Способ получения алкалоидов спорыньи Советский патент 1977 года по МПК C12D13/00 A61K35/78 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛКАЛОИДОВ СПОРЫНЬИ

3

Используемый сог тасно предлагаемому способу штамм культуры Claviceps purpurea был выделен следующим образом. Исходную культуру Claviceps purpurea культивировали на Sclerotium с высоким содержанием алкалоида. Были использованы три стадии инокуляции в пОВторных циклах. В отдельных циклах материал получалц на жидкой цитательной среде, исиользуя колонии, снятые с твердой питательной среды. После этого, исиользуя полученный инокулянт, готовили жидкую культуру, продуцирующую алкалоид. Клетки, полученные на этой стадии, вновь трансинокулировали на твердую питательную среду. К каждой порции питательной среды добавляли 1,0-10,0 г/л .нитрата аммония.

К жирной питательной среде добавляли 0,5 г/л дигидрофосфата калия и 20,0 г/л хлористого, натрия.

Те культуры, которые на шестой или седьмой день культивации продуцировали наиболее подходящее количество алкалоидов пептидного типа, пересевали на твердую питательную среду. В результате выделили штамм Claviceps purpurea OKJ 88/1972, который хранится под указанным номером в национальном институте здравоохранения в Будапеште.

Для идентификации этого штамма берут во внимание его следующце морфологические и биохи Мпческие признаки.

Морфологические признаки колонии, образовавшейся на питательной среде SC101 после инкубационного периода в 30 дней, следующие: чсчко ограниченные растущие радиально складчатые колодии диаметром 25-30 мм. Бархатисто-белая поверхность со светло-бежевым центром и коричневатой внутренней стороной. С поверхности агара твердые колонии снимаются трудно. Под микроскопом клетки, образующие колонию, выпуклые, хрупкие, зернистые.

После культивации культуры ла питательной среде SB 203 она о.крашена в светло-бежевый цвет, напоминает пух.

Таблица 1

Под микроскопом клетки культуры образуют сильно преломляющие, разделенные перегородками прямые черточки с небольшим количеством ответвлений толщиной 4-5 мкм. По мере старения клетки становятся выпуклыми и зернистыми. по росту щтамма и образованию им алкалоида на питательной среде SB 203 приведены в табл. 1.

Влияние органических источников азота на образование штаммов алкалоида приведено в табл. 2.

Таблица 2

Влияние нитрата аммония на образование щтаммом алкалоида приведено в табл. 3.

Для того чтобы выделить и идентифицировать алкалоиды, питательный бульон экстрагировали смесью хлороформа и изопропилового спирта в отношении 4 : 1. Экстракт, содержащий алкалоиды, хроматографировали в слое окиси алюминия. Отдельные компоненты вымывали и онределяли их концентрацию по УФ-поглощению, используя в каждом опыте идентичные известные стандарты.

Полученные при помощи штамма алкалоиды имеют состав, %: эргокриптинина 5, эргокорнинина 4, эргокриптина 30, эргокорнина 28, эргозина 5, эргометринина 4, эргометрина 22, другие растворимые в воде алкалоиды 2.

Таким образом, штамм Claviceps purpurea OKI 88/1972 является разновидностью, полученной без мутагенной обработки. Он спосоТаблица 3

бен продуцировать, алкалоиды в условиях садрофигина. При его с&держании в питательной среде 0,01 -1,0% нитрат аммония оказывает не замедляющее, г ускоряющее действие на рост щтамма и на образование им алкалоида. В образующих алкалоид питательных средах не наблюдалось образования темнофиолетового пигмента, характерного для щтаммов Claviceps. Максимальное количество алкалоида образуется на щестой-седьмой день культивации. На седьмой день культивации количество мицелия было ниже 3,5, а относительное образование алкалоида, рассчитанное на сухие клетки, составляло 30 мг/г; 60-70% полученных таким образом алкалоидов состоит из двух компонентов группы эрготоксина и их изомеров соответствен.но практически в одиеаковых соотношениях.

Таким образом, предлагаемый способ относится к ферментативному процессу получения алкалоидов спорыньи, главным образом эргоК|рипти.на и эргокорнина, путем культивации указанного щтамма на жидкой, подвергнутой аэрации питательной среде, содержащей сахарозу, неорганический источник азота и другие известные добавки.

Предлагаемый способ обладает по сравнению с известными М:ногими преимуществами. Так, он имеет хорощую воспроизводимость. При удалении органических источников азота из питательной среды и замене их нитратом аммония воспроизводимость может бытьулучщена еще больще, экономичность процесса при этом повыщается.

Продолжительность процесса 5-6 дней, в то время как продолжительность известных способов 8-12 дней.

Алкалоиды свободно выделяются из питательного бульона.

Образующиеся алкалоиды имеют в питательной среде удачное соотнощение: алкалоиды, принадлежащие к группе эрготоксина, образуются в равных количествах, так что при отделении этих двух алкалоидов и при добавлении к полученной смеси эргокрицтина эрготоксин может полностью вступать в соединение с обычным соотношением компонентов. Кроме того, при получении алкалоидов спорыньи образуется эргометрин - наиболее важный сопутствующий алкалоид, растворимый в воде. Этот алкалоид легко извлекается в процессе работы и выделяется самостоятельно.

Пример 1. Типичную колонию щтамма Claviceps OKI № 88/1972 в возрасте 30 дней снимают с поверхности твердой питательной среды SC 101 и гомогенизируют в 10 мл стерильной воды. 100 мл питательной среды S2C, помещенные в колбу Эрленмейера на 500 мл, прививаются этой суспензией. Питательная среда S2C имеет следующий состав, г: сахароза 200,0, лимонная кислота 15,0, дигидрофосфат калия 0,5, сульфат магния 0,3, гидроокись аммония до рП 5,2, вода до 1000,0.

