Способ получения клона бактерий ЕSснеRIснIа coLI,трансформированного плазмидой pBR322,содержащей вставку РSт-1,кодирующую интерферон @ или @ Советский патент 1987 года по МПК C12N15/00 

Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии.

Целью изобретения является одно- временный отбор клонов, несущих рекомбинатные молекулы ДНК с геном, кодирующим с.; - ий -интерферон.

Одновременный отбор клонов обеспечивается наличием гомологии между (от 5 до 7) функциональшлми IFW-ei- и IFN-fl-генами. При этом участок гомологии имеет длину 13 нуклеотидов со следующей формулой 5 CCTTCTGGAA- CTG3 . Кроме того, и РНК из клеток Namalwa выделяют через 9 ч после индукции вирусом, синтез к ДНК осу .ществляют на (А) РНК с величиной молекулы 6 и 18 S, а дн.ДНК получают размером 600 п.о.

Пример 1, Выбирают подходящие клетки для производства поли(А) РНК, которые содержат человеческие IFN-ciH IFN-|3- иРНК,.

Различные человеческие клетки индуцируют сендайвирусом; для про™ изводства интерферона известными методами. Через 24-48 ч определяют содержание IFN-ci и нейтрализацией специфической для типов антисывороткой « ,

ВыявляютJ что клетки намальва продуцируют более 50% IFE-et и до . 50% IFN-|i после индукции сендайвиру- сом,

Тест на нейтрализацию проводят следуюпщм образом.

Приблизительно 10 ед,, интерферона инкубируют при 37 С в течение 60- 80 мин:

1 ) антисыворотка против IFN-c i; окончательное разбавление

2)антисыворотка против человеческого IFN-ft; конечное разбавление l:300j

3)смесь первой и второй антисыво роток.

После инкубации определяют остаточную активность интерферона методом определения стерилы-1ых пятен,

П р и м е р 2„ Получают поли(А) РНК, которая содержит человеческие IFN-ct- . :иРНК из клеток намальва, индуцированных сендаивирусом.

Разводят клетки намальва и инду цируют сендаивирусом. иРНК выделяют через 9 ч после индукции сендаивирусом, так как после этого интервала количество интерферонспецифнчефсих мРНК достигает максимума,

Клетки отделяют центрифугированием в течение 20 мин при 1000 g, один раз промывают буфером NP-40 (0,14моль

ИаС1, 1,5 ммоль MgCl, Ю ммоль трис- НС1, рН 7,4) и ресуспендируют в NP 40 (Shell)-буфере с О,-5% неионного детергента (Шелл) и 2 мг/моль бентонита. Через 5 мин в ледяной

бане клеточное ядро центрифугируют, пеллетируют, как описано выше, экстрагируют содержащую РНК цитоплазмичес- кую фракцию добавлением 2% натрий- додецилсульфата, 5 ммоль этилендинитрилотетрауксусной кислоты и

50 ммоль трис-НС, рН 9, затем триж ды смесью фенол - хлороформ и один раз хлороформом и непосредственно после этого осаждают РНК спиртом,

ПОЛИ(А)РНК очищают с помощью олиго- (dT)-целлюлозной хроматографии, в результате центрифугирования в 5- 20%-ном градиенте сахарозы в Юммоль буфера ацетата натрия, рН 5,5,,

i ммоль этилендинитрилотетрауксусной кислоты(20 ч при скорости 25000 об/мин с ротором Spinco SW 27) разделяют по величине молекулы и собирают молеку- л-ы величиной порядка 6 S (единица седиментации) и 18 S (для простоты названная поли 12S-PHK).

Содержание интерферонспецифичес- кой иРНК (iFN-ciH IFN, мРНК) определяют в результате микроинъекции 12S-PHK в ооциты херононуса, измеряют активность интерферона в ооцитах. При этом получают 1 щ- г инъецированной (12S-PHK среднего титра интерферона около 1000 IE интернациональная единица интерферона , считая на

стандарт интерферона 69/19.

