Изобретение относится к биогехноло- гии и может быть использовано для получения изопёнициллин-М-синтетдзы.
Сконструирована новая плазмидная ДНК , обеспечиващая экспрессию гена изопенициллин-М-синтетазы в клетках Escherlchia coll.
П р и м е р. А. Выделение плазмиды.
Лиофильную E.col K12 JA221-plT335 получают из Northern Regional Research Laboratories, Peorla, Kfinols под регистрационным номером NRRL B-15960. Этот лио фил можно непосредственно использовать как культуру в предлагаемом способе.
Штамм E.coll K12 JA221 инкубируют в 1 л 1 -бульона(10 гтриптона, ЮгМаС и 5 г дрожжевого экстракта на 1 л), содержащего 50 мкг/мл ампициллина при 37°С до достижения оптической плотности при 590 нм (О.ДбЭо) - единицы поглощения, добавляют 150 мг хлорамфеникола, инкубируют еще около 16ч.
Клетки центрифугируют со коростью 6000 об мин о течение 5 мин при 4°С. Полученную надосадочную жидкость сливают, а оста ток промывают в 40 мл ТЕ буфе; а (10 мМ трис-HCI, рН 7,5, 10 мМ NaCI и 1 мМ ЕДТА), затем снова осаждают. После повторного слиоания надосадочной жидкости клеточный остаток замораживают в бане со смесью сухой лед - этанол, оттаивают и по вторно суспендируют в 10 мл раствора 25%-ной сахарозы и 50 мМ ЭДТА. Затем добавляют 1 мл раствора, содержащего 5 мг/мл лизоцима, 3 мл 0,25 М ЕДТА, рН 8,0 и tOO мк 1 10 мг/мл РМАзы А, раствор инкубируют на льду в течение 15 мин. Затем добавляют 3 мл лизирующего раствора, полученного при смешивании 3 мл 10%-ного тритон-Х 100; 75 мл 0.25М ЭД i А, рН 8; 15 мл Ш трис-HCI, рН 8,0 и 7 мл воды перемешивают и инкубируют на льду в течение 15 мин. Лизированные клетки замораживают в бане со смесью сухой лед - этанол, а затем оттаивают.
fc
43
р
ел
о
OJ
Клеточные осколки удаляют из раствора центрифугированием при 25000 об/мин в течение 40 мин в SW 27 роторе (Бекман) и экстрагированием забуферированным фенолом, После добавления 30,44 г CSCI и 1 мл (5 мг/мл) раствора этидиумбромида обьем раствора устанавливают 40мл, декантируют в кювете VTiSO ультрацечтрифуги (Бекман), центрифугируют в VTI50 роторе при 42000 об/мин в течение 16ч. Полученную плазмидную полосу визуализируют, облучая ультрафиолетовым светом, выделяют, а затем центрифугируют при 50000 об/мин в течение 16 ч. Все необходимые изменения в объеме осуществляют добавляя TES-бу- фер, содержащий 0,761 г/мл CSCI. Плазмидную полосу снова выделяют, экстрагируют насыщенным солевым изо- пропанолом для удаления этидиумбромида, разбавляют 1:3 TES-буфером, добавляют два объема этанола, а затем инкубируют в течение ночи при -20°С. Плазмидную ДНК таблетируют k центрифугированием раствора в SS 34 роторе (Сорвал) в течение 15 мин при 10000 об/мин,
1 мг плазмидной ДНК, полученной таким способом суспендируют в 1 мл ТЕ-буфера (10 мМ трис-HCI, рН 8,0 и 1 мМ ЭДТА) и хранят при -20°С.
В, Конструирование плазмиды .
Лиофильную культуру клеток E.col K12 RV308/pCZ106 используют для инокулиро- вания 1 л L-бульона, содержащего 50 мкг/мл канамицина, а затем инокулированный бульон инкубируют при 25°С в воздушном шейкере до О Дбэо между 0,5 и 1 0 ед поглощения. Когда эти значения достигают интервала 0,5 -1,0 ед. поглощения в оптической плотности, температуру повышают до 37°С и продолжают инкубирование в течение 2 - 6 ч для неконтролируемой репликации.
После инкубирования при 37°С в течение 2 - 6 ч клетки собирают, плазмидную ДНК pCZ106 выделяют по примеру 1А. 5 мг плазмидной ДНКрС2106 суспендиру-от в 5 мл ТЕ-буфера.
