Способ исследования молока на содержание жира и белка Советский патент 1984 года по МПК G01N33/04 

Изобретение относится к биологии и медицине, в частности к способам исследования состава женского молока. Известны способы определения бел ка, жира и углеводов в молоке, пред сматривакицие- определение белка в альбуминометре или с помощью метода Кьельдаля, определение жира бутирометрически или путем центрифугирова ния, определение углеводов путем титрования раствором Бенедикта 1 3. Недостатком указанных способов является их невысокая специфичность и точность, значительная трудоемкость и необходимость в относительн большом количестве молока (5-20 мл) причем каждый нутриент определяется в отдельной пробе молока. Это делает невозможным исследование соста ва женского молока указаннь1ми способами в клин 1ко-диагностических j лабораториях лечеЬно-профилактическ учреждений. Поскольку количество материала (женского молока), которое можно взять для исследования без ущерба для ребенка, ограничено, особенно в первые дни лактации из-за малого количества образующегося молока. Изрестен также способ исследования молока на содержание жира и белка, предусматривающий отбор пробы, экстракцию из нее жира органическим растворителем, введение в обезжиренный раствор химического реактива для получения цветного комплекса с белком, его последующее фотоколориметрирован.ие и установление значения оптической плотности, пропорциональной количесву белка в .исследуемой пробе-С 23. Недостатками такого способа явля ются неполная экстракция жира спиртово-эфирной смесью и недостаточная точность его определения весовым методом в сочетании со значительными затратами времени, а также невысокая специфичность химических реакций для определения белка и лактозы, что значительно снижает точность и f - достоверность определения, Цель изобретения - повышение точности определения белка и жира в одной пробе молока с одновременным определением в этой же пробе содержания углеводов. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу исследова.ния молока на содержание жира и белка, предусматривающему отбор пробы, экстракцию из нее жираорганическим . растворителем, введение в обезжиренный раствор химического реактива для получения цветного комплекса с белком, его последующее фотоколориметривание и установление значения оптической плотности, пропорциональной количеству белка в исследуемой пробе, органический растворитель добавляют к отобранной пробе в соотношении 90:1, затем удаляют осажденный белок из обезжиренного раствора и вводят в последний воду, для получения водноорганической смеси с последующим ее разделением на водную и органическую фазы, причем дополнительно получают цветные комплексы с жиром и углеводами путем введения реактивов соответственно в органическую и водную фазы, при этом содержание жира и углеводов определяют фотоколориметрированием цветных комплексов с жиром и углеводами в зависимости от установленных значений оптической плотности, пропорциональных содержанию жира и углеводов в исследуемой пробе. Кроме того, в качестве органического растворителя используют смесь Фолча, а в качестве реактивов для получения цветных комплексов с белком, жиром и углеводами - соответственно биуретовый, сульфофосфованилиновый и антроновый реактивы. Для осаждения белка и одновременного полного извлечения жира и углеводов из молока применяется смесь Фолча (хлороформ:метанол 2:1), которую добавляют к исследуемой пробе молока в соотношении 90:1, полученную смесь встряхивают и центрифугируют, в результате чего образуется белковый осадок и супернатант, содер жащйй жир и углеводы, который отделяют от .осадка путем добавления воды разделяют на водную и органическую фазы, содержащие, соответственно, углеводы и жир. Смесь Фолча и молоко смешивают в соотношении 90:1, поскольку установленЬ (табл. 1), что при уменьшении количества смеси Фолча не происходит полного осаждения белка и полной экстракции жира (углеводы экстрагируются полностью), а при увеличении количества смеси олча, наряду с полным осаждением

белка и полной экстракцией жира, наступает нежелательное разведение супернатанта с уменьшением концентрации в нем жира и углеводов.

Наличие белка, жира и углеводов в осадке и супернатанте при различном соотношении смеси Фолча и молока приведено в таблице 1.

