Способ получения иммобилизованной люциферазы Советский патент 1984 года по МПК C12N9/02 C12N11/10 

Изобретение относится к биохим а именно к способу получения иммобилизованной люциферазы, в частно ти люциферазы светляков. Этот фермент широко используется в лабораторной и медицинской практике для аналитического определения аденозин-5-трифосфата lATP. Определение АТР служит для целей медицинской диагностики и для анализа загрязнений окружающей среды. В час ности в медицине этот метод используют для ранней диагностики ин фаркта миокарда, для-определения Чувствительности к антибиотикам-и f.n. Определение АТР в водоемах и в морской воде позволяет оценит их биологическоую продуктивность и наличие загрязнений. Растворимая люцифераза отличается высокой лабильностью, что затрудняет ее использование на практике. Поэтому разработка методов -стабилизации лю циферазы, в частности ее иммобилизации, приобретает важное практиче кое значение. Известен способ иммобилизации (шциферазы светляков на а -шнирован ном стекле с помсмцью глутарового альдегида. Однако препараты иммобй лизированной люциферазы, полученны этим способом, сохраняют только 0,07-0,16%исходной активности фермента. Известен также способ получения иммобилизованной люциферазы светля ков, который заключается в следующем. Навеску обезвоженных лампочек светляков экстрагируют при 4 С 0,02 м трис-ацетатным буфером с ионной силой 0,1-0,2 М, содержащш хлорид натрия и этилендиаминтетраацетат (ЭДТА). В ходе экстракции используют 100-кратный по весу избыток буфера по отношению к весу .лампочек светляков. Полученный экстракт обрабатывают 5-кратным по отношению к взятой навеске сырь избытком полимерного полисахаридного носителя, активированного бромциаиом. В качестве носителя ис пользуют сефарозу или сефадекс. Получают препарат иммобилизованной люциферазы светляков ,i сохраняквдий 10-12% исходной активности с удел ной активностью 500-700 мВ/мг. Недостатком данного способа им мобилизации люциферазы является недостаточная удельная активность получаемого препарата и неполное извлечение активного фермента из экстратста. При повторной-обработке надосадочной жидкости полимером процент извлечения фермента крайне мал. По-видимому, оставшийся непро экстрагированным фермент быстро инактивируется в растворе в условиях эксперимента. Целью изобретения является повышение удельноей активности иммобилизованного фермента при увеличении степени извлечения активного; фермента из экстракта. Цель достигается при реализации описываемого способа получения иммобилизованной люциферазы светляков, включающим экстракцию фермента из лампочек светляков буферным раствором и последующую обработку полученного экстракта полимерным полисахаридньм носителем, активированным бромцианом, причем экстракцию осуществляют фосфатным буфером с ионной силой 0,5 М при весовом соотношении лампочки светляков;буфер 1:40-10,/ и обработку экстракта полимером проводят при весовом соотношении лампочки светляков:полимер 1:1-3. Обычно в качестве полисахаридного носителя используют сефарозу, сефадекс, ультрагель (смешанный полимер, полиакриламида и агарозы /, ультрадекс (гель декстрана , целлофановуто пленку, целлюлозу . С целью экономии фермента отработанный ферментный экстракт можно повторно использовать для иммобилизации фермента, для экстракции используют 0,1 М фосфатный буфер, содержащий 0,,NaCl и 2 ЭДТА. Экспериментально показано, что замена трис-адётатного буфера на фосфатный с большей ионной силой обес печивает большего стабильность фермента. Способ осуществляют следующим образом. Экстракт лампочек светляков в фосфатном буфере встряхивают с активированным носителем при 4 с в течение 24 ч при указанном выше соотношении компонеитов. Изменение |Весового соотношения лампочки светляков полимер как в сторону увеличения, так и в сторону уменьшения приводит к угленьшению удельной активности получаемой иммобилизованной люциферазы. Надосадочную жидкость отделяют и снова встряхивают с полимером в тех же условиях. В результате такой обработки экстракта носителем получают препарат иммобилизованной люциферазы с удельной активностью 2000-5000 мВ/мг при сохранении 20-25% исходной активности люциферазы. Пример 1. 300 мг тонко растертых лампочек светляков экстрагируют б мл О,IM фосфатного буфера (0,2 М NaCl, 2 мМ ЭДТАЗ рН 8,0) В течение 40 мин при 4 °С. Полученную суспензию центрифугируют

