Способ получения интерлейкина-2 человека Советский патент 1989 года по МПК C12N15/00 C12P21/00 

1

Изобретение относится к генетической инженерии и касается способа получения интерлейкина-2 человека в клетках бактерий Escherichia coli.

Целью изобретения является повышение выхода интерлейкина-2.

Повыпение выхода белка в клетках Е. coli обеспечиваетея за счет того, что конструируют рекомбинантные плазмидные ДНК pTI oL2-22, pTU-Ioi2-22, pGI ,2-22, pTI oi2-21a, pTI oi 2-21Ь, кодирующие синтез интерлейкина-2, полученными плазмидами трансформируют бактериальные клетки Е. coli.

Пример 1. Линию клеток лейкемии Т человека, клетки Джуркат суспендируют в среду RPMI 1640, содержащую 10% (об./об.) FCS, и получают

рентгеновскими лучами до 10000 Р. при комнатной температуре в течение 50 с. Затем клетки, подвергнутые облучению, культивируют в течение 5 дней при 37°С в инкубаторе, содержащем 5% С0а, при начальной плотности клеток Ixl0ff кл./мл. Клетки после обработки мутагеном (0,2 кл./углубление) помещают в углубления 10 микропластинок, имеющие плоское дно, причем каждая микропластинка имеет 96 углублений, и культивируют при 37 С в инкубаторе, содержащем 5% СОг, в течение 21 дня. Клоны, полученные в углублениях и проявляющие тенденцию к росту, повторно переносят в свежую культураль- ную среду- С целью увеличения размера клона и размноженные клоны культиви4ь 1

СО

о о

СП

О

руют в течение 24 ч при начальной плотности клеток 1x106 кл./мл в присутствии 50 мкг/мл КОН А, измеряют активность интерлейкина-2 (ИЛ-2).

Затем линию Т-клеток человека, обозначенную как Джуркат III (J - III) и клонированную из клетки-родителя Джуркат, выделяют. В результате этого выход ИЛ-2 увеличивается в 40 раз по сравнению с родительскими клетками. Линию I-III клонированных клеток выращивают при известных условиях, и скорость их роста почти та же, что и у обычных клеток Джуркат.

Клетки (1x10 кл./мл) J-III перевивают в 1000 мл синтетической куль- туральной среды, RITC 55-9 в роликовой колбе для выращивания культур и культивируют в течение 4 дней при

37 С, клетки после размножения собирают путем центрифугирования. Собранные клетки снова превивают в среду, в которую добавляют 25 мкг/мл КОН А с тем, чтобы плотность клеток составила 4x10 кл./мл. Используют четыре роликовые колбы для выращивания, причем в каждую колбу загружают 1000 мл привитой культуральной среды. Культивирование продолжают в течение 6 ч при вращении колб.

Клетки Джуркат (1,2x10 ), стимулированные 25 мкг/мл КОН А в течение 6 ч, суспендируют в 8000 мл фосфатного буфера, сбалансированного соляным раствором. Клетки промывают дважды с помощью центрифугирования: и вновь суспендируют в 800 мл раствора RSB (10 ммоль трис-HCl, рН 7,5; Юммоль/ NaCl; 1,5 ммоль MgCla), содержащего комплекс Ринуклеозиды-Ванадил (ЮмМ) в качестве ингибитора нуклеазы. Затем добавляют детергент NP-40 таким образом, чтобы его конечная концентрация составила 0,05%; содержимое энергично перемешивают, а ядра клеток удаляют с помощью центрифугирования в течение 5 мин со скоростью 3000 об/мин при . В верхний слой добавляют SDS (0,5%) и ЭДТК (5 ммоль) и цитоплазматическую РНК экстрагируют добавлением равного объема фенола. После трехкратного экстрагирования фенолом РНК осаждают двумя объемами этанола и осадки собирают с помощью центрифугирования, затем их растворяют в 10 ммоль трис-HCl при рН 7,5. Количество полученной РНК составляет 196 мг.

Фракционирование иРНК осуществлят с использованием хроматографии на олиго(дТ)-целлюлозе. Раствор абсорбции - раствор при рН 7,5, содержащий 20 ммоль трис-HCl, 0,5 моль NaCl, 1 ммоль ЭДТК и 0,5% SDS, а элюирова- ние осуществляют водой и 10 ммоль трис-HCl (рН 7,5) по очереди после промывки колонны буфером (20 ммоль трис-HCl, рН 7,5; 0,5 ммоль NaCl; 1 ммоль ЭДТК). В результате элюирова- ия получают 3,6 мг иРНК. Затем 2,4 мг полученной иРНК фракционируют с помощью центрифугирования в градинте плотности сахарозы (градиент лотности сахарозы от 5 до 2,5% в растворе с рН 7,5, содержащем 50 ммоль трис-HCl, 1 ммоль ЭДТК и 0, 2 моль aCl), подвергают центрифугированию со скоростью 26 000 об/мин в течение 24 ч при 4°С, и фракции с 11 по 12С РНК подвергают фракционированию на ракции № 12, 13 и 14 в количестве 59; 46 и 60 мкг соответственно.