К 25 мкг полученной плазмидной ДНК pCZ106 добавляют 10 мкг десятикратного BamHI-реакционного буфера, содержащего 1,5 М NaCI: 60 мМ трис-HCI, рН 7,9, 60 мМ MgCl2 и 1 мг/мл бычьей сыворотки альбумина (BSA), 50 ед. рестриктозы BamHI и 50 од рестриктазы N col в объеме 5 мкл и 55 мкл НаО. Полученный реакционный раствор инкубируют при 37°С в течение 4 ч, после реакция практически завершается.
N col-BamH реакционную смесь подвергают электрофорезу в 1 %-ном агароз- ном геле до четкого отделения целепых
фрагментов 1,6 kb N col-BamHi и 8,7 kb N col-N col от других продуктов расщепления, 0,3 kb рестрикционного фрагмента. Визуализацию обработанной электрофорезом ДНК осуществляют подкрашиванием геля в разбавленном растворе (0,5 мкг/мл) этидиумбромида и экспонированием подкрашенного геля длинноволновым ультрафиолетом. После определения положения
0 целевых фрагментов в геле делают небольшую щель перед каждым из целевых фрагментов и в каждую щель помещают небольшие кусочки мембраны Schleicher and Schuell (Keene, NH 03431) NA-45 ДЕАЕ.
5 При продолжении электрофореза ДHК деко- палентно связывается с ДЕАЕ мембраной, После того, как целевые фрагменты связы- raioii. 1 с ДСАЕ мембраной, эти мебраны итвлекают и промывают буфером, содержа0 щим 100 мМ КС, 0,1 М ЭДТА и 20 мМ трис- HCI рН 8. Затем каждую мембрану помещают в небопыиую ампулу и погружают в буфер, содержащий 1М NaCI, 0,1 мМ ПДТА и 20 мМ трио-HCI, рН 8, инкубируют
5 при 65°С в течение 1 ч для удаления ДНК с мемГ:раны После инкубирования при 65°С пнк/бационный буфер собирают, мембрану промыв шг.
Раствор ДНК устанавливают таким, что0 бы концентрация NaCI была 0.25М, и добавляют три объема холодного абсолютного этанола Затем полученные растворы смеши- оют и оставляют при (-70)°С на 10 - 20 мин. После охлаждения растворы центрифугиру5 ют при 15000 об/мин в 15 мин После ешо одного осаждения для удаление остаточной соли ДНК промывают этанолом, с1, пат, повторно суспендируют в 20 мкл буфера ТЕ, Полученные очищенные фрагмен0 ты l.bkbNcol-BarnHlM 8,7 kb N col-Ncol t фикционных фрагментов плазмиды pCZ GG отдельно растворяют в 25 мкл ТЕ буфера и хранят при (-20)°С.
25 мкг ДНК-г.лазмиды рьсщеп5 рестрикционными ферментами N col и BamHI, как описано выше. N col-BamHI- расщепленную ДНК помещает на 1%-ныи агарозиый гель и целевой 1.5 kb N col BamH рестрикционный фрагмент выде0 ляют, как описано выше. Получают приблизительно DMKI целевого фрагмента, л/спендр уют его в 25 мкл ТЕ-буфера и хра- , --. при 20°С
мкл 1,6 kb N col-Bamhl и 2,5 ,7 kb
5 N col-N col рестрикционных фрагментов плязмиды pCZ106, лигируют с 5мкл 1,5kb N coi-BamHI рестрикционного фрагмента плазмиды рП335 до получения плазмиды pi , Реакционны обьем составляет L f) мкл и включает указанные фрагменты
ДНК, 1,1 мкл ( 100 ед.) Т4 ДНК лигазы, 3 мкл 10-кратного лигирующего буфера (0,5 М трис-HCI, рН 7,8; 100 мМ MgCl2, 200 мМ дити- отреитола ЭДТТ); 100 мМ АТР; и 1 мг/мл BSA/ и 13,4 мкл H2U. Реакционную смесь инкубируют при 15°С в течение 2 ч. после чего реакция практически завершается. Ли- гированная ДНК составляет целевую плаз- мидную ДНК .
С. Конструирование E.coll K12 RV308/pT337.