fl5 000 об/мин, 10 мин, ). Раствор отделяют, Полученный водный экстракт люциферазы обрабатывают 300 h«r сефарозы, активированной ВгСМ. Суспензию встряхивают при в течение 24 ч. Полученный в результате полимер с ковалентно присоединенной ЛюцифераЗОЙ отделяют на стекляннстл фильтре. Надосадочный раствор повторно обрабатывают 300 мг ВгСН-активированной сефарозы в тех же условиях. Оба последовательно полученные препараты иммобилизованной люциферазы имеют одинаковую удельную активность, 5000 мВ/мг. В результате сохраняется 20% исходной активности люциферазы.

Пример 2. 80 мг тонко растертых светляков экстрагируют 2 мл 0,1 М фосфатного буфера (0,2 М SaCl 2 мМ ЭДТА рН 8,0). Надосадок отделяют и 2 .раза последовательно обрабатывают порциями по 240 мг :ВгСН-ак1Ивированной сефарозы тем же способом, что и в примере 1.Удельная активность обоих препаратов им-мобилизованной люциферазы 2000 МВ/м при сохранении 25% исходной активI ности люциферазы.

Пример 3. 500мг тонко растертых лампочек светляков экстрагируют 5 мл 0,1 М фосфатного буфера, 0,2 М UaCl, 2 ММ ЭДТА, рН 8,0. Надосадок отделяют и обрабатывают 500 мг ВгСН-активированной сефарозы тем же способом, что и в предаадущих примерах. Удельная активность полученного препарата 4000 мВ/мг при сохранении 15% исходной активности люциферазы.

4. 400 мг тонко растертых лампочек светляков экстрагируют 6 мл 0,1 М фосфатного буфера,

0 0,2 М NaCl, 2 ЭДТА, рН 8,0. Надосадок отделяют и добавляют к нему 400 мг ВгСН-актйвированного ультрадекса. Иммобилизацию проводят так же, как и в предыду&тх примерах.

5 Удельная активность иммобилизованных на ультрадексе препаратов 25.00 мВ/мг при сохранении 20% исходной активности люциферазы.

Предлагаемый способ иммобилизации позволяет получать препараты с

0 удельной активностью в 3-10 раз больше, чем с помопью известных методов. Процент извлечения активного фермента возрастает в 2-2,5 раза.

5

Применение стабильных и высоко, активных препаратов иммобилизованной люцифераэы в анализе позволяет добиться высокой точности и воспроизводимости, упрощает методику а

0 также приводит к уменьшению расхода самого фермента.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ЖЩЙФЕРАЗЫ путем экстракции фермента из лампочек светляков буферным раствором с послед гаощёй обработкой экстракта полисаха риднмм полимерным носителем, активиФованянм бромцианом, отличаюta, и И с я тем, что, с целью увеличения удельной активности иммобилмэованного фермента и повышения степени извлечения активного фермента из экстракта, экстракцию осуществляют фосфатным буфером с ионной силой 0,5 М при весовом соотноше нии лампочки светляков : буфер 11:40-10, а обработку экстракта пояимером проводят при весовом соотно- v шении лампочки светляков : полимер 1:1-3. 2, Способ по n.i, о т л и ч а-ющ и .и с я тем, что, в качестве полисахаридного носителя исполь- ;3уют сефарозу, целлюлозу целлофановую плёнку, ультрагель и Ультрадеке. 3. .Способ по П.1, о т л и ч а ющ и и с я тем что, с целью экономии, фермента, отработанный epttievtный экстракт повторно используют для иммобилизации фермента.