Способ количественного определения углеводородов в биологических объектах Советский патент 1987 года по МПК G01N33/00 

Изобретение относится к пищевой и микробиологической промышленности и может быть использовано для определения углеводородов в пищевых продуктах и продуктах микробиологического синтеза.

Целью изобретения является расширение возможностей способа путем определения различных классов углеводородов, а именно алифатических и цик- лоалифатических углеводородов, моноциклических ароматических и бицикли- ческих ароматических углеводородов, а также трициклических ароматических и полициклических ароматических углеводородов ,

Способ осуществляют следующим образом.

30

Исследуемый образец биоматериала разрушают с помощью щелочного гидролиза, неомыляемые липиды экстрагируют неполярным растворителем и подвергают хроматографическому разделению на колонке, заполненной активированным силикагелем, вьщеляя при этом две фракции: первую элюируют гекса- ном - она содержит алифатические и циклоалифатические углеводороды, мо- но- и бициклические ароматические углеводороды (арены); вторую фракцию смесью гексана и диэтилово- го э-фира (9:1) - она содержит три- и полициклические арены, а также ряд природных соединений., затрудняющих определение аренов, в том числе сква- лен (природные смеси), Для того, чтобы сконцентрировать полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) и отделить природные примеси, проводят жидкость-жидкостное распределение 2-группы соединений в системе диметил- формамид (ДМФ)- - вода - гексан (9 : : 1 : 10) и последующее хроматогра- 5 фическое разделение выделенной смеси в тонком слое ацетилированной целлюлозы (система - этанол - ацетон - вода 60:25:15). Хроматографическое

Хроматографическое разделение экстракта проводят на колонке, заполненной 15 г силикагеля, предварительно промытого хлороформом и ак- 20 тивированного при 200 С в течение 4 ч. Элюируют первую фракцию 80 мл гексана, вторую фракцию - 100 мл смеси гексана и диэтилового эфира (9:1). Первую фракцию подвергают хромато- 25 графическому разделению в тонком

слое окиси алюминия 1-й степени активности в системе гексан на стеклянных пластинах 20x20 см. Проявляют хроматографические зоны в парах иода. Собирают зоны алифатических и цикло- алифатических углеводородов (R 0,9 - 1,0), моноциклических аренов (R 0,7- 0,8), бициклических аренов (Rj 0,5 - 0,6).

Для того, чтобы устранить возможные ошибки, связанные с колебаниями хроматографической подвижности исследуемых углеводородов, с края хромато- графической пластины наносят в точку смесь реперных соединений (н-алкан, гептадецилбензол, нафталин), отделяя эту часть пластины сплошной полосой. Фракции элюируют с сорбента смесью гексана и диэтилового эфира, растворитель упаривают, выделенные соединения анализируют с помощью ГХ.

Вторую фракцию, в состав которой входят три- и полициклические арены, а также ряд природных соединений, в

35

40

разделение 1-й фракции проводят в тон-50 ом числе сквален, упаривают досуха,

растворяют в 100 мл гексана и экстрагируют трижды смесью ДМФ - вода (9:1) по 100 мл,

ком слое окиси алюминия, выделяя зоны, содержащие алифатические и циклоалифатические уг леводороды, моноциклические арены, бициклические арены.

ДМФ-слой разбавляют 300 мл воды и экстрагируют гексаном (3 х X 100 мл). Экстракт промывают водой и сушат сульфатом натрия, растворитель упаривают до 1-2 мл. Хроматогра- |фируют экстракт п тонком слое ацетилированной (30%) целлюлозы в хромаИдентификацию и количественное определение выделенных соединений проводят с помощью газожидкостной (ГХ) и Уф-спектрофотометрии.

0

5

Пример I. Определение модельной смеси углеводородов, добавленной к свиному салу.