При этом около 80% -активности нейтрализуется антисывороткой против oi-типа интерферона, в то время как общая активность нейтрализуется толь-

ко смесью, состоящей из анти-о -1-И анти-|6-интерферона антисыворотки,

Пример 3. ПОЛН(А) РНК, которая имеет величину молекулы 5-18 S

()5 применяют в качестве матрицы для получения однониточной кДНК, причем 40 |1| r/ivm поли(А)РНК инкубируют в 50 ммоль трис-НС1, рН 8,3, 10 ммоль MgClj, 100 моль КС1, 1 ммоль

(fflTPS, 0,4 ммоль дитиотрейтола,

4 ммоль пирофосфата натрия, 20/ц г/мл олиго (деокси/тимидина 12-18 (Р1г-био химия), 25 (U г/мл актиномицина D со 100 ед/мл АМУ обратной транскрипта3134

зы в течение 45 мин при 44-45°С. Непосредственно после этого PHk гибрида РНК-ДНК удаляют путем одночасовой инкубации в 0,3 моль NaOH при 50 С, после чего однониточную кДНК нейтрализуют и осаждают этанолом.

Вторая нитка ДНК, комплементарная к однониточной ДНК, синтезируется при следующих условиях: 30 ш г/мл од- нониточной кДНК инкубируют в 0,12 моль буфера фосфата калия, рН 659, 10 ммоль MgCl, 10 ммоль дитио- трейтола, 1 ммоль dNTPS с 300 ед/мл ДНК поли1.1еразы 1 (Bolhringer Mann- heim), 6 ч 15°С. Затем экстрагируют фе:-олом и осаждают этанолом.

Полученную таким образом двуниточную смесь кДНК у обоих концов нитки модифидируют, удаляют выступающие концы отдельных нитей. Для этого ДНК инкубируют в 0,3 моль NaCl, 30 ммоль ацетата натрияj рН 4,5, 1 ммоль ZnCl с 1250 ед/мл S 1 нуклеазы (Miles Laboratories) в течение 30 мин при , после чего экстрагируют фенолом и осаждают этанолом. Полученную таким образом двуниточную кДНК разделяют на 5 20%-ном градиенте сахарозы в 10 ммоль буфера ацетат натрия при рН 5,5, в I ммоль этилен- динитрилотетрауксусной кислоты и выделяют те фракции, которые имеют по крайней мере 600 о.п. кДНК (0,5шг) удлиняют приблизительно на 15 нуклео

тидов путем наложения олигодезокси- цитидина у 3 -конца обеих в результате инкубации в 140 ммоль калийкако зилата, рН 6,9, 30 ммоль трис-НС1, рН 6,9, 2 ммоль СоС, 0,1 ммоль ди- тиотрейтола, 0,1 мг/мл BSA, 5 |Х моль dCTPs с помощью 500 ед. терминальной трансферазы в течение 4 мин при 37°С Аликвоту 2 1г г pBR322 линеаризз т с помощью, рестрикционной эндокуклеазы Pst 1, смесь кДНК удлиняют путем на- ложения олигодезоксигуанидина у конца 3 молекулы и модифицируют, чая выступаюпще концы олигодезокси- гуанидйна. Получают стабильные днДНК путем основного спаривания концов олигодеоксигуанидина со свободными

концами олигодезоксицитидина молекул кДНК. Для этого оба компонента этой реакции инкубируют в 0,1 ммоль-NaCl, 1 ммоль этилендинитрилотетрауксусной кислоты, 20 ммоль трис-НС1, рН 8, в течение 10 мин при 65 С, затем в течение 2,5 ч при 45 С и затем в течение ночи при 37 С.

5 о

0

n

0

5

С помощью этого метода регенерируется место расщепления рестрикционной эндонуклеазой Pst 1 и в последствии это можно использовать для того, чтобы вырезать из векторного гибрида кДНК-вставку.

Полученные этим методом гибрид- плазмиды из pBR322 и намальва-кДНК применяют для трансформации Escheri- chia coli НВ 101 Этим методом полу чают 30000 клонов трансформированных клеток Е„ ccli, которые разделяют на микротитропластинах.

