безрезультатными.

Определенного небольшого повышения

5 стабильности удалось добиться с помощью состава, содержащего помимо уреазы дважды перекристаллизованный альбумин плазмы быка 1.

Однако достигаемая степень ста- 10 бильности оказалась недостаточной для использования этого состава, что было обусловлено относительно {йлстрым разрушением энзима и падением его активности.

15 Цель изобретения - повышение стабильности.

Указанная цель достигается/ согласно изобретению, составом для определения мочевины, который помимо

20 уреазы содержит смесь глутатиона, этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и тринатрийцитрата в кристаллической форме, содержащего 2 молекулы кристаллизационной воды, при

25 следующем соотношении компонентов уреаза: глутатион, этилендиаминтетрауксусная кислота: цитрат 1:(1-3):(13): (1-3).

Предлагаелый стабилизированный

30 состав содержит уреазу, предпочтительно предварительно обработанную сефадексом. Обработкой сефадексом удается по ти удвоить активность энзима истабильность препарата. Не поддающиеся стабилизации примеси в результате этой обработки удаляются, так что препарат уреазы на основе описьшаемого стабилизирующего состава отличается особенно высокой стабильностью после добавления смеси стабилизаторов. Обработку сефадексом можно производить как в результате однократного введения, сефадекса в раствор энзима, так и на колонке. Предпочтительно применение сшитого сефадекса со свойствами молекулярных сит, так как при этом одно временно достигают обессоливание уреаэы наряду с обогащением и удале ем мешающих примесей. Отличиями предлагаемого состава являются наличие в нем помимо энзима глутатйона, этилендиаминтетрауксусной кислоты .(ЭДТА) и кристаллогидрата тринатрийцитата, а также соотношение компонентов соответстве но 1: (1-3): (1-3): (1-3) . Неожиданным оказгшся стабилизирующий эффект смеси названных трех веществ (глутатион, ЭДТА, цитрат), хотя известно, что отдельные состав ные части этой смеси не обладают стабилизирующим действием. Предлагаемый стабилизированный соста.в, содержсшдай уреазу, полученный после лиофилизации смеси после 12-недельного хранения при ЗЗС, практически полностью стабилен и по зывает 100% активности по сравнению с исходной. Сам энзим после лиофилизации теряет активность от 30 до 80%. Стабилизированный, согласно изоб ретению, состав, содержащий уреазу, применяется для определения мочевин Он является таким устойчивым, что пригоден для пропитки бумаги, плен и тому подобных материсшов-носителе или для получения реакционноспособных слоев на такого рода носителях. Если такого рода носитель или таког рода слой дополнительно содержит ин дикатор рН, то мочевину можно опред лить путем однократного изменения о раски. Пример. 30 мг обычной про дажной уреазы с удельной активность около 100 и/мг растворяют в 1 мл воды, пропускают через 5 мл геля се фадбкса G-50, предварительно уравно шенного- цитратным буфером рН 7,0, с цержащим 0,5% 2-меркаптоэтанола, и непосредственно после этого лиофили зируют. Лиофилизированный препарат подвергают затем испытанию на стабильность в результате хранения при . Во второй колонке повторяют описанный выше опыт, в котором к энзиму, обработанному сшитым сефадексом G-50, добавляют глутатион, цитрат и ЭДТА в весовом соотношении 1:1:1:1. Затем повторяют лиофилизирование и хранение, как описано в первом опыте. В случае первого опыта без добавления стабилизирующего средства выход активности после лиофилизации составляет 20%. После 6-недельного хранения при 35°С замеренная остаточная активность составляет менее 1%. Во втором опыте со стабилизирующим средством, согласно изобретению, активность после лиофилизации составляет 100%. Через 3 месяца активность также составляет 100%. Пример 2. 150 мг обычной продажной уреазы с удельной активностью около 100 и/мг растворяют в 100 мл воде, смешивают с 150 мг глутатйона, 150 мг цитрата и 150 мг ЭДТА в весовом соотначении 1:1:1:1 и без обработки сефадексом лиофилиэируют. В лиофилизате определяют исходную активность. Она составляет 100%. Лиофилизат подвергают затем хранению при . После 6-недельного хранения активность составляет еще 95% исходного значения. Пример 3. Из обычной продажной уреазы в результате многократной кристаллизации иэ ацетон-цитратного буфера и обработкой сефадексом получают уреазу с удельной активностью около 1500 и/мг. Полученный препарат . (10 мг) смешивают с 30 мг глутатйона, 30 мг цитрата и 30 мг ЭДТА в весовом соотношении 1:3:3:3. Устойчивость при хранении при соответствует уреазе 100 и/мг. Пример 4. Испытательная пленка для определения мочевины (в крови или сыворотке). Составные части: порошкообразный поливинилацетатпропионат 45,0 г, 1,93%-ный раствор натрийальгината в воде 10,0 г диокстилнатрий-сульфосукцинат 0,5 г, стабилизированная уреаэа (1:1:1:1) плюс растворенный в воде (в 10 мл) бромтимолбляу, растворения в 5 мл метанола, плюс 5 мл воды (10000 U), 0,25 г динатрийгидрофосфат 0,9 г. Составные части хорошо перемешивают и добавлением 1 н. раствора НС1 доводят значение рН до 6,0. Массу наносят на поливинилхлоридную пленку и высушивают в течение 60 мин при Прикапывают мочевинусодержашую кровь или сыворотку и после стирания ее через 90 с проявляется следующая окраска: 20 мг % мочевины желтый, 60 мг % мочевины - желто-зеленый, 100 мг % мочевины - зеленый, 200 мг % мочевины - темно-зеленый.

После 3-дневного хранения при эта испытательная пленка реагирует практически неизменной.

Испытательная пленка.такого же состава и изготовления, но которая содержит вместо стабилизированной, согласно изобретению, уреазы нестабилизированную уреазу такой же активности, первоначально показывает практически такую же окраску при реакции, однако после хранения в течение 3 дней при более не пригодна.

Формула изобоетения

1. Стабилизированный состав для определения мочевины, содержащий

уреазу, отличающийс я тем, что, с целью повышения стабильности, он дополнительно содержит смесь глутатиона, этилендиаминтетрауксусной кислоты и тринатрийЦитрата в кристаллической форме, содержащего 2 молекулы кристгтлизационной воды, при следующем соотношении компонентов уреаза: глутатион, этилендиамиитетрауксусная кислота: цитрат 1:(1-3):(1-3):(1-3).

2. Способ ПОП.1, отличающийс я тем, что урааза предварительно обработана сефадексом.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1, Lynn K.R. Preperties

5 and Purifications of JJreaseV, Biochimica et Biophysica Acta, 1967, 146, p.205-218 (прототип).