Способ получения эргозина Советский патент 1982 года по МПК C12P1/00 A61K31/48 

Изобретение относится к микро- 1 биологической промлопенности и касается получения эргозина. Известен способ получения естественных алкалоидов из спорыньи. Однако этот способ позволяет полу чить небольшое количество эргозина. Кроме того, присутствуют родств.енные пектидные алкалоиды, которые сложно отделять друг от друга. Цель изобретения - получение эрго зина. Эта цель достигается тем, что способ получения эргозина осуществля ют путем культивирования штамма С1аviceps purpurea (Fr)Tu 168 в аэробных глубинных или поверхностных условиях в жидких питательных средах содержащих источники углерода, азота и минеральные соли, при 20-30°С и рН 4.,0-6,2 в течение 10-35 дней и выделяют алкалоиды известным путем. При этом культивирование ведут при 22-25°С и рН 5,2-5,9. Новый штамм выделен из диких штаммов (ПУРЛЗ, ПУР 50) вида Clavlceps purpurea ( на ржи растущи склеротий, образующих арготамин. После двойной мутации этих штаммов была изолирована линия, которая способна образовывать эргозин. В ходе этих работ стало возможным превратить сапрофитйчно свободные от алколоидов дикие штаммы в производя- : щие линии и одновременно переключить спектр апколоидов относительно SMe го t i urn . Выделенный штамм С1.purpurea (Fr)Tul МУТ 168 зарегистрирован под номером УМЕТ РА (ИМЕТ ПА/134 в центральном исследовательском институте микробиологии и экспериментальной терапии АН ГДР в г. Йена). Штамм образует эргозин и его изомер эргози НИН до 90%. и только 10% легко отделяемого смеси клавина. Штамм обладает следующими культурально-морфологическими признаками . На агаровых средах колонии состоят из более или менее сильно разветв.пенного мицелия, который имеет толщину 4-5 мк, в узлах разветления 7-8 мк. Конидии отсутствуют, но в общепринятых средах, вызывающих образование спор, мицелий распадается частично на довольно мелкие части. Капли жира в относительно малом количестве обнаружены только на средах 846 и 829. Мицелий глубинных культур состоит из длинных разветвленных гифов толщиной около 5 мк. Гифы имеют частично шаровидно округленные утолщения и содержат много капель жира. Среда М10 - рост очень хороший со складчатой и частично приподнятой .поверхностью, коричневая пигментация обратная сторона с частично темными пятнами, без конидий. Среда 846 - рост хороший, колони со складчастой извилистой поверхностью, коричневая обратная сторона светло-коричневая без конидий. Среда 829 - рост, хороший, колони со светло-коричневой до коричневой пигментацией, со складчатой поверхностью, курчавым и неравномерньм краем. Обратная сторона светло-кори невая. Среда 784 -рост хороший, -коло- НИИ имеют коричневую верхнюю сторон и бесцветную нижнюю сторону, колонии складчатые, волнистые с неровным краем, без конидий. Культивирование штамма лучше все го идет в -жидких питательных средах в поверхностных или глубинных условиях. Питательные среды содержат источ ник .углерода, который может быть ас симилирован, как, например, сахароза, глюкоза, майнит, сорбин, глицер лимонная или янтарная кислота, асси милируемый источник азота, например аммоний, аспарагин, пептон, гидролиз казеина или соль аммония и мине ральные соли. Ферментация может ПРОХОДИТЬ в колбах Фернбаха, Эрлен-Майера, в ка чалочных колбах или в ферментерах. Алкалои,цы в большинстве (выше 80%) содержатся в питательных средах и и можно получить обычным путем. Культивирование проводят односту пенчато, двухступенчато или трехсту пенчато. Желательно, если предварителы-1ые культуры 5-12-дневного возраста и соотношение внесения предварительных культур к основным куль турам равняется 1:5 (до 1:20). Значение рН мо.жет колебаться от 4,0 6,2, а температура от 20-30°С. Пример 1. Шт амм МУТ 168 со скошенного агафа гомогенизируют в 100 мл среды 821 и вносят в качалочные колбы объемом 500 мл. Среда имеет сУ1едуквдиЯ состав: Сахс1роза, г200 Цитрат аммония, г15 Ca(NO i г 1 КНпРО , гО,25 НдЗОц - ,,3 FeSO 7ИоО, мг10 ZnS04- 7Н7:0 , мг30 , 8 КС1, мг0,1 Дрожжевой экстракт, г 3,0 Вода, лДо 1 . рН (перед стерилизацией)5,8-6,0 Стерилизация 30 мин при . Колбы культивируют 7 дней при 24 ± 1°С при 200 об/мин. 10% полученных культур используют для того, чтобы в 500 мл колбы внести 100 мл среды 720 следующего состава: Сахароза, г200 Цират. аммония , г15 Са(ЫОз).,г .1 KH, , г0,25 MgS04- , г0,3 FeS04 -7Hrj O , мг10 ZnSO , мг30 ,8 КС1 , Г. .0,1 , Вода, лДо 1 рН (перед стерилизацией;5,8-6,0 Стерилизация 30 мин при . Колбы инкубируют 7 дней при 24 + 1°С и 200 об/мин. После Л2-21-дневного инкубирования при вышеуказанных условиях культу ральная жидкость содержит 180 280 мкг/мл алкалоида с содержанием до 90% смеси эргозина и эргозинина и 10% смеси клавиналкалоида. Алкалоиды выделяют из.вестным способом и очищают. Пример 2. 10% описанной в примере 1 исходной культуры переводят в колбы Фернбаха объемом 400 мл со 100 мл среды 720. При 24 + 1°С колбы культивируют и после 20 дней культивирования надводный мицелий отделяют от среды. Колбы содержат 250-350 мг общего алкалоида на 1 мл питательной среды, .имегацей такой же состав, как в примере 1. Определение алкалоидов проводят следующим образом. После 20-дневной ферментации поверхностная культура содержит 300 мг/мл смеси алкалоидов. 10 мл подщелачивают и проводят экстракцию хлороформом. Объем экстракта уменьшают до 5 мл и 2 мл из них отделяют послойным хроматографированием препарата На силикагеле с флюоресцентным индикатором (система.растворителя хлороформ-этанол (8:2)). Алкалоидные пятна снимактт, добавляют к смеси вода-метанол-ледяная уксусная кислота I (45:45:10) и смешивают потом с реактивом Ван-Урка в соотношении 1:2. Окрашенные в голубой цвет растворы центрифугируют, надосадочную жидкость облучают кварцевой лампой 5 мин.и определяют экстинкцию фотометром.Количество алкалоида определяют из составленных пои одинаковых условиях эталонных