Способ определения сиаловых кислот в биологическом материале Советский патент 1987 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к области биохимии, а именно к анализу биологи- объектов, и может быть использовано при исследовании биохимических процессов в организме человека и животных, а также в клинической практике для диагностических и прогностических целей.

Цель изобретения - повьш1ение чув- ствительности способа.

На чертеже представлен калибровочный график.

Способ осуществляют следующим образом.

Исследуемьй материал подвергают гидролизу в 0,05 М растворе серной кислоты при 80 С в течение 60 мин. При этом происходит освобождение сиа- ловых кислот, входящих в состав гли- копроТеидов и гликолипидов исследуемой пробы.

После охлаждения до комнатной температуры гидролизат подвергают перио- датному окислению. Для этого к опре- деленному объему гидролизата, содержащего 3 - 25 нмоль сиалоБой кислоты добавляют свежеприготовленный раствор 0.5,025-М йодной кислоты в 0,125 М НС1 до конечной концентрации 5 ммоль/л пробу перемешивают и вьщерживают 30 мин при 37°С.

Избыток йодной кислоты, мешающий дальнейшему определению сиаловой кислоты, разрушают тиомочевиной или ацетилтиомочевиной, которые добавляют к исследуемой пробе в концентрации 44-88 и 38-75 ммоль/л соответственно Пробу перемешивают, после чего вносят 39-50 мкмоль/л 2 тиобар.битуровой кислоты (рН 9,0), опять перемешивают и помещают в кипящую водяную баню на 7-10 мин. Затем пробу охлаждают 1- 2 мин в водяной бане со льдом и столько же выдерживают в термостате при

J/ С, после чего окраску экстрагирую

бутанолом, содержащим 0,69-1,03 моль/ о-фосфорной кислоты. Экстракцию осуществляют энергичным встряхиванием пробы с последующим центрифугированием при 2000-3000 об/мин в течение 3-5 мин.

Окрашенную верхнюю органическую фазу отделяют и измеряют ее оптическую плотность при 550 нм на. спектро-- фотометре. Контролем в данном случае является 0,05 М раствор серной кислоты, обработанный подобным образом.

0

д

5

5 .,,,

45

35

0

0

55

Концентрацию сиаловой кислоты рассчитывают по калибровочному, графику.

Способ поясняется следующими примерами.

Пример 1. Количественное определение сиаловой кислоты в сыворотке крови с использованием тиомоче- вины,

В центрифужную пробирку вносят 0,8 мл 0,05 М раствора серной кислоты и 0,005 мл исследуемой сыворотки, накрывают сверху стеклянной пробкой и пробирку помещают в термостат при 80°С на 60 мин. По окончании гидролиза пробу охлаждают до комнатной температуры, добавляют 0,2 мл 0,025 М раствора йодной кислоты в 0,125 М НС1, перемешивают и вьщерживают в термостате 30 мин при 37 С. Затем прибавляют 0,2 мл 2,5%-ного водного раствора тиомочевины, пробу взбалтывают, вносят 1,0 мл дистиллированной воды и 0,6 мл 0,2 М раствора тиобар- битуровой кислоты, доведенного 1 М раствором .NaOH до рН 9,0. Пробу нак- рьшают сверху стеклянной пробкой и помещают в кипящую водяную баню на 10--мин. После этого пробу охлаждают 2 мин в водяной бане со льдом и столько же выдерживают ее в термостате при 37°С. Образовавшийся окрашенный продукт (хромоген) экстрагируют 2 мл н-бутанола, содержащего 5 по объему 85%-ной о-фосфорной кислоты. Экстракцию осуществляют путем энергичного встряхивания пробы с последующим ее центрифугированием при 3000 об/мин в течение 5 мин.

Оптическую плотность окрашенной органической фазы измеряют на спект 7

рофотометре СФ-26 при 550 нм против холостой пробы, которая абрабатьшает- ся, как и опытная, но сьшоротки не содержит. Окраска устойчива в течение нескольких часов.

Поскольку объем органической фазы недостаточен для наполнения стандарт- . ной кюветы (10 мм) спектрофотометра СФ-26,, при измерениях оптической плотности необход.имо использовать оптическую приставку ,для фотометрии малых объемов раствора.

Концентрацию сиаловых кислот в исследуемой сыворотке рассчитывают по формуле

X а 0,2,,(1)

3 13559334

где а - найденное по калибровочномучестно сиаловых кислот (в данном слуграфику количество сиаловойчае ,93 нмоль). Далее по форму кислоты в исследуемой пробе,ле (1) вычисляют концентрацию сиало0,2 - коэффициент пересчета. вой кислоты в исследуемой сыворотке

Дпя построения калибровочного гра-(3,59 ммоль/л),

фика готовят ряд. разведений основногоП р е р 3. Количественное опстандартного раствора, содержащегоределение сиаловых кислот в эритро100 мг/л (323,3 ммоль/л) сиаловойцитах с использованием тиомочевины.