К образцу сала (200г) добавляют модельную смесь соединений (см. табл.). Материал гидролизуют в 600 мл 1,5N раствора КОН в смеси этанол: вода (9:1) в течение 3-х ч при 0 кипении pacni opa. Неомыляемые липиды экстрагирую. ;13 реакционной массы гексаном (3x150 мл) после разбавления ее 600 мл воды. Экстракт промывают водой, сушат сульфатом натрия 5 и упаривают до объема 1-2 мл.

Хроматографическое разделение экстракта проводят на колонке, заполненной 15 г силикагеля, предварительно промытого хлороформом и ак- 0 тивированного при 200 С в течение 4 ч. Элюируют первую фракцию 80 мл гексана, вторую фракцию - 100 мл смеси гексана и диэтилового эфира (9:1). Первую фракцию подвергают хромато- 5 графическому разделению в тонком

слое окиси алюминия 1-й степени активности в системе гексан на стеклянных пластинах 20x20 см. Проявляют хроматографические зоны в парах иода. Собирают зоны алифатических и цикло- алифатических углеводородов (R 0,9 - 1,0), моноциклических аренов (R 0,7- 0,8), бициклических аренов (Rj 0,5 - 0,6).

Для того, чтобы устранить возможные ошибки, связанные с колебаниями хроматографической подвижности исследуемых углеводородов, с края хромато- графической пластины наносят в точку смесь реперных соединений (н-алкан, гептадецилбензол, нафталин), отделяя эту часть пластины сплошной полосой. Фракции элюируют с сорбента смесью гексана и диэтилового эфира, растворитель упаривают, выделенные соединения анализируют с помощью ГХ.

Вторую фракцию, в состав которой входят три- и полициклические арены, а также ряд природных соединений, в

5

0

растворяют в 100 мл гексана и экстрагируют трижды смесью ДМФ - вода (9:1) по 100 мл,

5

ДМФ-слой разбавляют 300 мл воды и экстрагируют гексаном (3 х X 100 мл). Экстракт промывают водой и сушат сульфатом натрия, растворитель упаривают до 1-2 мл. Хроматогра- |фируют экстракт п тонком слое ацетилированной (30%) целлюлозы в хроматографической системе этанол ацетон - вода (60:25:15) на пластине 13x18 см. Хроматографические зоны обнаруживают при облучении пластины УФ-светом ( нм) по их флуоресценции. Используют также реперные соединения фенантрен, бенэ(а)антрацен, бенз(д)хризен, бенз (е)пирен). Собирают соответствующие зоны и анализируют фракции с помощью ГХ.

Условия ГХ:стеклянный капилляр (1 50 м, d 0,25 мм) OV-IO, пламенно-ионизационный детектор (ПИД), газ-носитель - азот, скорость 1,2 мл/мин, программирование температуры от 150 до 300 С со скоростью 3°/мин.

Результаты определения модельной .смеси углеводородов, добавленной к образцу свиного сала, по способу-прототипу и предлагаемому способу приведены в табл.I.

Как видно из приведенного сравнения, изобретение обеспечивает выделение и определение соединений как алифатического, так и ароматического рядов, включая ПАУ. В то же время способ-прототип позволяет определить только ПАУ с числом циклов 4 и более трициклические арены (фенантрен) определяются не количественно (выделено 30%) .

П р и м е р 2. Модельную смесь углеводородов, включающую 10 мг эй- козана, 5 мг гептадецилбензола, 5 мг диметилнафталина, 2 мг фенантрена, 2 мг бенз(а)антрацена, 2 мг бенз (е)пирена и 2 мг бенз(ч)хризена, растворяют в 100 мл гексана и экстрагируют 100 мл смеси ДМФ - вода (9:1) ДМФ-слой разбавляют водой (1:1) и экстрагируют 100 мл гексана.

Гексановый экстракт промьшают водой, упаривают до объема 500 мл и анализируют с помощью ГХ на стеклянном капилляре с OV-101, детектор - ПИД при программировании температуры от 150 до 300 /мин, газ-носитель азот, скорость 1,2 мл/мин.

Результаты примера 2 приведены в табл,2.

