РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА plFN-αA-P2 КОДИРУЮЩАЯ СИНТЕЗ ЛЕЙКОЦИТАРНОГО ИНТЕРФЕРОНА αA ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММЫ E.COLI - ПРОДУЦЕНТЫ ЛЕЙКОЦИТАРНОГО ИНТЕРФЕРОНА ЧЕЛОВЕКА Советский патент 1994 года по МПК C12N15/19 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, молекулярной биологии и генетической инженерии и представляет собой сконструированную in vitro рекомбинантную плазмиду, обеспечивающую биосинтез лейкоцитарного интерферона αA человека, и штаммы E.coli, содержащие эту плазмиду, - продуценты лейкоцитарного интерферона типа αA человека.

Целью изобретения является упрощение технологии крупномасштабного производства лейкоцитарного интерферона αA человека.

П р и м е р 1. Конструирование рекомбинантной плазмиды pIFN- A-P2.

1. Конструирование рекомбинантной плазмиды pGDP1: 150 мкг РФ1 ДНК фага ⊘Х174 расщепляют с помощью 200 ед. эндонуклеазы рестрикции Alu I в буфере, содержащем 50 ммоль NaCl, 10 ммоль трис-HCl (рН 7,6), 10 ммоль MgCl₂ и 10 ммоль меркаптоэтанола, при 37^оС в течение 2 ч. Общий объем реакционной смеси 800 мкл. Смесь субфрагментов обрабатывают фенолом, осаждают этанолом и растворяют в 150 мкл ТЕ-буфера, содержащего 10 ммоль трис-HCl (рН 8,0) и 1 ммоль ЭДТА, после чего наносят на 8%-ный полиакриламидный гель (ПААГ) и подвергают электрофоретическому разделению при 60 мА в течение 8 ч. Полоску геля, содержащую фрагмент ДНК A6, вырезают и ДНК элюируют по Максаму-Гилберту. Полученный таким образом фрагмент Р1, содержащий промотор, рибосомосвязывающий участок (последовательность Шайн-Дальгарно SD) и 19 N-концевых кодонов гена D фага ⊘ Х17A, встраивают в плазмидный вектор pBRH4, который предварительно расщепляют эндонуклеазой рестрикции E.coRI и обрабатывают Кленовским фрагментом ДНК-полимеразы 1 E.coli в присутствии dATP и dTTP для достройки выступающих 5¹-концов. 1 мкг подготовленного таким способом вектора pBRH4 и 0,1 мкг подготовленного таким способом вектора pBRH4 и 0,1 мкг фрагмента Р1 соединяют с помощью 5 ед. Т4-ДНК-лигазы в буфере, содержащем 50 ммоль трис-HCl (рН 7,5), 10-5 мМ MgCl₂ и 0,2 ммоль ATP, при 15^оС в течение 16 ч.

Общий объем реакционной смеси 50 мкл. Полученной смесью рекомбинантных ДНК трансформируют клетки E.coli К 802 по известному методу. Эффективность трансформации составляет 10⁷ колоний на 1 мкг плазмидной ДНК pBR 322. Отбирают клоны, устойчивые к тетрациклину (10 мкг Тс на 1 мл), и проводят их рестрикционный анализ.

2.Конструирование рекомбинантной плазмиды pGDP2.