И р и м е р 3. Тридекануклеотид метят в 50 ммоль трис-НС, рН 7,5, 10 ммоль MgCl, 5 ммоль дитиотрейто- лд, О 5 1 нмоль спермидина, 1 rii м Р /р-аденозинтрифосфата с 60 ед./мл Т4 полинуклеотидкиназы (Bethesda Research La,boratories) в течение 30 мин при 37 С до специфической активности около 500 Ки/ммоль у 5 -конца молекулы.

Этот меченый Тридекануклеотид применяют в качестве праймера (Dsi- mes) для синтеза однониточной кДНК, при этом в качестве матрицы служит ПОЛИ{А)ДНК из индуцированных сендаи- вирусом клеток намальва. Реакцию проводят при 5-10-кратном молярном избытке праймера по отношению к РНК в 50 ммоль трис--НС1, рН 8,3, 60 ммоль КС1, 5 ммоЛь дитиотрейтола, 50р г/мл актиномицина I , 4 ммоль MgCl , .4 ммоль натрийпирофосфата, 0,5 ммоль dNTPS со 100 ед./мп АМУ обратной транскриптазы в течение 90 мин при 37°С. После удаления РНК гибрид РНК- ДНК инкубирук т 1 ч в 0,3 моль NaOH при 50 С с последующей нейтрализацией 0,3 моль уксусной кислоты и кДНК применяют в качестве пробы гибридизации. Полученная таким образом кДНК несет радиоактивнзто метку липь в молекулах, которые были синтезированы из интерферонспецифического три- декануклеотида в качестве праймера и, следовательно, обладает высокой специфичностью для опознания интер- феронДНК-последовательности в гибридизации.

П р н м е р 4. Клетки отдельных клонированных трансформантов переводят на нитроцеллюлозный фильтр (22x15 см, величина пор 0,45 им, Millipore odes Schlliches), выращивают до величины колонии 2 мм диаметром и подготавливают к гибридизации. Гибридизацию нуклеиновой кислоты меченой на концах кДНК прово дят в смеси, содержащей 50% форм- амида, 4xSET (lxSET 0,15 моль NaCl, 5 ммоль этилендинитрилотетрауксус ной кислоты, 50 ммоль трис-НС, рН 8), 1 раствора Денхардта (0,02% BSA, 0,02% фиколла, 0,02% поливинилпирро- лидона), 0,5 мг/мл денатурированной спермы лосося ДНК, 0,1% натрийпиро- фосфата и 0,1% натрийдодецилсульфа- та, в течение 48 ч при 37°С. Фильтр промывают в растворе, состоящем из 50% формамида и 0,2xSSC (1х SSC 0,15 моль NaCl, 0,015 моль нитрата натрия) при С в течение 6-8 ч и затем опрыскивают раствором IxSSC. Фильтры высзтпивают при 20-2 5°С и при -70°С экспонируют с рентгеновс- кой пленкой (кодак ХВ). Всего в рв зультате скрининга получают приблизительно 13000 трансформированных колоний бактерий и вьщеляют 190 клонов В соответствии с этим около 1% всех клонов клонбанка содержат специфическую последовательность dCCTTCT- GGMCTG.

Прим ер 5. Тридекануклеотид- позитивные клоны (микротитропластины PI и Р2) и произвольно выбранные клоны микротитровой пластины (Е52) переносят на нитроцеллюлозный фильтр разводят , подготавливают для гибридизации бактерий и гибридизуют различными Р-меченными кДНК-вставками. Гибридизацию проводят. Добавляя в раствор гибридизации 50 ju г/мл поли(и и lOfur/мл поли (l) : поли(С), фильтр промывают после гибридизации в 50%-ном формамиде и 1х SSC. Оказа- лось, что клон Р1Н1 гибридизирует более чем 90% всех тридекануклеотид- позитивных клонов пластины Р1 и Р2, а также некоторые клоны пластины Б;52 Идентичность многих этих клонированн последовательностей подтверждают ре- стрикционным анализом. Клон Р2Н10 гибридизируется не только сам с собой, а также с клоном позиции 1С12, IF12, Е52Е1. Клоны Р1А6 и Р2В10 ана- лизирзтот таким же методом.