РНК, полученную во фракции № 13, водят в форме микроинъекции в ово- цит Xenopus lalvis (50 нг иРНК/яйце- летку) и культуральный верхний слой используют для анализа активности ИЛ-2.

Как показано в табл. 1, увеличение полученной дозы 3Н-ТДР и увеличение количества активированных Т- лимфоцитов согласуется, что указывает на то, что иРНК в этой фракции содержит ИЛ-2 иРНК человека.

Далее кДНК синтезируют в лабораторных условиях из фракции № 13 с П-12С иРНК, содержащей ИЛ-2 иРНК, и рекомбинантную ДНК строят с помощью вектора плазмида pBR 322. С поощью рекомбинантной ДНК трансформируют кишечную палочку Escherichia coli и клон, содержащий клоны ИЛ-2 кДНК, изолируют следующим образом: 50 ммоль трис-HCl буфера (рН 7,5), 30 ммоль NaCl, 6 ммоль MgCl., 5 ммоль дитиотрейтола (ДТТ), 0,5 ммоль каждого из дАТФ, дГТФ, дПТФ, дТТФ (дЦТФ г состоит из радиомеченого 32Р дЦТФ) , 0,7 мкг олиго(дТ)10, Ю мкг иРНК и I 5 ед, AMV обратной транскриптидазы смешивают и поддерживают в течение 90 мин при 41 С.

После завершения реакции ДНК извлекают в виде этаноловых осадков после обработки фенолом, а затем ДНК растворяют при рН 7,5 в растворе,

содержащем 20 ммоль трис-HCl и 1 ммол ЭДТК. В результате синтезируют 2,5 мкг он-кДНК. Чтобы удалить иРНК, содержащуюся в этом растворе, приготавливают 0,33 н. раствор NaOH путем добавления NaOH, затем раствор выдер живают в течение 15 ч при комнатной температуре и нейтрализуют равным объемом 1 М трис-HCl при рН 7,5. Далее полученный раствор пропускают через колонну Сефадекс G-50. Всего получают 1,8 мкг кДНК.

50 ммоль фосфатного буфера рН7,5 10 ммоль MgCl2, 10 ммоль ДТТ, 0,75 ммоль каждого из дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ (дЦТФ состоит из радиомеченого ЭН дЦТФ), 1,8 мкг он-кДНК и 8 ед. полимеразы I смешивают в течение 15 ч при 15 С. После завершения реакции ДНК извлекают в виде этанолового осадка после нескольких обработок фенолом и хлороформом. Образуется 1,10 мкг дн-кДНК. Смесь 50 ммол ацетата натрия (рН 4,5), 0,2 ммоль NaCl, 1 ммоль ZnCla и 1,10 г дн-кДНК инкубируют в течение 20 мин при 37°С затем в нее добавляют 0,25 ед. нук- леазы S и смесь инкубируют еще в течение 15 мин.

После завершения реакции полученный продукт; дважды обработанный фенолом, пропускают через Сефадекс G-50, в результате чего получают 0,55 мкг дн-кДНК.

Смесь 0,14 моль какодилата калия,

30ммоль трис-основания, 0,1 ммоль ДТТ, 1 ммоль СоС12, 0,64 ммоль 32Р- дЦТФ (уд. активность 2,7x10 отсчетов мин нмоль), 0,55 мкг дн-кДНК и 5 ед. терминальной трансферазы инкубируют в течение 7 мин при 37 С, затем пропускают через Сефадекс G-50 после обработки фенолом, чтобы получить 0,50 мкг ДНК в виде этаноловых осадков. Извлеченная ДНК содержит примерно 50 дЦМФ-остатков на обоих 3 -терминалах.

10 мкг плазмиды pBR 322 ДНК рассекают ферментом сечения Pst I и к

31-терминалам рассеченной ДНК добавляют дГМФ-цепь с использованием того же метода, что при добавлении дЦМФ к дн-кДНК за исключением того, что вместо дЦТФ используется дГТФ.

Смесь 50 ммоль трис-HCl (рН 7,5), 0,1 моль NaCl, 5 ммоль ЭДТК, 0,05 мк pBR 322, удлиненного дГМФ-остатками, и 0,01 г кДНК, удлиненной дЦМФ, инкубируют сначала в течение 2 мин при 65 С, затем в течение 120 мин при 46 С, в течение 60 мин при 37 С и в течение 60,мин при комнатной температуре.