Фрагмент Р1 выделяют из состава плазмиды pGDP1, расщепляя ее (200 мкг) с помощью 400 ед. эндонуклеазы EcoR1 в буфере, содержащем 100 ммоль NaCl, 50 ммоль трис-HCl (рН 7,5), 10 ммоль MgCl₂, 1 ммоль DTT, при 37^оС 90 мин. Общий объем реакционной смеси 800 мкл. Смесь субфрагментов обрабатывают фенолом, осаждают этанолом и растворяют в 150 мкл ТЕ-буфера. Отделение фрагмента Р1 от исходного вектора производят с помощью электрофореза в 8%-ном ПААГ при 60 мА в течение 8 ч. Фрагмент Р1 элюируют из геля, как указано. Затем фрагмент Р1 дефосфорилируют, вводят 5-концевую метку с помощью [j-³²P] ATP и Т4-полинуклеотидкиназы по Максаму-Гилберту. Меченый фрагмент Р1 расщепляют эндонуклеазой рестрикции BspRI на большой (226 п.о.) и малый (11 п. о.) EcoRI-BspRI-фрагменты. 14 мкг полученной смеси фрагментов расщепляют с помощью 14 ед. эндонуклеазы Hinf I в буфере, содержащем 50 ммоль NaCl, 10 ммоль трис-HCl (рН 7,6), 10 ммоль MgCl₂ и 10 ммоль меркаптоэтанола, при 37^оС, отбирая аликвоты через 5,10,20,30 и 40 мин. Общий объем реакционной смеси 40 мкл. Так добиваются частичного гидролиза фрагмента Р1 эндонуклеазой Hinf I. Смесь субфрагментов наносят на 8%-ный ПААГ и разделяют при 60 мА в течение 6 ч. Фрагмент Р2 (226 п.о.) элюируют из геля, как указано ранее, и используют для конструирования плазмиды pGDP2. Для этого 0,05 мкг фрагмента Р2 обрабатывают 5 ед. S₁-нуклеазы в буфере, содержащем 0,2 моль NaCl, 50 ммоль ацетата натрия (рН 4,5), 1 ммоль ZnSO₄ и 5%-ный глицерин, при 20^оС в течение 20 мин.По окончании инкубации смесь обрабатывают фенолом, хлороформом и ДНК осаждают этанолом. Затем подготовленный таким образом фрагмент Р2 встраивают в плазмиду pBRH4, предварительно расщепленную эндонуклеазой EcoRI и обработанную Кленовским фрагментом ДНК-полимеразы 1 E.coli в присутствии dATP и dTTP. Ферментативное соединение фрагмента Р2 и вектора проводят, как указано ранее, с помощью Т4-ДНК-лигазы в 50 мкл реакционной смеси. Полученной смесью рекомбинантных плазмид трансформируют клетки E.coli HB 101 и отбирают клоны, устойчивые по крайней мере к 10-20 мкг тетрациклина на 1 мл среды. Отобранные клоны подвергают рестрикционному анализу с последующим определением первичной структуры вставок.

3.Получение рекомбинантной плазмиды pIFN- αA-P2.

5 мкг неэкопрессирующей плазмиды pIFN- αA-310 обрабатывают 10 ед. эндонуклеазы рестрикции EcoRI в буфере, содержащем 100 ммоль NaCl, 50 ммоль трис-HCl (рН 7,6), 10 ммоль MgCl₂ и 1 ммоль DTT, при 37^оС в течение 90 мин. Общий объем реакционной смеси 50 мкл. Затем ДНК осаждают этанолом и растворяют в 50 мкл буфера, содержащего 33 ммоль трис-HCl (рН 7,9), 66 ммоль ацетата калия, 10 ммоль MgCl₂ и 1 ммоль DTT. В реакционную смесь добавляют dTTP до конечной концентрации 0,4 ммоль и 1,5 ед. Т4-ДНК-полимеразы. Реакцию проводят при 12^оС в течение 90 мин, затем ДНК осаждают этанолом и растворяют в буфере, содержащем 0,2 ммоль NaCl, 50 ммоль ацетата натрия (рН 4,5), 1 ммоль ZnSO₄ и 5%-ный глицерин. К реакционной смеси (20 мкл) добавляют 20 ед. S₁-нуклеазы и инкубируют при 20^оС 30 мин.

По окончании реакции ДНК обрабатывают фенолом, хлороформом и осаждают этанолом. 1 мкг подготовленной таким образом плазмиды pIFN- αA-310 сшивают с 0,2 мкг фрагмента Р2, обработанного аналогично вектору Т4-ДНК-полимеразой в присутствии dTTP и S₁-нуклеазой. Лигирование проводят в 50 мкл буфера, содержащего 20 ммоль трис-HCl (рН 7,6), 10 ммоль MgCl₂, 2 ммоль DTT, 0,2 ммоль ATP и 20 ед. Т4-ДНК-лигазы, при 10^оС в течение ночи.

Продуктами лигазной сшивки трансформируют клетки E.coli К 802 и с помощью гибридизации колоний in situ отбирают клоны, устойчивые к тетрациклину и содержащие вставку - фрагмент Р2. В качестве "зонда" при гибридизации используют ³²Р-меченый фрагмент Р2.

20 из 140 гибридизирующихся с промоторсодержащим "зондом" клонов анализируют на продукцию интерферона радиоиммунологическим методом. В результате получают плазмиду pIFN- αA-P2.