Из табл.2 видно, что распределение в бинарной системе ДМФ-Н О /гек- сан позволяет достаточно селективно разделить алифатические и полициклические углеводороды с числом циклов

, .

37764

4

и более. Для аренов с числом циклов 1-2 это распределение значительно менее селективно и связано с потерями анализируемых соединений как в гексановом, так и в ДМФ-слое, Очевидно; что переэкстракция неомыляе- мых липидов, проводимая в способе- прототипе перед хроматографическим

10 разделением последней, приводит к потерям моно- и бициклических аренов и не дает возможности количественного их определения, В то же время жидкость-жидкостное распределение в

15 этой системе позволяет отделить от ПАУ ряд природных соединений, совпадающих с ними по хроматографичес- кой подвижности, и является существенным этапом в выделении и концент2Q рировании три- и полициклических аренов. Поэтому эта стадия введена в предлагаемую схему анализа после хроматографического выделения из нео- мыляемых липидов суммы алифатических,

25 циклоалифатических, моно- и бициклических ароматических углеводородов.

П р и м е р 3, Определение углеводородного состава тканей крыс, в корм которых добавляли дизельное топли30 во (ДТ) в количестве 50 и 400 мг/кг массы животного.

Согласно предлагаемому способу определяют основные компоненты дизельного топлива в тканях крыс контрольной и опытных групп. Определение алифатических и циклоалифатических углеводородов осуществляют с помощью ГХ по методу внутреннего стандарта. Условия ГХ описаны в примере 1. Ре40 зультаты определения аренов получены на основании анализа УФ-спектров растворов соответствующих фракций.

В табл, 3 и 4 представлены полученные данные о содержании алифати45 ческих, циклоалифатических и ароматических углеводородов в тканях крыс контрольной и опытных групп.

Разработанные условия колоночной хроматографии позволяют селективно

5Q разделить указанные две группы соединений, а также отделить от первой группы углеводородов природный полие- новый изопреноид - сквален, присутствие которого затрудняет определение

gg бициклических аренов,

Как показали предварительные эксперименты, четкое отделение сквалена достигается только при использовании активированного (полностью обезвожен35

ного) при 200 °и силикагеля. Элюиро- вание фракций последонательно гскса- ном и смесью гексана и диэтилоного эфира (9:1) обеспечивает минимально перекрывание хроматографических зон первой и второй фракций, что позволяет избежать потерь определяемых соединений и повысить точность анализа.

Соотношение гексана и диэтилового эфира 9:1 (по объему) является оптимальным и обеспечивает полноту элюи- рования полициклических аренов с числом конденсированных циклов до 7 и в то же время приводит к минимальному загрязнению второй фракции природными примесями. Меньшее количество диэтилового эфира в смеси значительно повышает объем элюата, большее - приводит к перегрузке выделенной фракции примесями, что затрудняет последу1й1цее хроматографическое ее разделение в тонком слое ацетилиро- ванной целлюлозы.

Проведение хроматографического разделения первой фракции в тонком слое окиси алюминия позволяет выделить сумму алифатических и циклоали- фатических углеводородов, а также отдельно моно- и бициклические арены.

Жидкость-жидкостное распределение второй группы соединений в системе - вода/ гексан дает возможность значительно сконцентрировать следовые количества три- и полициклических аренов и отделить ряд примесей природного характера, мешающих их дальнейшему определению. Трехкратная переэкстракция в системе - вода/гексан значительно увеличивает степень извлечения ПАУ.

Тонкослойная хроматография (ТСК) на ацетилированной целлюлозе, полученной выше смеси соединений, позволяет выделить узкие фракции три- и полициклических аренов ив то же время отделить следовые примеси неуглеводородного характера. . Применение реперных соединений при тех обеспечивает четкое выделение исследуемых групп углеводородов и устраняет возможные ошибки, связанные с изменением хроматографической подвижности этих соединений.