Е. coli X 1776 прививают в 50 мл Л-бульона, содержащего 100 мкг/мл диаминопимелиновой кислоты, 50 мкг/мл

0 тимидина, 1% триптофана, 0,5% экстракта дрожжей, 0,5% NaCl н 0,1% глюкозы, и культивируют при встряхивании при 37°С до тех пор, пока поглощение культуральной жидкости в области

5 562 нм не даст оптическую плотность 0,3. После завершения культивирования культуральную жидкость выдерживают при 0°С в течение 30 мин, затем бактериальные клетки собирают с помощью

0 центрифугирования, промывают дважды 25 мл раствора, содержащего 5 ммоль трис-HCl (рН 7,6), 0,1 моль NaCl, 5 ммоль MgCl2 и 10 ммоль RbCl.

Полученные таким образом клетки

5 суспендируют в 20 мл раствора, содержащего 5 ммоль трис-HCl (рН 7,6), 0,25 моль КС1, 5 ммоль MgCla, 0,1 моль СаС12 и Ю ммоль RbCl, и выдерживают при О С в течение 25 мин.

0 Далее клетки собирают и вновь суспендируют в 1 мл того же раствора. Затем описанную выше рекомбинантную ДНК добавляют в 0,2 мл суспензии клеток и суспензию выдерживают при О С в тече5 ние 60 мин. В культуру добавляют

О,7 мл Л-бульона и смесь инкубируют при встряхивании в течение 30 мин при 37 С. Полученную таким образом культуральную среду (О,1 мл) равно-

Q мерно распределяют на поверхности среды, содержащей 1,5% агара, состоящей из Л-бульона, содержащего 100 мкг/мл диаминопимелиновой кислоты, 50 мкг/мл тимидина и 15 мкг/мл

5 тетрациклина, и инкубируют при 37 С в течение 2 дней.

Образующиеся в результате 432 колонии разделяют на 18 групп, каждая из которых содержит 24 различных бако термальных клона, прививают в 200 мл Л-бульона, содержащего 100 мкг/мл аминопимелиновой кислоты, 50 мкг/мл тимидина и 10 мкг/мл тетрациклина, и культивируют при встряхивании при

5 37°С в течение 5 - 7 ч. Затем 200 мл свежего Л-бульона, содержащего хлор- амфеникол с концентрацией 170 мкг/мл, добавляют в культуру и культивирование продолжают еще в течение ночи.

Полученную таким образом после амплификации дНК-плазмиду подвергают очистке с использованием известных средств. Клоны, содержащие кДНК ИЛ-2,

отбирают с помощью аналитического метода гибридизации - трансляции иРНК (Г - Т-анализ).

Г-Т-анализ осуществляют следующим образом.

Очищенную ДНК (25 мкг) рассекают ферментом рестрикции Hind III, обрабатывают три раза фенолом, смесью фенол-хлороформ и хлороформом соответственно, осаждают этанолом, промыва- ют этанолом (80%) и растворяют в 40 мкл 80%-ного формамида.

Затем реакционную смесь нагревают

с целью денатурирования до температуры 90 С, которая поддерживается 5 мин,20 тивность ИЛ-2. Поэтому этот клон

Как показано в табл. 2, только ДНК-плазмида, полученная после очис ки из единственной колонии, обозначенная рЗ-16, дает положительную ак

разбавляют 1,3 мл с 10 х ССЦ (1,5 моль} NaCl, 0,15 моль цитрата натрия). Далее ДНК фиксируют на нитроцеллюлозных фильтрах, фильтраты сушат при до 80°С в течение 3 ч и инкубируют в течение 18 ч при 37°С в растворе, содержащем 50% формамида, 20 ммоль Pipes (pH 6,5), 0,75 моль NaCl, 5 ммоль ЭДТК, 0,2% SDS и 250 мкг по- ли(А) иРНК, полученной из индуцированных J-III клеток, с целью получения гибрида ДНК, зафиксированной на фильтрах, с ИЛ-2 иРНК, Затем фильтры промывают при 65 С три раза раствором, содержащим 10 ммоль Pipes (pH 6,5), 0,15 моль NaCl, 1 ммоль Pipes, 10 ммоль NaCl, и обрабатывают 0,5 ммоль ЭДТК, 0,1%-ным раствором SDS при 95°С в течение 1 мин с тем, чтобы извлечь с фильтров гибридизи- рованную. иРНК. Экстрагированную таким образом иРНК подвергают очистке на колонне из олиго-дТ-целлюлозы в соответствии с известными методами и инъецируют в овоциты Xenopus с целью определения активности ИЛ-2 транслированных протеинов. Одна из 18 групп, каждая из которых состоит из 24 клонов, дает положительную активность ИЛ-2 48 ед./мл в испытании на поглощение Н-ТдР; в то время как другие группы дают четкий отрицательный результат.