П р и м е р 6. 11оли(А)РНК отделяют от индуцированных и неиндуцирован ных клеток намальва, денатурируют в результате инкуба1щи в течение 1 ч при в 1 моль глиоксаля, 50%-ном диметилсульфоксиде, 10 ммоль буфера фосфата натрия, рН 7, разделяют на

1,4%-ном плавающем агаре, переносят на нитроделлюлозный фильтр и-гибри- дизируют с плазмндной ДНК, Р-мечен- ной с помощью никтрансляции. Плазмид- ную ДНК, которая произошла от индуцированного гена, гибридизируют в этой серии опытов только РНК из индуцированных клеток, но не РНК из неиндуцированных клеток. Применяемые для гибридизации плазмиды-ДНК являются РШ1 (А), P1.FI2 (В,1), Р2Н10(С) Р1А6 (Ё), Р2В10 (г). Из испытанных плазмид гибридизировались только P1F12, Р2Н10 и Р1А6 только с РНК из индзо ированных клеток, в то время как Р1Н1 и Р2В10 гибридизуются также с РНК из неиндуцированных клеток. Величина молекулы РНК, гибридизирутощей- ся с P1F12 и Р2Н10, 11-12 S, вели- чина РНК, гибридизирующейся с Р1АН, 12-14 Б (эти величины молекул известны для TFN-ci или IFN-/i-HPHK.- Пла-зми- ды P1F12, Р2Н10 и Р1А6 исследуют- дополнительно, чтобы однозначно установить их содержание в интерферонДНК- последовательности.

П р и м е р 7. Плазмидную ДНК фиксируют на нитроцеллюлозном фильтре и инкубируют при условиях гибридизации с ПОЛИ(А) РНК из индуцированных клеток намальва. Получают связанную ДНК-последовательность интерферона, Негибридизированную РНК смывают, гиб- ридизированную РНК вьтлавляют из ДНК и инъецируют в ооциты Xenopus laevis Если в ооцитах синтезируется интерферон-протеин, антивирусные свойства которого могут быть доказаны методом подсчета стерильньпс бляшек, 10 г линеаризованной плазмидной ДНК дена- турирзтот в 200 |цл 0,5 н. NaOH, нейтрализуют 200 ju л 0,5 н. уксусной кислоты и 20 X SET и фильтруют связыванием на нитроцеллюлозном фильтре диаметром 2,5 мм. Фильтр высушивают при комнатной температуре, выдерживают 2 ч при 80°С и затем в течение 1 ч при 53 С или также при 37 С в смеси, содержащей 50% формамида, 20 ммоль nHnepa3HH-N5N -биc-(2-этaн cyльфoкиcлoты), рН 6,5, 0,4 моль RaCl, 5 ммоль этилендинитрилотетра- уксусной кислоты, 10% декстрансульфа- та, 1% натрийдодецилсульфата,20|чг/мл Е. coli ntPHK, 50 jur/мл поли(А)пре- гибридизированной, и в самом буфере после добавления 14-40 (Иг индуцированной намальва-поли(АГ РНК гибридизировали в течение 5 ч. После этого фильтр промывают 3x20 мин при 25°С в смеси, содержащей 0,2-1 SET, 0,2% натрийдодецилсульфата, 1% декстран- сульфата, 5 (цг/мл т-РНК, затем 2 мин при 25°С в смеси, содержащей 2 ммрль этилендинитрилотетрауксусной кислоты, рН 8,0, 0,2% натрийдодецил- сульфата, 1% декстрансульфата, 5 |иг/мл т-РНК, затем 5 мин в смеси 2 ммоль этилендинитрилотетра- уксусной кислоты, рН 8,0, 0,2% нат- рийдодецилсульфата, 1% декстрансульфата, 5 (U г/мл т-РНК, затем 5 мин при в 2 ммоль этилендинитрилотетрауксусной кислоты, рН 8,0, 0,2% натрийдодецилсульфата, 5 lu г/мл т-РНК. Гибридизированную РНК в течение

4мин элюируют при 100 С в 1 мл Н,20 с 10 /иг т-РНК. После хроматографии на олиго-((1Т)-целлюлозной колонке РНК осаждают этанолом, вносят в

5мл HjO и инъецируют в ооциты Хе- nopus laevis. Ооциты после инкубации- в течение 2 дней при комнатной температуре испытывают методом подсчета стерильных бляшек на активность интерферона.