Таблиц

1. СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ МОЛОКА НА СОДЕРЖАНИЕ ЖИРА И БЕЛКА, предусматривающий отбор пробы, экстракцию из нее жира органическим растворителем, введение в обезжиренный раствор химического реактива цп9 получения цветного комплекса d белком, его последующее фотоколориметрирование и установление значения оптической плотности, пропорциональной количеству белка в исследуе- мой пробе, отличаюти и ся тем, что, с целью повьшения точности и обеспечения возможности одновременного определения содержания в исследуемой пробе углеводов, органический растворитель добавляют к отобранной пробе в соотношении 90:1, затем удаляют осажденный белок из обезжиренного раствора и вводят в йоследний воду для получения водноорганической смеси с последунщим ее разделением на водную и органическую фазы, причем дополнительно получают цветные комплексы с жирон и углеводаьт путем .введения реактивов соответствеино в органическую и водную фазы, при этом содержание жира и углеводов определяют фотоколориметрированием цветных комплексов с жиром и углеводами в зависимости от установленных значений оптической плотности, пропорциональных содержанию жира и углеводов в исследуемой пробе. 2. Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и и с я тем, что в качестве органического растворителя использ пот 00 смесь Фолча, а в качестве реактивов ;о для получения цветных комплексов с СП белком, жиром и углеводами - соответственно биуретовый, сульфофосфо05 ванилиновый и антроновый реактивы.

+ +

+

+ + + + + Примечание.

К полученному осадку белка добавляют биуретовьш реактив, к отобранному образцу водной фазы т антроновьй реактив, к отобранному и выпаренному досуха образцу органической фазы серную кислоту и фосфованилиновый реактив. Оптическую плотность полученных при этом цветных комплексов измеряют на фртоэлектроколориметре

На фиг. 1, 2 и 3 показаны графики зависимости измеренной величины оптической плотности от содержания соответственно белка, жир1а и углеводов.

Для определения количествабелка, жира и углеводов в исследуемой пробе молока используют калибровочные кривые, построенные на основании определения указанных нутриентов в

+ +

+ ч+ + Ч +

эталонных .растворах: для белка - в растворе альбумина с содержанием его 5, 10, 15, 20, 25, 30 г/л .1) дпя жира - в растворе триолеина с содержанием его 10, 20, 30, 40, 50, 60 г/л (фиг. 2) для углеводов - в растворе лактозы с концентрациями 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 г/л (фиг. 3).

. Реактивы, необходимые для осуществления предлагаемого способа.

21,0

0,205

0,190 Примечание.

0,260

65,0

54, 7 Величины С (концентрации белка, жира и углеводов) определены по соответствующим калибровочным кривым (фиг. 1, 2 и 3), по осям ординат которых отложены величины оптической плотности Е, а по осям абсцисс - концентрации определяемых веществ. 166 рабочего слоя 10 мм. В пробирку с супернатантом добавляют 1,5 мл дистиллированной воды, тщательно встряхивают в течение 1 мин и центрифугируют 5 мин при скорости 1000 об/мин для расслоения на 2 фазы - водную (верхнюю) и органическую (нижнюю). В водйой фазе определяют содержание углеводов. К 0,2 мл водной фазы прибавляют 2,3 мл антррнового реактива, перемешивают, ставят на 15 мин в водчную баню с температурой воды 100 С, охлаждают и колориметрируют на фотоэлектроколоринетре при красном светофильтре в кювете с толщиной рабочего слоя 5 мм. Б органической фазе определяют содержание жира. 0,2 мл органической фазы переносят в чистую обезжиренную пробирку, выпаривают досуха при 80 С, добавляют 0,45 мл концентрированной серной кислоты, тщательно встряхивают пробирку, помещают в кипящую водяную ёаню на 20 мин, после чего охлаждают, добавляют 1,75 мл фосфованилинового реактива, тщательно перемешивают и через 1 ч колориметрируют на фотоэлектроколориметре при зеленрм светофильтре в кювете с толщиной рабочего слоя 5 мм. Фотометрию проб при определении жира и углеводов проводят против контрольных проб, которые обрабатывают так же, как и опытные, только вместо 0,05 мл молока берут 0,05 мл воды. Примеры определения белка, жира и углеводов в пробах молока приводятся в табл. 2. „ Таблица 2

По сравнению с известным прбдлагаемый способ позволяет повысить точность определения белка, жира и ;углеводов за счет применения смеси Фолча, полнее экстрагирующей жир, чем спиртовоЬфирная смесь, и использования высокоспецифичных химических

реакций для определения белка, жира и углеводов, кроме того, количество молока, необходимое для определения белка, жира и углеводов, уменьшено в 40 раз, а время определения сокращено в 3 рала.