Способ определения молочной кислоты в биологических жидкостях Советский патент 1987 года по МПК G01N33/66 

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано в клинической лабораторной диаг нос- тике.

Цель изобретения - повышение точности способа за счет внесения в су- пернатант соляно-кислого семикарба- зида.

Способ осуществляется следую дим образом.

Применяют реактивы: моль/л. (5%) водный раствор сульфосалициловой кислоты; серная кислота для пробы Са- валя; 0,500 моль/л (12,5%) водный раствор серно-кислой пятиводной меди) ; 0,179 моль/л (2%) водный раствор солкно-кислого семикарбазида.

Рабочий реактив получают следующим образом. К 99,0 мл серной кислоты для пробы Саваля добавляют 0,6 мл 0,500 моль/л раствора серно-кислой меди, перемешивают и добавляют 0,4 мл 0,179 моль/л раствора соляно-кислого

семикарбазида. Перемешивают и ставят

o

рз иодянук) баню с температурой 70 С па 30 мин, после чего реактив вынимают из бани и охлаждают до комнатной температуры.

Кроме того, применяют 0,088 моль/л (1,,5%) раствор параоксидифенила в ди- метилформамиде,

В пробирку наливают 0,4 мл 0,229 моль/л раствора сульфосалициловой кислоты, вносят в нее 0,02 мл цельной крови (плазмы крови, сыворотки крови, спинно-мозговой жидкости)5 тщательно перемешивают и через 10 мин центрифугируют в течение 10 мин при 3000 об,/мин, 0,3 мл супернатанта переносят в другую пробирку, которую по меш,аюу в холодную водяную баню с температурой воды , после чего в нее добавляют 2,6 мл рабочего реактива, тщательно перемешивают и прогревают в водяной бане с температурой воды 70 С в течение 10 мин. Пробирку охлахчдают водопроводной водой, добавляют в нее 0,05 мл 0,088 моль/л раствора параоксидифенила, тщательно пере меш15вают и оставляют при комнатной температуре на 60 мин.

Пробу вновь прогревают в водяной бане с температурой воды 70 С в течение 4 мин, охлаждают водопроводной водой до комнатной температуры и фото метрируют на спектрофотометре при X -- 570 нм против контроля на реактивы в кювете с толщиной рабочего слоя

358802

10 мм. Контрольную пробу обрабатывают так же, как и опытную, но вместо исследуемой биологической жидкости , используют дистиллированную воду в том же объеме.

Количество молочной кислоты в опытной пробе высчитывают с учетом оптической плотности эталонной пробы с известной концентрацией молочной кис10

лоты, которую также проводят через всю методику. Расчет ведут по формуле

Е.

on

ЕX С„

(1)

где

С и on

с„ 0

ЕОП «

О

концентрации молочной кислоты в опытной и эталонной пробах соот- Bf TCTBeHHo; оптические плотности опытной и эталонной пробы соответственно. Повышение точности определения молочной кислоты по предлагаемому спо- 5 собу по сравнению с известным способом подтверждается при экспериментальном исследовании растворов молочной кислоты с концентрациями 0,555; 1,110 и 2,220 ммоль/л цельной крови, плазмы крови и спинно-мозговой жид

ены в табл, , Проводят по 5 паралельных определений каждой пробы.

Сравнительный анализ результатов статистической обработки величин оптической плотности цветного продукта реакции при определении .молочной кислоты по предлагаемому и известному способам показывает, что в первом случае при большем значении cpeд} eй арифметической (М) величины средней ошибки средней арифметической (т) и среднеквадратического отклонения (С ) значительно ниже, чем при определении молочной кислоть: по известному способу, что свидетельствует о большей точности пр)едлагаемого способа.

Пример 1, Определение молочной кислоты проводят в отдельных пробах цельной крови, шшзмы крови, сыворотки крови, спинно-мозговой жидкости и эталонного раствора молочной кислоты, причем из каждой пробы делают по три параллельных определения и рассчитывали М, m и G ,

В шестнадцать пробирок наливают по 0,4 мл 0,229 моль/л раствора сульфосалициловой кислоты и вносят в пробирки 1-3 по 0,02 мл цельной кро

31

ви, в пробирки 4-6 0,02 мл плазмы крови, в пробирки 7-9 0,02 мл сывороки крови, в пробирки 10-12 0,05 мл спинно-мозговой жидкости, в пробирки 13-15 0,02 мл эталонного раствора молочной кислоты с концентрацией 1 ммоль/л в пробирку 16 0,02 мл дистиллированной воды (контроль на реактивы) .

Пробы тщательно перемешивают и через 10 мин центрифугируют в течение 10 мин при 3000 об/мин. 0,3 мл супер натанта из каждой пробиррси переносят в другие пробирки с соответствующими номерами, которые помещают в водяную баню с температурой воды ,после чего в них добавляют по 2,6 мл рабочего реактива (п ислолъзованпсм 0,6 мл 0,480 моль/л серна-кислой пя- тиводной меди + 0,4 мл 0,170 ioль/л соляно-кислой семикарбазида - серной кислоты для пробы Саваля до 100),

Пробы тщательно перемешивают и прогревают в водяной бане с температу- рой воды 70°С в течение, 10 мин, после чего охлаждают водопроводной водой, добавляют в них по 0,05 мл 0,088 моль/л раствора параоксидифе- нила, тщательно перемешивают и остав- ляют при комнатной температуре на 60 мин. Затем пробы вновь прогревают в водяной бане с температурой воды 70 С в течение 4 мин, охлаждают водо

проводной водой до комнатной температуры и фотометрируют опытные и эталонную пробы на спектрофотометре при Л 570 нм против контроля на реактивы.