Подтвердилось, что клоны P1F12 и Р2Н10 несут вставку интерферонДНК.

В таблице приведены результаты испытаний.

Пример. Исследуют вставки кДНК клона P1F12 и Р2Н10 с помощью рестрикционной эндонуклеазы, причем определяют наличие сайтов рестрикции эндонуклеаз B&JnHI, Bgl II, Eco RI Hind III, EstI и Pvxi II. Сравнивают рестрикционные карты P1F12 и Р2Н10 с известным из литературы геном для IFN-p. Все три клона имеют Pvu II,

0

PstI и Bgl Ii сайты рестрикции. Кроме того, последовательность ДНК вставки клонов P1F12 и Р2Н10 с IFIJ- геном определяют по методу Максама и Гилберта (правый 3 Рлш II - и Bgl II фрагмент) и сравнивают с опубликованной IFN-|3-последовательностью. Последовательности P1F12 и

Р2Н10 идентичны с IFN- -геном.

Выяснилось3 оба клона на 5 конце не имеют полной IFN-p-последовательности, у них отсутствуют приблизительно 60 нуклеотидов региона, ко-

5 дирующего для зрелого протеина, У

3 -конца P1F12 является полным, Р2Н10 также содержит весь 3 -регион -кДНК, включая поли,оА)последователь ность, лроисходящ что от ПОЛИ(А)РИК.

Q P2H1D простирается однако епе замь:Т- .нее (1400 п.о.), З пoли(dA) в одной области с последовательностью олиго(д.С), следуя от последовательности неизвестного происхождения, ана5 ЛИЗ ДНК-последовательности различных отрезков этого дополнительного региона Р2Н10 не дает гомологии с геном. Перекрестно гибридизированные с клоном Р2Н10 клоны Р1С12 и Е52Е1 гибридизируются и с дополнительным регионом Р2Н10, а не с частью IFTJ-j, Примере. Клон Р1А6 гибриди- зируют с вирус-лндуцнрованной намаль- ва-РНК в регионе 12-14 S. Он содержит вставку кдак приблизительно 900 п.о., которая, как показал ре- стрикционный анализ, не имеет сайта рестрикции для BamHI, Bgl II, Eco RI, Hind III, PstI и Pvu II.

Доказательство того, что клон Р1А6 содержит IFK-|9-последовательность получают путем анализа ДНК- последовательности , Последовательность кДНК-вставки Р1А6 определяют сравнением с IFN-oi-последовательно- стью. Оказалось, что клон Р1А6 содержит на 49 пар оснований более короткий вариант LelFNC. Наличие поли-(А)- последовательности у З -конца Р1А6 указывает на то, что клон Р2А6 произошел от более короткой иРНК, чем опубликован1л.1Й клон LeIFN С.Регион кодирования LeIFN С, содержится в плазмидной ДНК.

5 И р и м е р 9. Клон Р1А6 - единственный 1П 1-Л-тип клона индентифи- цируют из коллекции 190 тридекану- клеотидпозитивных клонов. Гибриди- зуют 1800 клонов первоначального

0

5

0

9

кДНК-бакка со вставкой кДНВ клона Р1А6с | Троводят рестрикнионный анали и час тйчно определяют ДНК- Последова тельность кЦНК данного клона. Выл,е- ляют клон IF7„ Клон IF/ содержит как LeIFN А и сайты рестрикции для эндонуклеаа Bgl II и Ц,

Анализируют последовательносT)J «части ДНК IFN--(,i.-tHrfa клона (IF7) .

