Способ определения специфической флуоресценции лимфоидных клеток крови Советский патент 1987 года по МПК G01N33/533 

11328757

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии.

Цель изобретения - повьш1ение точ- i ности и ускорение способа определения,,;

Способ осуществляется следующим образом.

Лимфоидные клетки крови из разных источников (свежевыделенные клетки

крови, клетки из культур ткани) инку- 10 ослабления интенсивности светового бируют 30 мин при комнатной темпера- потока матовый светофильтр (МС 13-2). туре в 2,5%-номрастворе ЭДТР, в котором содержится метиорлат 1:10000, и затем трижды отмывают этим же раствоИзмерения проводят в следующем порядке.

Убирают один из микрозондов флюором. После последнего отмывания клет- 15 риметра. Устанавливают возбуждающее

ки суспензируют в одной капле раствора ЭДТА и каплю клеточной взвеси наносят на чистое, хорошо обезжиренное предметное стекло.

Предметное стекло с нанесенной каплей клеточной взвеси инкубируют 3 мин во влажной камере, затем стекло несколько раз проводят над пла- ;менем горелки и погружают ребром в сосуд с водопроводной водой для удаления неприкрепившихся к стеклу клеток Полученный мазок несколько раз промывают водопроводной водой, подсушивают на воздухе и окрашивают флюорохромированной нтисывороткой против излучаемых иммуноглобулинов,, Рабочее разведение антисыворотки и время окрашивания подбирают в предварительных опытах.

, После окрашивания препараты промывают в водопроводной воде, высушн вают, после они готовы для исследования. Изучение окрашенных клеточных препаратов проводят в цито флюориметре типа„ Люмам-И. Перед х исследованием из цитофлюориметра убирается один из микрозондов для того, чтобы обеспечить измерения не с участка, ограниченного размерами микрозонда, а со всего участка клеточного препарата, находящегося в

.поле объектива.

При измерении зеленой флюоресценции с максимумом излучения 530 нм устанавливают следующую систему возбуждающего освещения: светоделитель- ная пластинка темного поля, возбуждающие фильтры СЭС 24-4, ФС 1-4; эпи- объектив 21кО,40; вместо запирающего фильтра в цитофлюориметре устанавливается интерференционный светофильтр с максимумом пропускания, соответствующим максимуму флюоресценции 530 нм (фильтр № 8 в ЦФМ Люмам-И).

При измерении светорассеяния с максимумом излучения 410 нм (возбуждающий светофильтр ФС-1-4) используется интерференциональный фильтр с соответствующим максимумом пропускания 410 нм (фильтр № 3 в ЦФМ Люмам- И-3). Кроме того, в возбуждающую систему дополнительно вводится для

ослабления интенсивности светового потока матовый светофильтр (МС 13-2).

Измерения проводят в следующем порядке.

Убирают один из микрозондов флюо

5

освещение сверху и регулируют его и темнопольный вариант. Устанавливают поворотом диска интерференционный светофильтр № 8. Устанавливают на предметный столик стекло с окрашенными клетками и наводят резкость (эта операция выполняется с одним из оставшихся микрозондов цитофлюориметра) .

Поворотом диска устанавливают положение, соответствующее убранному микрозонду. Открывают диафрагму фотоэлемента, снимают показания регистрирующего прибора. Измерение сум- 0 марной флюоресценции закончено.

В систему возбуждающего освещения вводят матовый светофильтр. Поворотом диска устанавливают интерференционный фильтр № 3. Открывают диаф-, g рагму фотоэлемента, снимают показания регистрирующего прибора« Измерение суммарного светорассеяния закончено .

Величину су1 1марной флюоресценции /F/ делят на величину светорассеяния /L/, Полученная величина соответствует средней внутриклеточной концентрацрш изучаемого иммуноглобулина.

В системе возбуждающих фильтров добавляют матовый светофильтр МС- 13-2..

Устанавливают интерференционный светофильтр № 3, открывают диафрагму фотоэлемента. На регистрирующем приборе показания 0,579 В,

Суммарную величину флюоресцанции 0,221 В делят на суммарную величину светорассеяния 0,579 В. Средняя внутриклеточная концентрация иммуноглобулинов составляет 0,382.

Пример,, Больная Г. Диагноз: бронхиальная астма. Лимфоидные клетки крови выделяют путем центрифуги0

5

0

5

рования в градиенте плотности фикол- верографин, инкубируют 30 мин при комнатной температуре в 2,5%-ном растворе ЭДТР, содержащем метиорлат 1:10000, и трижды отмывают в этом же растворе. Клеточный осадок ре- суспензируют в одной капле промывающего раствора и каплю взвеси наносят на предметное стекло. Стекло инкубируют 3 мин во влажной камере при комнатной температуре, после чего стекло несколько раз проводят над пламенем горелки и погружают несколько раз ребром в сосуд с водопроводной водой. На месте капли остается четко заметное клеточное пятно.

После просушивания на клетки наносят одну каплю антиглобулиновой люминисцирующей сыворотки в разведении 1:3 (рабочий титр на этикетке 1:16), инкубируют 30 мин во влажной камере при комнатной температуре, погружают иа 10 мин в водопроводную воду, подсушивают к проводят измерения клеточных флюоресценции и светорассеяния.

Из цитофлюориметра убирают микрозонд 0,1 мкм. Возбуждающее освещение сверху устанавливают по методу темного поля. Фильтры СЗС - 24-4; ФС-1-4. Интерференциониый фильтр № 8 эпиобъектив темного поля ,40, ток лампы 4 А.

Устанавливают один из сохранившихся микрозондов (0,5 мкм) и наводят

Редактор П.Гереши Заказ 3480/48

Составитель В.Фролова Техред М.Ходанич

Корректор

Тираж 776Подписное

BHHPfflH Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул.Проектная,4

328757

резкость на изображении участка окрашенного препарата. После этого устанавливают положение, соответствующее убранному зонду (0,1 мкм), и открывают диафрагму фотоэлемента. На регистрирующем приборе показания 0,221 В.

Поставленная: цель достигается тем, что известным способом увеличе- ; ние внутрикисточной концентрации иммуноглобулинов определяют в 70% случаев, с помощью предлагаемого способа - в 100%, т.е. чувствительность предлагаемого способа в 1,4 раза вьш1е, при этом время иа выполнение измерений в 20 раз меньше.

Формула изобретения

Способ определения специфической

флюоресценции лимфоидных клеток крови, включаюшзий окрашивание клеток специфическими антителами, связаниы- ми с флюорохромом и имерение флюоресценции под микроскопом с помощью фшо- ориметра, отличающийся тем, что, с целью повьщ1ения точности и ускорения способа, измерение флюоресценции осуществляют при малом увеличении, дополнительно устанавливают величину светорассеяния и определяют специфическую флюоресцен цию лимфоидных клеток по отношению величины флюоресценции к светорассеянию.

Корректор А.Зимокосов

Изобретение относится к иммунологии. Цель изобретения - повьппение точности и ускорение способа определения. Лимфоидные клетки крови инкубируют и после отмывания суспензируют. Клеточную взвесь после нанесения на стекло инкубируют. Мазок подсушивают, окрашивают фпюорохромиро- ванной аитисывороткой и проводят измерение клеточной флюоресценции и светорассеяния. Чувствительность способа повышается в 1,4 раза. оо 1C 00 СП |