Изобретение дает возможность расширить возможности способа путем определения различных классов углеводородов, позволяет достигнуть полноты извлечения исследуемых углеводородов, высокой селективности разделения их на группы, а также произвести достаточно полное отделение примесей природного характера, что позволяет с большой точностью и надежностью определять следовые количества алифатических, циклоалифатических и ароматических соединений, дифференцировать смеси природных углеводородов и загрязняющих биоматериап нефтяных углеводородов .

Изобретение не требует дефицитного оборудования и материалов и может быть использовано в лаборатории химического и биохимического профиля при анализе различных биологических объектов, в частности при гигиенической

характеристике продуктов питания и продуктов микробиологического синтеза для определения загрязнения их углеводородами нефти.

Формула изобретения

I. Способ количественного определения углеводородов в биологических объектах, включающий отбор образда, гидролиз водно-спиртовым раствором щелочи,экстракцию неомыляемых липидов, жидкость-жидкостное их распределение в системе диметилформамид - вода - гексам, колоночную хроматографию на силикагеле, выделение углеводородов с количественным определением последних, отличающий- с я тем, что, с целью расширения возможностей способа путем определения различных классов углеводородов, колоночную хроматографию проводят перед жидкость-жидкостным распределением, причем для хроматографии используют активированный силикагель

и выделяют две фракции, первую из которых элюируют гексаном, вторую - смесью гексана и диэтилового эфира в объемном соотношении 9:1, а жидкость-жидкостному распределению подвергают вторую фракцию, при этом выделение углеводородов из любой фракции проводят с помощью тонкослойной хроматографии.

2. Способ поп.1,отличаюЩ и и с я тем, что алифатические и циклоалифатические углеводороды, моноциклические ароматические и би- циклич.еские ароматические углеводороды выделяют раздельно из первой фракции, при этом тонкослойную хроматографию проводят на окиси алюминия, трициклические ароматические и полициклические ароматические углеводороды выделяют раздельно из второй фракции, при этом тонкослойную хроматографию проводят на ацетилированной целлюлозе.

Таблица 1

Таблица j

Содержание алифатических и циклоалифатических углеводородов в органах и тканях крыс, получавших нефтяные дистиллаты (дизельное топливо) с кормом (в мг/кг массы биоматериала)

Содержание ароматических углеводородов нефтяных дистиллатов (ДТ) в тканях крыс (в мг/кг биоматериала)

Редактор Е.Копча

Составитель И.Кутукова Техред И.Попович

Заказ 4123/41 Тираж 776Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул.Проектная, 4

Таблица 4

Корректор В.Бутяга

Изобретение относится к пищевой и микробиологической промьшшен- ности и может быть использовано для определения углеводородов в пищевых продуктах и продуктах микробиологического анализа. Целью изобретения является расширение возможностей способа путем определения различных классов углеводородов, а именно алифатических и циклоалифатических углеводородов, моноциклических ароматических и бициклических ароматических углеводородов, а также трициклических ароматических и полицпкличес- ких ароматических углеводородов.Берут образец биоматериала, разрушают ег о щелочным гидролизом, неомыляемые липиды экстрагируют неполярным растворителем, затем подвергают хромато- графическому разделению на колонке с активированным силикагелем. При этом выделяют две фракции: первую элюируют гексаном, вторую - смесью гексана и диэтилового эфира (9:1). Для концентрирования полициклических ароматических углеводородов и отделения переходных примесей проводят жидкость-жидкостное распределение 2-й группы соединений в системе диметил- формамид - вода - гексан (9:1:10) и последующее хроматографическое разделение выделенной смеси н тонком слое ацетилированной целлюлозы (система - этанол - ацетон - вода 60:25:15). Хроматографическое разделение 1 фракции проводят в тонком слое окиси алюминия с выделением зон, содержащих алифатические и циклоалифатические углеводороды, моноциклические арены, бицикличейкие арены. Идентификацию и количественное определение выделенных соединений проводят с помощью газожидкостной и УФ-спектрофотометрии. 4 табл. (Л ОС 00 О5 4