Для позиций 120--327 найдены еле-- дующкге части последоБательнос: Гиs

0. , CCTCK;;-CACAGATGAGGAOAATCTCTCTTTTCr CCTGCTT -.AAGGACACACG TGAT :0 GGATTTCCC .AGGAGGA-.-TTTGGGAACCAGTTCCMAAG аСТ(Ш1 CCA TCCCTGTCGTCGAT(; AOATGATCCAGCAGA TCTTCAA.TCTCTTCAGCACAAAaGAC TGATGv GGTGGTTGGGATGAGACGC JCCTA(;;,/ .CAAATTCT,i:

По сг авненкю с последовательнс -- стью IF:4 .fi--A THna клона, известкой литературы, новая последова.тепькост ДНК IFfi ;А-типа хли;::й ( з иблист нуклеотцаов № 120- 327 ямеет скедуп-- щие различня; в позицклю 137 н 170 соответ.:твенно нукле(;тяд А з-аыещеш нуклеотидом G-

П р и мер 10. .Пизаты культу бактерий,, траксфорккронанных PlAi; кл IF7 5 иесмшдуюг . -содержание биологически а:к ;квногт) явгерферс ая , Для этого 1GO мл культv p t i б.;лктернй вьфа; щивают г L-Bro :,h--cps-.i- дс оптячэ-мсс плотнос ги ,, 8 ггелу втир удот тем цен л рифул- ИроБО - К;. в г еч ние 10 мин . рк 7000 об. ;жн. прокьнают

50 ммоль трис - HGl,. рл 6. 30 и-лсл KaGl и суспендирукт в i.5 моль тсгс же самог о буфера. После 1 Ш:куба,ци; Е

1МГ/М31 лкзоциь;а в 1ч:чение 30 миь бактерии :аягикра г::-ю амора кивают во льду и с | ч аивают j иослг. з тэго удгллют центрифугированием в течение 1 ч при 40000 об/мин обломки клеток, Осадок стерильно фильтрз от и метсдо подсчета стерильных бляшек яспытъ, вают на активнс1сть кнтарферонае 1 полученных таккм ,четодом лязатах кл на IF7 1оказьшаит наличие прибли;и-- те.г1ьно 500 ед, на мл инчерферона; клон ЧАб в этом i ec 1-a не показал

активности, что объясняется ,верой 1Н другим ориентированкйм зс газки з ве торе плазмидыо

Пример S 1, Д-1Я :;; сяиесси;-: интерферона 3 кодированного IF7. s к честве промоторной лоследоватепьаос ти берут известньш из литературы пр мотор триптофаи:оперона Serratia. marcescens;, а ь жа-шстзе Г1РС - извв

10

стную из литературы последовательность ДНК. IF7-кДHK нocлeдoвaтeль- ность переваривают экзонуклеазой BAL 31S специфичной для двуниточной ДНК, в результате чего получают смесь молекул различной длины Затем эти i-.юлекулы лигируют в плазг-шду Штамм НВ1 01 трансформмруют зтнми плазмида- :-Ш; отдельные транСхформанты были ис пытаны на продукцию интерферона.

0,5-1 г TF7-3ставки инкубируют в 100 л 20 ммоль TpHc-HGl, рН 8,1

О.б моль Na,Gl5 12 ммоль MgGlg.j

i 2 ммоль GaGI.25 1 ммоль этилендинит- рршотетрауксусн.ой киспоты в течение 3 мик лрн 30°G с 0;5 ед, ВА1-31 rFjethesda Researcli Laborat. )« После этог о реак тим чаканчива,ют доба.влением 300 .; л 1Ь ммоль этилендинитрилотет- рауксусной кислоть;„ рН 1 .;й., нагревают 1 О- :VMH до G5 G5 экстрагир ук т Фенолом и эфиром и осаждают этанолом.

Осгдок вносят в И) тл 70 ммоль трис- KClj рН , 7 ммоль MgGl,„ i ммоль дитиотрей голад 0,4 ммоль аденозинтри- (Ьосфата, вместе с ммоль фосфо ризированных Hind ТЦ-левых (Bethes- da Research АаЪО Га ;, ) и инкубирут-тт

3 течение ночи при 14 € с О.,5-1 ед.