кислоты. Каждое рабочее разведениею Гепаринизированную кровь центрифуобрабатьгоают, как описано выше. .Холо-гируют при 3000 об/мин 7 мин, плазму

стую пробу обрабатьшают аналоги Лю, и верхний слой осадка форменных элено вместо рабочего разведения сиало-ментов, содержащий преимущественно

вой кислоты используют 0,8 мл 0,05 Млейкоциты, удаляют. Затем осадок

раствора серной кислоты. После изме-is эритрЬцитов трижды промьшают 0,9%-ным

рения оптической плотности растворовраствором хлористого натрия путем

строят калибровочный график (см. чет-центрифугирования при описанном ретеж).жиме.

Оптическая плотность (D) исследуе-В центрифужную пробирку берут

мого образца сьгооротки крови 0,300.20 - эритроцитарной массы, добавляПо калибровочному графику находят ко-ют 0,7 мл 0,9%-ного раствора NaCl

личество сиаловых кислот (в данноми 1 мл 0,1 М раствора соляной кисло-,

случае ,81 нмоль). Далее по форму-ты, тщательно перемешивают, накрывале (1) вычисляют концентрацию сиало-ют сверху стеклянной пробкой и провых кислот в исследуемой сьторотке25 бирку помещают в термостат при 80°С

(2,16 ммоль/л). на 60 мин. По окончании гидролиза

Пример 2. Количественное оп-пробу охлаждают до комнатной темпераределение сиаловых кислот в сывороткетуры, после чег.о добавляют 0,1 мл

крови с использованием ацетилтиомоче-30%-ного раствора K FeCCN ЗН,0 и

вины. 30 О,1 мл 40%-ного раствора уксуснокисПредварительный гидролиз исследуе-лого цинка, тщательно перемешивают

мого образца сыворотки крови и перио-и центрифугируют при 3000 об/мин в

датное окисление пробы проводят ана-течение 7 мин. В другую чистую прологично примеру 1. Далее в пробубирку отбирают 0,8 мл прозрачной навносят 0,8 мл 1,5%-ного раствора .досадочной жидкости, добавляют 0,2 мл

ацетилтиомочевины, взбалтьшают, до-0,025 М раствора периодата натрия в

бавляют 0,4 мл дистиллированной воды0,5 М растворе серной кислоты и выи 0,6 МП 0,2 М раствора тиобарбитуро-.держивают 30 мин при 37 С.

вой кислоты, доведенного 1 М раство-Затем прибавляют 0,2 мл 2,5%-ного

ром NaOH до рН 9,0, накрьшают сверху о раствора тиомочевины, пробу взбалтыстеклянной пробкой и помещают в кипя-вают, вносят 1,0 мл дистиллированной

щую водяную баню на 10 мин. Затем .воды и 0,6 мп 0,2 М раствора тиобарпробу охлаждают 2 мин в водяной бане битуровой кислоты, доведенного 1 М

со льдом и столько же. ьщерживают враствором NaOH до рН 9,0. Пробу нактермостате при 37°С, добавляют 2 рьшают сверху стеклянной пробкой и ..

н-бутанола, содержащего 5% по объемупомещают в кипящую водяную баню на

85%-ной о-фосфорной кислоты, энергич-10 мин. Затем пробу охлаждают 2 мин

но встряхивают и центрифугируют 5 минв водяной бане со льдом и столько же

при 3000 об/мин.выдерживают в термостате при 37°С,

Оптическую плотность окращенной. добавляют 2 мл н-бутанола, содержаще- органической фазы измеряют на спект-го 5% по объему 85%-ной о-фосфорной рофотометре СФ-26 при 550 нм противкислоты, энергично встряхивают и цен- холостой пробы, которая обрабатьшает-трифугируют 5 мин при 3000 об/мин. ся, как и опытная, но сыворотки неОптическую плотность окрашенной содержит. Окраска устойчива в течение органической фазы измеряют на спект- нескольких часов.сРофотометре СФ-26 при 550 нм против

Оптическая плотность исследуемогохолостЬй пробы, которая обрабатьшаетобразца сыворотки крови. ,540. Пося, как и опытная, но эритроцитов не

калибловочному графику находят коли- содержит (вместо эритроцитарной массы

берут 0,1 МП 059%-ного раствора NaCl), Концентрацию сиаловой кислоты в роцитах рассчитьшают по формуле

X а.25,(2)

где а - найденное по калибровочному графику количество сиаловой кислоты в исследуемой пробе;

25 - коэффициент пересчета.