А, Конструирование E.coll K12 RV308/plT337,
50 мл культуры E.coli K12 RV308 (NRRL В-15624) в L-бульоне выращивают до О.ДбЭО 0,5 единиц поглощения. Культуру охлаждают на льду в течение 10 мин, клетки собирают центрифугированием Осадок клеток повторно суспендируют в 25 мл холодного 100 мМ CaCl2 и инкубируют на льду в течение 25 мин. Клетки еще раз осаждают центрифугированием, осадок повторно суспендируют в 2,5 мл холодного 100 мМ CaCl2 и инкубируют на льду в течение ночи. 200 мкл этой клеточной суспензии смешивают с ли- гированной ДНК, приготовленной, как описано выше, инкубируют на льду в течение 20 мин, а затем клетки собирают центрифугированием. Клеточный осадок повторно суспендируют в 1 мл L-бульона, и эту сус- пензию инкубируют при 25°С в течение 1 ч. Аликвотные части смеси клеток помещают на L-агарные (L-бульон с 15 г/л агара) пластины, содержащие 50 кмг/мл канамицина, и эти пластины инкубируют при 25°С. Трансформанты E.coll K12 RV308/plT337 проверяют отбором на устойчивость к кана- мицину и рестрикциоиным ферментным анализом их плазмидной ДНК.
Некоторые изоляты E.coli K12 RV308/plT337 трансформантов по отдельности инокулируют в 5 мл аликвотных частей L-бульона, содержащего 50 мкг/мп канамицина, и инкубируют в воздушном шейкере при 25°С до тех пор, пока О Д590 не составит 0,2 ед, а затем при 37°С в течение приблизительно 6 ч.
Спустя 6 ч собирают по 1 мл каждой культуры клеток и центрифугируют. Клеточные осадки по отдельности промывают 1 мл 10 мМ NaCI, а затем суспендируют в 1,0 мл IPS экстрационного буфера (0,05 М трис- HCI, рН 8,0, 0.01М KCI и 0,01 MgS04) Клетки обрабатывают ультразвуком импульсами по 5,6 с, используя микронаконечники. Время между импульсами облучения ультразвуком составляет 60 с. Полученную смесь выдерживают в бане лед - этанол во время этой процедуры. После обработки ультразвуком клеточную смесь центрифугируют для удаления осколков, а затем используют непосредственно в анализе.
Контроль синтеза изопенициллина-N проводят в обьеме 500 мкл. Для начала реакции 1,0 мл раствора 1,4 мМ д -/L -а аминоадипил/-1 -цистеинил-0-валина и 3,75 мМ ДТТ оставляют при комнатной температуре на 30 - 60 мин для приведения любых димерных трипептидов в мономер0 ную форму. 50 мкл каждого из последующих исходных растворов помещают небольшими частями в контрольные ампулы (стерильные, стеклянные, ампулы 13 х 100 мм): в буфере 500 мМ трис-HCI. рН 7,4, 100 мМ
5 KCI; 100 мМ MgSCM; 1,0 мМ FeSCM и 6,7 мМ аскорбиновой кислоты. Затем добавляют различные количества экстракта, разбавленного водой до объема 150 мкл. Около 100 мкл аликвотных частей раствора три0 пептида добавляют затем в каждую ампулу; добавление трипептида начинает реакцию. Каждую ампулу встряхивают, помещают в гиротропную шейкерную баню при вращении со скоростью 250 об/мин,
5 при температуре 25°С и инкубируют 45 мин.
Затем отбирают два образца по 100 мкл
каждый, капают в выемки пластинок для
биоанализа и к остальному доЬав яют 100 ед.
пенициллиназы В каждую реакционную
0 смесь добэвля от по 5 мкл 00 сзд ) регидра- тированной пенициллиназы-А и оставляют на 5 мин при комнатной температуре а затем по 100 мкл каждого экстракта, оСоабо- танного пенициллиназой-А, помещают в
5 углубление на пластинке для биоанализа. Такую обработку пенициллиназпй-А проводят для проверки того, чтобы увериться, что зоны на пластине для биоанализа связаны с наличием пенициллина, а не цефадостори0 на или других примесей
Стандартную кривую пенициллин -N получают, добавляя 0,5; 2,0; 5,0,10,0 и 20,0 мкг пеницмллина-N в углубление на пластинках для биоанализа. Активность пеницилли5 назы-А проверяют также, дооаь .пяя 5 мкл ферментного препарата к 200 мкл 0,2 мкг/мл пенициллина N.