П р и м е р 2. Получение штамма - продуцента лейкоцитарного α A-интерферона человека.

Рекомбинантную плазмиду pIFN- A-P2 трансформируют в штамм E.coli К 802, как указано в примере 1, и получают штамм - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона αA человека с активностями, указанными в таблице.

Активность интерферона определяют методом ингибирования цитопатического действия вируса везикулярного стоматита на диплоидные фибробласты человека и радиоиммунологическими методами. Содержание интерферона в 1 л культуры при OD₅₅₀ = 2,0 составляет 3 х 10⁸ ед. активности.

П р и м е р 3. Кинетика накопления интерферона в культуре штамма - продуцента E.coli IFN- αA-P2 - в зависимости от фазы роста.

250 л среды, содержащей на 1 л 10 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г NaCl и 5 мг тетрациклина (рН 7,5), загружают в 500-литровый ферментер и инокулируют 2,5 л ночного посевного материала (OD₅₅₀ = 2,5). Режим культивирования: 37^оС, воздух 1:1, давление 0,5 атм. Через определенные промежутки времени отбирают аликвоты и определяют в них активность интерферона радиоиммунологическими методами. В таблице представлены данные по определению активности интерферона в клеточных экстрактах штамма - продуцента E.coli, содержащего рекомбинантную плазмиду pIFN- αA-P2, в зависимости от оптической плотности культуры при 2,5 ОЕ/л (550).

Из данных таблицы следует, что максимальный уровень активности интерферона в бактериальной клетке достигается при OD₅₅₀ культуры штамма-продуцента около 2,0. При этом средняя активность интерферона в клеточных экстрактах составляет 2х10⁸ ед. активности в 1 л культуры. В связи с этим ферментацию штамма-продуцента наиболее выгодно проводить до плотности культуры не выше 2,0 ОЕ/л (550 нм).

Таким образом, новая рекомбинантная плазмида pIFN- αA-P2, а также штаммы, содержащие эту плазмиду - продуценты лейкоцитарного интерферона человека, позволяют значительно упростить процесс крупномасштабного получения интерферона человека при сохранении высокого уровня биосинтеза.

1. Рекомбинантная плазмида pIFN-α A-P2 , кодирующая синтез лейкоцитарного интерферона α A человека, характеризуется следующими признаками: имеет длину 5200 п.о.; состоит из: EcoRI-RstI большого фрагмента плазмидного вектора pBR 322, регуляторной области гена D бактериофага ⊘X174, включающей промотор, участок связывания рибосом и инициирующий кодон ATG гена D, которая локализована с 1 по 216 п.о. и присоединена к EcoRI-сайту pBR 322, гена зрелого лейкоцитарного интерферона α A человека, локализованного с 217 по 1421 п.о.; содержит: в качестве генетических маркеров ген Ap^r, локализованный между 1421 и 1830 п.о., и ген Tc^r, локализованный между 3757 и 4944 п.о, уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции, расположенные на следующих расстояниях от начала регуляторной области гена D, п.о.: Hind III 5171, Bam HI 4825, SalI 5549, сайты узнавания другими эндонуклеазами рестрикции, расположенные на следующих расстояниях от начала регуляторной области гена D, п.о.: Hind II 87 и 4549, Pvu II 493 и 2964. 2. Штамм E. coli ЦМПМ В-2967 (Центральный музей промышленных микроорганизмов института ВНИИгенетика) - продуцент лейкоцитарного интерферона α A человека. 3. Штамм E. coli ЦМПМ В-3228 (Центральный музей промышленных микроорганизмов института ВНИИгенетика) - продуцент лейкоцитарного интерферона α A человека. 4. Штамм E. coli ЦМПМ В-3229 (Центральный музей промышленных микроорганизмов института ВНИИгенетика) - продуцент лейкоцитарного интерферона α A человека. 5. Штамм E. coli ЦМПМ В-3231 (Центральный музей промышленных микроорганизмов института ВНИИгенетика) - продуцент лейкоцитарного интерферона α A человека. 6. Штамм E. coli ЦМПМ В-3232 (Центральный музей промышленных микроорганизмов института ВНИИгенетика) - продуцент лейкоцитарного интерферона α A человека. 7. Штамм E.coli ЦМПМ В- 3233 (Центральный музей промышленных микроорганизмов института ВНИИгенетика) - продуцент лейкоцитарного интерферона α A человека.