Количество молочной кислоты в опытных пробах высчитывают по формуле (1)

Получают следующие результаты измерения оптической плотности опытных и эталонных проб 0,187; Едп - 0,184; Е,,, 0,186; Е„„ 0,225; Е„„, 0,227; Е„„, 0,223; Е,„, 0,268; Е„,з 0,266; ЕО,, 0,264; Е,„,, 0,367;

35

40

45

она

ОП11

-oni

0,363; ЕО„„ 0,365; ЕОП,, 0,230;

0,231; Е,„,, 0,229.

Средняя EQJ,,.J 0,230. По формуле (1) рассчитывают концентрацию молочной кислоты в опытных пробах

COHI 0,813 ммоль/л; Сопг - 0,800 ммоль/л; Сопэ 0,808 ммоль/л.

Таким образом, для пробы цельной крови

М 0,807; m ±0,0046; G - 0,0065.

оп4. 0,978 ммоль/л; Сд„5 0,987 ммоль/л; Сопб 0,969 ммоль/л.

ля пробы плазмы крови

М 0,978; m ±0,0063; С 0,0090,

С 1,165 ммоль/л;

ong оп9

, 156 ммоль/л; 1,148 ммоль/л.

Для пробы сыворотки крови

1,156;

+0,0060;

0,0085. 1,595 ммоль/л; 1,578 ьпчоль/л; - 1,587 ммоль/л.

25 зо

35

40

45

Для пробы спинно-мозговой жидкости

М 1,586; га fO,0060; G 0,0085.

В тех же образцах цельной крови, плазмы крови, сыворотки крови и спинномозговой жидкости (по три парал- лельнь х определения из каждой пробы) способом, описанным в примере 1, но с использованием рабочего реактива с максимальными значениями концентраций меди сернокислой пятиводной и семикарбазида солянокислого (0,6 мл 0,520 моль/л серно-кислой пятиводной меди + 0,4 мл 0,201 моль/л солянокислого семикарбазида + серная кислота для пробы Саваля до 100,0 мл), определяют количество молочной кислоты.

Получают следуюпще практические результаты измерения оптической плотности опытных и эталонной проб: Е, 0,189; Е„„ 0,187; Е,„, 0,186; Е.,,0,223; Е,, 0,225; Е,,, 0,226; Ерп (сыворотка крови) 0,268; Е

ОП8

0,270;Eonq 0,266;Е„„,о 0,367; 0,364; Е„„,, 0,364; Е„„„ 0,232; Е,,, 0,229; Е,, 0,231. Средняя Е.,„,,, 0,231.

ОП11

ОП1М55

По формуле (1) рассчитывают концентрацию молочной кислоты в опытньгх пробах

Сд, 0,818 ммоль/л;

Соп2 0,809 ммоль/л; Сопл 0,805 ммоль/л.

Таким образом, для пробы цельной рови

М 0,810; m .±0,0047; б 0,0066,

оп О 965. ммоль/л; GO 0,974 ммоль/л; 0,978 ммоль/Ло

Для пробы плазмы крови М 0,972; m +0,0047; СГ 0,0066.

1,160 ммоль/л; 1,169 ммоль/л; 1,1 5,1 ммоль/л.

Для пробысыгзоротки крови

М 1,Г60,

m +0,0063;

G 0,009.

С

С с С.

ото

1,588 ммоль/л; 1,575 ммоль/л;

пробы Саваля, нагревания, а за лаждения и добавления в пробу ра параоксидифенила, пцсле чег водят спектрофотометрическое и 25 ние, отличают, ийся что, с целью повышения точност соба, в супернатант дополнител вносят соляно-кислый семикарба смеси с реактивами при следующ

oiTCi 0,575 ммоль/л. Для пробы спинно-мозговой жидкости 30 отношении компонентов, моль/л:

Серно-кислая пяти- водная медь

М 1,579; m ,0053;

G Oj0075.

Результаты определения молочной кислоты в одних и тех же пробах биоло 0,48Семикарбазид солянокислый0,1735 Серная кислота для

пробы СаваляДо

Раствор молочнор кислоты

0,555 ммоль/л

То же,

,110 ммоль/л

гических жидкостей с использованием рабочего реактива с минимальными и максимальными значениями концентраций серно-кислой пятиводной меди и солянокислого семикарбазида представлены в табл. 2.

Сравнительный анализ с использованием статистической обработки не выявил различий между ними.

Формула изобретения

Способ определения молочной кис- лоты в биологических жидкостях путем добавления в пробу химического реактива, центрифугирования полученной смеси с последующим внесением в су- пернатант раствора серно-кислой пяти- водной меди и серной кислоты, для

пробы Саваля, нагревания, а затем охлаждения и добавления в пробу раствора параоксидифенила, пцсле чего проводят спектрофотометрическое измере- ние, отличают, ийся тем, что, с целью повышения точности способа, в супернатант дополнительно вносят соляно-кислый семикарбазид в смеси с реактивами при следующем соотношении компонентов, моль/л:

Серно-кислая пяти- водная медь

0,480,52 Семикарбазид солянокислый0,170,20 Серная кислота для

пробы СаваляДо 100

Таблица 1

М 0,079

m ±0,0067

6 0,0149

М 0,174

m ±0,0115

5 0,0257

1335880

8 Продолжение табл.1

Изобретение относится к медицине. Цель изобретения - повышение точности способа. Смешивают раствор суль- фосалициловой кислоты и исследуемую биологическую жидкость и центрифугируют. Супернатант помещают в водяную .баню, смешивают с рабочим реактивом и нагревают.Полученную смесь смешивают с раствором параоксидифенила,прогревают, охлаждают и фотометрируют. Количество молочной кислоты в опытной пробе высчитывают с учетом оптической плотности эталонной пробы с известной концентрацией молочной кислоты.2 табл. 00 со ел 00 00