Способ окрашивания спор бактерий Советский патент 1987 года по МПК C12N3/00 

113

Изобретение относится к микробиологической промьшшенности, а именно к способам окрашивания люминесцентными красителями спор бактерий, в частности Bacillus anthracis, при изучении процессов их вегетации, распределения спор в организме животного и др., в тех случаях, когда необходимо осуществлять визуальньш контроль за спорами, в том числе возбудителями сибирской язвы.

Целью изобретения является упрощение способа за счет использования обычных широкодоступных люминесцентных красителей акридинового ряда Пример 1. Споровую культуру Bacillus anthracis СТИ смывают с поверхности МПА физиологическим раствором. Суспензию спор (100 млн - 1 млрд/мл по оптическому стандарту мутности ВГНКИ ) разделяют на две части. К одной части добавляют равный объем 1%-ного водного раствора акридинового оранжевого, к другой - 1%- ньй водньй раствор изотиоцината. Оставляют для окрас 1ивания на 30-40 мин Суспензию спор отмывают от краски центрифугированием (3000-5000 об/мин 15-20 мин ) в дистиллированной воде 4-5 раз. Из взвеси спор готовят мазок, высушивают, фиксируют на пламени горелки и просматривают под иммерсией (об. 90 Xj в люминесцентном микроскопе. Споры имеют вид слегка |желтоватых очень слабо светящихся зерен, плохо различаемых на общем фоне поля зрения микроскопа (окрашивание спор известным способом ).

Пример 2. К суспензии спор добавляют 0,5-1 объем краски следующего состава, мл: Акридиновый оранжевый

Спирт-ректификат

1,0

20,0

1,0

До 100 мл

Водньй раствор КОН 1%-ный Вода дистиллированная

Подогревают до начала кипения, снимают со спиртовки и вьщерживают 10-20 мин. Споры отмывают центрифугированием в 5-6 сменах дистиллированной воды. После отмывки из суспензии спор готовят раздавленную каплю или мазок, который фиксируют на пламени и просматривают под иммерсией (об. 90х) в люминесцентном микроскопе.

5

0

5

0

5

0

45

50

55

Недостатком данного способа является то, что сггоры окрашиваются неравномерно и часто скопление спор трудпо отличить от принявших краску пос1чэронних частиц (кусочки агара и др.). Более 90% проваренных спор теряют способность к вегетации.

Окрашенные данным способом споры слабо удерживают краску. В специальных опытах при попадании окрашенных спор в организм животных, имеющих прозрачное тело, отданная стенкой споры краска окрашивает органоиды и включения тела животного, которые трудно отдифференцировать под микроскопом от самих спор.

Пример 3. К суспензии спор Вас. anthracis СТИ добавляют 0,2-1 объема краски следующего состава, мл:

Акридиновый оранже вый1,0

Спирт-ректификат

96°-ньй20,0

1%-ный раствор едкого калия1 ,0

5%-ный отвар шелухи

лука репчатого 30,0 Вода дистиллированнаяДо 100

Приготовление отвара шелухи лука. Шелуху лука репчатого подсушивают и измельчают в кофемолке, ступке или др. Навеску 5 г вносят в мерную колбу и заливают дистиллированной водой до метки 100 мл. Оставляют при комнатной температуре для холодного экстрагирования на 20-30 мин - 24 ч и помещают в кипящую водяную баню на 20-30 мин. Фильтруют и используют по назначению.

Смесь спор с краской нагревают до 70-90° и вьщерживают 15-30 мин. Отмывают центрифугированием в 4-5 сменах дистиллированной воды, готовят раздавленную каплю или мазки и микро- скопируют под иммерсией в люминесцентном свете.

На общем зеленом фоне красно-оранжевые споры Вас, anthracis. Посторонние частицы окрашиваются вжелтьш цвет и хорошо отличимы от спор. Контрольный посев на МПА дал пашный рост колоний Вас. anthracis СТИ.

Были испытаны влияния различных концентраций (0,2-10,0%) отвара шелухи лука репчатого в составе указанной краски. Показано, что наиболее

1

ярко окрашивают споры и наиболее прочно краска удерживается их стенкой при добавлении 20-30 мл 5%-ного отвара. Снижение концентрации отвара или уменьшение его количества ухудшает качество окраски. Увеличение концентрации или количества отвара не улучшает качество окраски.

При введении спор в организм животных, имеющих оптически прозрачное тело, споры остаются интенсивно окрашенными в течение 36 ч (срок наблюдения ).

Пример 4. Споры окрашивают по методике примера 3, но вместо подогрева до 70-90 их кипятят 10- 30 мин. При данном режиме споры также интенсивно окрашиваются, но 80- 95% из них теряют способность к ве- гетации.

Экономическая эффективность предлагаемого способа окраски спор микроорганизмов заключается в том, что используются широко доступные обычные люминесцентные красители акридинового ряда, например акридиновый оранжевый и другие реактивы: спирт, едкий калий, шелуха лука репчатого, всегда имеющиеся в обычной лаборатории.

Окраска спор довольно простая и прочная, поэтому дает возможность

Редактор Л.Шандор Заказ 4183/17

Составитель Т.Полянская.

Техред М.Дидык Корректор И.Эрдейи

Тираж 499Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

26

проводить специальные опыты по изуче- ниит вегетации спор, с контролем данного процесса в люминесцентном свете. Предлагаемый способ также может быть использован при изучении и диагностике сибирской язвы в полевых условиях.

10 Формула изобретения

Способ окрашивания спор бактерий путем нанесения красителя с последующим нагреванием мазка препарата и вы- держи§анием, отличающий- с я тем, что, с целью упрощения способа, в качестве красителя используют смесь следующего состава, мл:

Акридиновый оранжевый

Спирт-ректификат 96°-ный

1%-ный раствор едкого калия 5%-ньп1 отвар шелухи лука репчатого Вода дистиллированная

нагревание осуществляют до 70-90°С, а выдерживание - в течение 20-30 мин.

Изобретение относится к микробиологии, а именно к способам окрашивания спор бактерий. Целью изобретения является упрощение способа. Способ заключается в следующем. К суспензии спор бактерш Bacillus anthra cis добавляют 0,2-1 объема краски следующего состава: акридиновый оранжевый 0,5-1 г, спирт-ректификат 96° 10-20 мл, 1%-ный раствор едкого калия 1 мл, 5%-ный отвар шелухи лука репчатого 30 мл, вода дистиллированная до 100 мл. Смесь спор с краской нагревают до 70-90 0 и выдерживают 15-30 мин. Отмывают центрифугированием, готовят раздавленную каплю или мазки и микроскопируют в люминесцентном свете. Споры бактерий Bacillus anthracis окрашиваются в красно-оранжевый цвет на общем зеленом фоне. Посторонние частицы - в желтый. Окраска спор проста и прочная. Способ может быть использовано в полевых условиях. о (Л оо ОО со to Oi