Оптическая плотность исследуемого образца эритроцитов донора ,370. По калибровочному графику находят количество сиаловой кислоты (в данном случае ,32 нмоль). Далее по формуле (2) вьмисляют концентрацию сиа- ловых кислот в исследуемом образце : эритроцитов. (333,0 мкмоль/л) ,

П р и м е р 4. Количественное определение сиаловой кислоты в эритроцитах с использованием ацетилтиомо- Ч,евины.

Получение эритроцитарной массы, гидролиз и периодатное окисление пробы проводят аналогично примеру 3.

Дапее избыток периодата разрушают добавлением 0,8 мл 1,5%-ного раствора ацетилтномочевины, пробу взбалтывают, вносят 0,4 мл дистиллированной воды и 0,6 мл 0,2 М раствора тиобарбитуро- вой кислоты, доведенного 1,М раствором NaOH до рН 9,0, накрывают сверху . стеклянной пробкой и помещают в кипящую водяную баню на 10 . Затем пробу охлаждают 2 мин в водяной бане со льдом и столько же выдерживают в термостате при 37°С, добавляют 2 мл н-бутанола, содержащего 5% по объему 85%-ной о-фосфорной кислоты, энергично встряхивают и центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин.

Оптическую плотность окрашенной органической фазы измеряют на спектрофотометре СФ-26 при 550 нм против холостой пробы, которая обрабатывает- бя, как и опытная, но эритроцитов не содержит (вместо эритроцитарной массы берут 0,1 мл 0,9%-ного pacTBopa NaGl) , Оптическая плотность исследуемого об- :разца э риТроцитов донора ,315.

5

0

По калибровочному графику находят количество сиаловой кислоты (в данном случае ,46 нмоль). Далее по формуле (2) вычисляют концентрацию сиа- ловых кислот в исследуемом образце , эритроцитов (261,5 мкмоль/л).

Предлагаемый способ достаточно специфичен, воспроизводим, дает правильные результаты, обладает большей чувствительностью по сравнению с известным способом. Использование тио- мочевины и ацетилтиомочевины повьшает чувствительность предлагаемого способа на 20 и 26% соответственно.

Это позволяет более тонко улавливать изменения концентрации сиаловой кислоты в организме при различных патологических состояниях.

Кроме того, предлагаемый способ по сравнению с известным является менее токсичным, поскольку исключает использование сильноядовитого арсенИ- та натрия, а также высоколетучей, агрессивной смеси бутанола с соляной кислотой.

Форм, ула изобретения

5

Способ- определения сиаловых кислот в биологическом материале путем его гидролиза серной кислотой, обработки йодной кислотой, разрушения избытка йодной кислоты, добавления тиобарби- туровой кислоты с последующей экстракцией окрашенного продукта бутано- лом и спектрофотометрирования, о т - л.и чающий с я тем, что, с целью повышения чувствительности способ.а, разрушение избытка йодной кислоты осуществляют добавлением тиомо- чевины в конечной концентрации 44- 88 ммоль/л или ацетилтиомочевины в конечной концентрации 88-75 ммоль/л,

тиобарбитуровую кислоту берут в кон центрации 39-50 мкмоль/л, а в бутанол дополнительно вводят о-фосфорную кислоту в конечной концентрации 0,69- 1,03 моль/л..

9.5

32.3

Л Л/Л/Г

Изобретение относится к биохимии, предназначено для исследования биохимических процессов в организме человека и животных и для диагностических и прогностических целей в клинической практике. Цель изобретения - повьшение чувствительности способа. Исследуемый материал гидролизу-, ют в 0,05 М растворе серной кислоты . при 80 С 1 ч. При этом происходит освобождение сиаловых кислот, входящих в состав гликопротеидов и гликолипи- дов исследуемой пробы. После охлаждения гидролизат подвергают периодатно- му окислению, добавляя раствор 0,025М йодной кислоты на 0,125 М НС1 до конечной концентрации 5 ммоль/л. Избыток йодной кислоты,- мешающий дальнейшему определению сиаловой кислоты, разрушают тиомочевиной или ацетилтио- мочевиной. Измеряют оптическую плотность окрашенной верхней органической фазы при 550 нм на спектрофотометре. Концентрацию сиаловой кислоты рассчи- тьшают по калибровочному графику. 1 фиг. СО ел ел со со со

Составитель Н.Гуляева Редактор Л.Веселовская Техред А.Кравчук

Заказ 5789/АОТираж 776Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий- , 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Корректор А.Зимокосов