еакл шс заканчивают нагреванием в течение 10 мин до 65 G,, добавляют

2моль Н -аиетата и очищают гены ин - ерферона от нелигированных левых

и 3 о п р о п а н о л о м (0,6 о б ъ е м а)о Осадок растворяют ;з 30--50|цл 33 ммоль трис- ацетата.; рН- 7;9. бь ммоль К-а детата ;0 ммоль Mg-aireTaTa, i00 (ц г/мл сыво ротки альбу1-шна Бо винаи и переваривают 30-50 ед. H-.nd III в течение 23ч„ Реакдшо заЧа11ЧИБают путем нарезания в течение

мин до 65 Си

посла добавления 2 моль NH -ацетата гены интерферона осаж,дают изопропа- иолом 1,0,0 эоъема.) : Осадок растворя- ;от Б 10л 70 1 П ;оль трис- КС, рН 7,5, 7 ьмоль MgGIg S ммоль дитиотрейто jiE;, Up5 ммоль аденогзинтрифг сфата и с помор ью 10 ед„ Т4 -лигазы лигиру :от с 0,,2 ;иг Hind III - линеаризо- :t;a-:iHbiM обработанным фосфатазой экс- нрессионньпу; плазмидом рЕРЮЗ в тече- ние ночи при , рЕРЮЗ является PB.R 3 2 2-пр он 31Э о д ;-5ым S которое, с о д ерусгт :ооследовательность .промотора трипто- фаноперона S, marcescens и известную из .литературы ПРК его монно ли- н&а.ркзоЕать с Hind III вблизи ПРС.

Полученньш таким образом плазмиды применяют для трансформации Е. coli НВ101 и испытывают продук1шю интерферона отдельных трансформантов. По- лучают увеличение экспрессии интерферона приблизительно до 10 -кратного значения сии.

спонтанной экспрес Формула изобретения

Способ получения клона бактерий Escherichia coli, траисфгфмированно- го плазмидой рВЕ322, содержащей вставку Pst-1, кодирующую интерферон ei или f , вкгаочаюрщй получение фрагментов кДНК, содержащих кодирующую последовательность для генов об- и |Ь-интерферона, путем вьщеления иРНК из индуцированных вирусом Сендай клеток В-лимфоцитов синтеза на матрице поли( А) кДНК с помощью обратной транскриптазы, получения на основе одн, кДНК дн. ДНК в присутствии ДНК полимеразы 1, которую далее обрабатывают S-нуклеазой и присоединяют к 3 -концу этой ДНК олигодезоксицити- дин дпя нуклеотиды с помощью конце-

Составитель Н.Кузенкова Редактор Л.Веселовская Техред И,Верес

Заказ 5728Тираж 500Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д. А/5

.Троизводственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

0

5

0

5

вой дезоксирибонуклеотидилтрансфера- зы, вставку полученного фрагмента в плазмиду pBR322, которую предварительно обрабатывают эндонуклеазой Pst-l, S-1 нуклеазой, и к 5-концу которой присоединяют олигодезоксигу- анидин нуклеотзеды и трансформацию полученными гибридными плазмидами штамма Ё. coli НВ101 с последующим отбором нужного клона, отличающийся тем что, с целью одновременного отбора клонов, несущих рекомбинантные молекулы ДНК с геном,

кодирующим и и/ -интерферон, иРНК вьщеляют из клеток В -лимфоцитов Hamalva по истечении 9 ч после индукции вирусом, синтез кДНК осуществляют на (А)РНК с величиной молеку- лъ 6 и 18 S, получают дн. ДНК размером 600 п.о., а выбор клона, содержащего комплементарную последовательность к тридекануклеотиду, меченному радиоактивным фосфором, с формулой 5 ССТТСТГгОААСТО-З осуществляют прямой гибридизацией с последующей идентификацией клона, содержащего рекомбинантные молекулы ДНК с геном, кодирующим интерферон oi к |Ь „

Корректор В.Бутяга

Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии. Целью изобретения является одновременный отбор клонов, несущих рекомбинантные молекулы ДНК с геном, ксдируюпщм ei- и 0-интерферон. Одновременный отбор клонов обеспечивается наличием гомологии между (от 5 до 7) функциональными IFN-Ыи генами. Участок гомологии имеет длину 13 нуклеотидов со следующей формулой 5 CCTTCTGGAACTG-3 . Кроме того, и РНК из клеток Namalva выделяют через 9 ч после индукции вирусом, синтез к ДНК осугчествляют на (Л) РНК с величиной молекулы 6 и 18 S, а дн.ДНК получают размером 600 п.о. иэ ы