СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ Российский патент 2001 года по МПК G01N33/50 G01N33/52 

Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано для количественного определения активности протеолитических ферментов.

Известен способ количественного определения активности протеолитических ферментов (Практикум по биохимии. Под ред. С.Е. Северина и Г.А. Соловьевой. М. МГУ, 1989. С. 83), основанный на способности ароматических аминокислот поглощать ультрафиолетовый свет. Активность фермента определяют по повышению концентрации продуктов гидролиза белкового субстрата.

Недостатками известного способа являются высокая трудоемкость и его дороговизна, а также ограниченные возможности его применения.

Известен также способ определения активности протеолитических ферментов (Ambrose L. Ch., Patrick Y., Vincent A.F. A method to detect proteinase activity using unprocessed X-ray films // Anal. Biochem. - 1991. - V. 193, N 1. - P. 20- 23), заключающийся в том, что на необработанную фотопластинку с желатиновым покрытием (субстрат) наносят пробу ферментного раствора и через определенный промежуток времени визуально определяют активность фермента по наличию гидролизованного участка субстрата. Этот способ заключается в качественном определении активности ферментов.

Недостатком этого способа является ограниченная область его применения, заключающаяся в невозможности количественного определения активности ферментов.

Техническим результатом изобретения является возможность количественного определения активности протеолитических ферментов и расширение области применения.

Технический результат достигается тем, что пробу ферментного раствора вносят в лунку, вырезанную в слое агарозного геля, которым покрывают фотопластинку, и определение активности протеолитических ферментов осуществляют после прекращения реакции фермент-субстратного взаимодействия путем измерения интенсивности светового потока, проходящего через гидролизованный участок желатинового покрытия.

На фиг. 1 показано схематическое изображение подготовленной для эксперимента фотопластинки (вид сбоку).

На фиг. 2 представлена принципиальная электрическая схема устройства для измерения интенсивности светового потока, проходящего через гидролизованные участки желатинового слоя фотопластинки.

На фиг. 3 (a, b) представлена зависимость активности фермента проназы от его концентрации.

На фиг. 4 (a, b) представлена зависимость активности фермента трипсина от его концентрации.

На фиг. 5 представлены данные по определению активности протеиназ из различных источников.

Свежий или фиксированный в жидком азоте материал гомогенизировали на холоде (+4^oC) и экстрагировали 0,05 М трис-HCl-буфером, pH 8,0 в течение 24 час. Объем экстрагента и время экстракции для каждого случая подбирали экспериментально. Экстракты очищали центрифугированием при 1000-3000 g в течение 10-20 мин.

Подготовка фотопластин. Фотопластинка 1 (ТУ 6-17 778-76) размером 6х9 см помещается на строго горизонтальную поверхность, и на ее желатиновую поверхность 2 наносится 15 мл расплавленной на водяной бане 1,5% агарозы, приготовленной в 0,05 М Трис-HCl-буфере с 0,002 М CaCl₂, pH 8,0. После застывания геля 3 пробочным сверлом ( ⊘ 5 мм) вырезаются лунки 4 для внесения ферментного раствора. На фиг. 1 показано схематическое изображение подготовленной для эксперимента фотопластинки (вид сбоку). Ферментный раствор объемом 5 мкл вносится в лунки микропипеткой. Для исключения испарения раствора фермента из лунок 4 агарозный гель 3 покрывается целлулоидной пленкой. Фотопластинка 1 помещается во влажную камеру и ставится в термостат при 37^oC на определенное время. Затем с фотопластинки 1 удаляется гелевый слой 3, а сама фотопластинка 1 промывается под струей проточной воды для удаления гидролизованной желатины, промывается дистиллированной водой и сушится на воздухе. Фотопластинка 1 помещается между источником света 5 и фотоприемником 8 устройства для определения интенсивности светового потока. На фиг. 2 представлена принципиальная электрическая схема устройства для измерения интенсивности светового потока, проходящего через гидролизованные участки желатинового слоя фотопластинки (5 - источник света; 6 - стабилизированный источник питания; 7 - переменный резистор; 8 - фотоприемник; 9 - измерительный прибор). Измеряется интенсивность светового потока, проходящего через гидролизованные участки желатинового слоя фотопластинки 1.

Активность фермента определяется по формуле
A = (1•V)/t,
где A - активность фермента,
I - интенсивность светового потока (е),
V - объем ферментного раствора (мкл),
t - время протеолиза (мин).

Единица измерения активности фермента - e•мкл/мин.

На фиг. 3 представлена зависимость активности фермента проназы от его концентрации (10 - фотография фотопластины с гидролизованными участками желатины; 11 - график зависимости интенсивности светового потока от концентрации фермента проназы). По оси абцисс - C - концентрация фермента (мкг/мл), по оси ординат - I - интенсивность светового потока, проходящего через гидролизованный участок желатинового слоя (e). В таб. 1 приведены показатели активности проназы в зависимости от концентрации.

На фиг. 4 представлена зависимость активности фермента трипсина от его концентрации (12 - фотография фотопластины с гидролизованными участками желатины; 13 - график зависимости интенсивности светового потока от концентрации фермента трипсина). По оси абцисс - C - концентрация фермента (мкг/мл), по оси ординат - I - интенсивность светового потока, проходящего через гидролизованный участок желатинового слоя (е). В таб. 2 приведены показатели активности трипсина в зависимости от концентрации.

На фиг. 5 представлены данные по определению активности протеиназ из различных источников (14 - пшеница (сорт Жница), зараженная пыльной головней; 15 - гречиха Казанская; 16 - протеиназы Fusarium sp.). В таб. 3 приведены показатели активности желатингидролизующих ферментов из различных источников.

За единицу активности фермента принимали такое его количество, которое в стандартных условиях гидролизует площадь слоя желатины, размер которой соответствует повышению интенсивности светового потока на 1%.

Изобретение относится к биохимии, может быть использовано для определения активности протеолитических ферментов. Пробу ферментного раствора вносят в лунку. Лунку вырезают в слое агарозного геля, которым покрывают фотопластинку. Определяют активность протеолитическаих ферментов после прекращения реакции фермент-субстратного взаимодействия. Измеряют интенсивность светового потока, проходящего через гидролизованный участок желатинового покрытия. Способ позволяет определить активность протеолитичеких ферментов и расширить область применения. 5 ил., 3 табл.

Способ определения активности протеолитических ферментов, заключающийся в нанесении на необработанную фотопластинку с желатиновым покрытием пробы ферментного раствора и определении активности фермента после прекращения реакции фермент-субстратного взаимодействия, отличающийся тем, что пробу ферментного раствора вносят в лунку, вырезанную в слое агарозного геля, которым покрывают фотопластинку, а активность фермента определяют по интенсивности светового потока, проходящего через гидролизованный участок желатинового покрытия.