Культуру встряхивают при 24°С в течение

6дней, затем отбирают фракцию 10 мл, которую далее используют для прививки 100мл питательной среды SB 101, помещенной в

колбу Эрленмейера на 500 мл. Питательная среда SB 101 имеет следующий состав, г: сахароза 100,0, янтарная кислота 10,0, нитрат кальция 1,0, нитрат аммония 1,0, дигидрофосфат калия 0,5, сульфат магния 0,3, хлористый натрий 10,0, гидроокись аммония до рН 5,2, вода до 1000,0.

Культуру встряхивают при 24°С в течение

7дней. Содержание сухого материала в культуре составляет 3,42%.

100 мл культуры, полученной как описано выще, экстрагируют 50 мл смеси хлороформа и изопропилового спирта, взятых в соотнощеНии 4:1. 10 мл экстракта выпаривают, остаток помещают в 1 мл смеси1 хлороформа и

метилового спирта 1 : 1 и раствор хроматографируют в слое сухой окиси алюминия. Пятна алкалоида обнаруживаются в УФсвете; их вымывают 50%-ным раствором ме тилавого спирта в воде, содержащим 1 % винной кислоты; количество соответствующих алкалоидов определяют по УФ-поглощению. Полное содержание алкалоида в культуре составляет 1687 у/мл в то время, как содержание из эргокорнина - эргокриптина до

стигает 1187 УМ л.

Эргокриптин и эргокорнип могут быть выделены в кристаллическом виде из любой культуры известными методами. Пример 2. Штамм и твердая питательная

среда из агара те же, что в примере 1. Связанный слой мицелия около 150 см. Культуру в возрасте 30 дней извлекают с поверхности твердой питательной среды из агара. Вещество суспендируют и гомогенизируют в

100 мл воды. I

Из полученной таким образом суспензии

отбирают фракции по 20 мл и используют их

для прививки двух колб Эрленмейера на

750 мл, содерлсащих по 200 мл питательной

среды SC 100. Состав питательной среды SC 100 следующий, г: сахароза 100,0, лимонная кислота 10,0, сульфат магния 0,3, дигийрофосфат калия 0,5, хлористый натрий 10,0, гидроокись аммония до рН 5,2, вода до

1000,0.

Смесь встряхивают при 24°С в течение 6 дней, после чего 400 мл полученного таким образом привитого материала используют для инокуляции 6 л питательного бульона

SB 103, помещенного в лабораторный ферментер на 10 л. Состав питательной среды Sn 103 следующий, г: сахароза 100,0, янтарная кислота 10,0, хлористый натрий 10,0, нитрат аммония 3,0, нитрат кальция 1,0, дигидрофосфат калия 0,5, сульфат магния 0,3, гидроокись аммония до рН 5,6, вода до 1000,0.

Этот питательный бульон перемешивают при 25°С со скоростью 240 об/мин и насыщают воздухом со скоростью 0,5 л воздуха/л,Мйн. Ферментация . продошжается 5 Дней. Содержа.ние сухого материала в полученном таким о.бразом иитательном бульоне 3,14%. .Общее содержание алкалоида, определяемое по методике, описанной в примере 1, составляет 1046 Y/мл. Содержание эргометрина достигает 310 у/мл, содержание эргокорнвна - эргокриптина 636 у/мл. Питательный бульон обрабатывают, как описано в примере 1.

Пример 3. Используя штамм, идентифицированный в примере 1, получают слой мицеЛия на твердой питательной среде SB 010 при инкубацИ - в течение 30 дней. Состав питательной среды SB 010 следующий, г: сахароза 100,0, янтарная кислота 10,0, нитрат аммония 10,0, ни.Т1рат кальция 1,0, дигидрофосфат калия 0,25, сульфат магния 0,25, гидроокись аммония (до рН 5,2), волокнистый агар 25,0, вода до 1000,0.

Культуру, выделенную с поверхности агара, используют для приготовления npHiBHB04ного материала, как описано в примере 2, с ислользованием питательной среды SC 100. На 6-ой день культивации порциями по 400 мл полученного инокулята прививают по 6 л стерильной питательной среды SB 101, помещенной в ферме1нтер на 10 л. Культивация продолжается в течение 5 дней, как описано в примере 2. На этой стадии полученные питательные бульоны объединяют, и этот инокулят (18 л) используют для прививки .200 л жидкой питательной среды SC 101, помещенной в ферментер опытной установки на 300 л. Эта среда не содержит волокнистого

агара, в остальном о,на имеет выщеуказанный состав. Питательный бульои перемешивают со скоростью 300 об/мин и насыщают воздухом со скоростью 9 .

Ферментация продолжается в течение 6 дней при 25°С. На 55-й и 60-й час ферментации добавляют гидроокись аммония, поддерживая рН культуры 4,5.

На 6-й день «ультивации содержание сухого .материала в бульо.не 3,42%, общее содержание алкалоида 1246 у/мл, в то время как содержание эргокорнина-эргокриптина достигает 646 Y/мл. Содержание эргометрина 202 7/мл.

Бульон обрабатывается далее по аметодике, описанной в примере 1.

Формула изобретения

Способ получения алкалоидов спорыньи путем выращивания культуры Claviceps purpurea в аэробных условиях на жидкой питательной среде, содержащей источники . углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделе.нием целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью .повышения выхода препарата, используют штамм Claviceps purpurea OKI 88/1972.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент Великобритании № 1170600, кл. С 2G, опублик. 1968.