Пластины для биоанализа состоят из К131 питательного агара который пслуча0 ют, растворяя 30,5 г BBL Antibiotic Medium в 1 л деионизированной воды, доводя раствор до кипения, охлаждая до 70°С, а затем выдерживая в автоклаве 35 мин при 121°С и давлении 1,055 кг/см2. Затем пластины
5 засевают 4 мл свежей ночной культуры Mlcrococcus luteus (ATCC 9341), a-на 700 мл агара М.luteus выращивают в К544 питательном бульоне, который содержит Dlfco пептона 5,0 г; Dlfco дрожжевого экстракта 1,5 г; хлористого натрия 3,5 г безводного дикалийфосфата 3,7 г; монокалийфосфата 1,3 г; Dlfco бычьего экстракта 1,5 г в 1 л деиони- эированной воды. Раствор доводят до кипения, охлаждают до 25°С, доводят до рН 7,0 1 н. HCI или 1 и. NaOH, а затем выдерживают в автоклаве в течение 20 мин при 121°С и давлении 1,055 кг/см3 перед употреблением. Засеянный агар помещают в пластины 100 х 15 мм в количестве 15 мл засеваемого агара на пластину. Углубления получают отсасыванием 5 мл пипеткой; каждое углубление имеет диаметр 10 мм.
После подготовки пластин образцы помещают в эти углубления и инкубируют при 37°С 18ч. Результаты анализа определяют измеряя диаметр чистых поверхностей вокруг каждого углубления с образцом, которое образовывается из-за того, что M.luteus не могут расти в присутствии пенициллина.
Хотя линейность анализа по измерению размера «он заметно падает, когда размер зоны превышает 21 мм, результаты анализа показывают, что E.caU K12 RV308/pfT337 трансформанты экспресси- руют активность синтетазы иэопеницилли- на-N, тогда как трансформанты Е.соП К12 RV308/pCZ106 зтого не делают.
Фермент, продуцируемый Е.соП, существенно более стабилен, нежели синтета- за иэопенициллина N, полученная из Cephalotportun acremonlum. Эта более высокая стабильность проявляется е экспериментах по замораживанию и оттаиванию. Синтетаэа изопенициллина С.acremonlum быстро инактивируется при замораживании и оттаивании, но синтетаза изопеницилли- на-N, продуцированная Е.соП, достаточно
устройчива к замораживанию и оттаиванию. Более высокая стабильность связана с разницей в обработке фермента между С.acremonlum и Е.соП. Так, например, синтетаза изопенициллина-N, выделенная из С.acremonlum, не содержит первых двух аминотерминальных аминокислотных остатков, метионина и глицина, которые имеются в ДНК, кодирующей активность синтетазы изопенициллина-N С.acremonlum и которые также присутствуют в предлагаемом материале, продуцируемом Е.соП.
Формула изобретения
Способ получения рекомбинатной плаз- мидной ДНК , экспрессирующей изо- пенициллин-М-синтетазу, заключающийся в том, что из штаммов бактерий Escherlchla coll K12 JA22./plT335 и E.coll K12 RV308/pCZ106 выделяют плазмиды, которые подвергают обработке эндонуклеазами рестрикции с получением N col-N col и N col-Bam HI фрагментов плазмиды pCZ106 размером 7,8 kb и 1,5 kb, а также N col- BamHI фрагмента плазмиды размером 1,5 kb; полученные фрагменты лигирукп с помощью ДНК-лигазы в буфере, содержащем 50 ммоль грис-НС1, 10 ммоль MgClz, 200 ммоль ДТТ, 10 ммоль АТФ, бычий сывороточный альбумин, рН 7,8 при комнатной температуре и концентрации ДНК 1 мг/мл в течение около 2 ч, полученной рекомби- нантной ДНК трансформируют штамм бактерий E.coll RV308 с отбором устойчивых к канамицину клонов, способны х экспрессиро- вать активность изопенициллина-Ы-синтета- зы, и выделением целевой плазмидной ДНК.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения изопенициллин-М-синтетазы. Сконструирована новая плаэмидная ДНК , обеспечивающая экспрессию гена изопенициллин-М-синтетазы в клетках E.coll. Плазмиды pCZ106 и обрабатывают эн- донуклеазами рестрикции с получением NCOI-NCO и NCOI-BamHi фрагментов плаз- миды pCZ106 размером 7,8 kb и 1,5 kb, а также NCOI-BamHI фрагмента плазмидь plT33S размером 1,5 kb: полученные фрагменты ли- гируют с помощью ДНК-лигазы.