Затем 24 отдельные колонии, приидентифицируют как клон, содержащий ИЛ-2 кДНК (Е. coli Х1776/рЗ-16, А Т 11995 (FERM-BP-225). Таким образо ДНК-плазмида рЗ-1 6 действительно со25 держит ДНК (ген ИЛ-2), способную об разовывать специальный гибрид с ИПиРНК.

кДНК-вставка плазмиды рЗ-16 обла дает такими свойствами, которые псз

30 воляют рассекать ее ферментом сечен Xbal в единственном сайте, а фермен том BstNI - в двух сайтах (вверх и вниз от сайта сечения Xbal). Однако плазмида рЗ-16 содержит кДНК-вставк

35 состоящую из примерно 650 пар оснований, которая соответствует части ИЛ-2 иРНК с 11-12С.

Поэтому получают другую кДНК-биб лиотеку, используя ИЛ-2 иРНК в каче

40 стве шаблона. Однонитевую кДНК

(1,6 мкг) синтезируют с использованием 4 мкг ИЛ-2 иРНК, удлиненной с помощью дЦМФ-остатков а дн-кДНК си тезируют с использованием олиго

45 (дГ) 12..-18 в качестве затравки для ДНК-полимеразы I (фрагмента Кленова кНДНК (0,6 мкг), по длине превыша ющую маркер размера ДНК в 680 пар о нований, получают с помощью центриф гирования градиентом сахарозы и вставляют в сайт Pst I плазмиды pBR322 с помощью стандартного метод отсечения G-C-концов. После трансформации Е. coli X 1776 с помощью р

50

надлежащие положительной группе, при- 55 комбинантной ДНК отбирают приблизительно 2000 колоний с помощью метод гибридизации на месте с транслирова ными концами вставки кДНК рЗ-16 в к честве зонда, выявляют колонию, совивают в 200 мл Л-бульона, культивируют в аэробных условиях в течение 5-7 ч при 37°С и добавляют свежий Л-бульон, содержащий хлорамфеникол.

5

0 тивность ИЛ-2. Поэтому этот клон

После амплификации ДНК-плазмиды в процессе культивирования в течение ночи плазмиду подвергают очистке в соответствии со стандартными процеду рами. После рассечения примерно 5 мкг каждой ДНК-плазмиды с помощью Hind III каждую ДНК-плазмиду фиксируют на нитроцеллюлозных фильтрах. 0 Фильтры подвергают гибридизации с ИЛ-2 иРНК и гибридотированную иРНК извлекают, а затем в виде инъекции вводят в овоцит Xenopus с тем, чтобы определить активность ИЛ-2 транслированных протеинов.

Как показано в табл. 2, только ДНК-плазмида, полученная после очистки из единственной колонии, обозначенная рЗ-16, дает положительную акидентифицируют как клон, содержащий ИЛ-2 кДНК (Е. coli Х1776/рЗ-16, А Т 11995 (FERM-BP-225). Таким образом, ДНК-плазмида рЗ-1 6 действительно со5 держит ДНК (ген ИЛ-2), способную образовывать специальный гибрид с ИП2 иРНК.

кДНК-вставка плазмиды рЗ-16 обладает такими свойствами, которые псз

0 воляют рассекать ее ферментом сечения Xbal в единственном сайте, а ферментом BstNI - в двух сайтах (вверх и вниз от сайта сечения Xbal). Однако плазмида рЗ-16 содержит кДНК-вставку,

5 состоящую из примерно 650 пар оснований, которая соответствует части ИЛ-2 иРНК с 11-12С.

Поэтому получают другую кДНК-биб- лиотеку, используя ИЛ-2 иРНК в каче0 стве шаблона. Однонитевую кДНК

(1,6 мкг) синтезируют с использованием 4 мкг ИЛ-2 иРНК, удлиненной с помощью дЦМФ-остатков а дн-кДНК син тезируют с использованием олиго

5 (дГ) 12..-18 в качестве затравки для ДНК-полимеразы I (фрагмента Кленова), кНДНК (0,6 мкг), по длине превышающую маркер размера ДНК в 680 пар оснований, получают с помощью центрифугирования градиентом сахарозы и вставляют в сайт Pst I плазмиды pBR322 с помощью стандартного метода отсечения G-C-концов. После трансформации Е. coli X 1776 с помощью ре0

комбинантной ДНК отбирают приблизительно 2000 колоний с помощью метода гибридизации на месте с транслированными концами вставки кДНК рЗ-16 в качестве зонда, выявляют колонию, со30

держащую плазмиду р об2-ЬОА, размером 850 пар оснований (Е. coli X 17/6/pIci2-50A, Аоб 11996 (FERM-BP- 226).5

Чтобы изолировать ген, кодирующий Ш1-2-пептид, из трансформированной культуры Е. coli X 1776 piьб2-50А, ДНК-плазмиды обрабатывают с ферментом рестрикции Pst I, выделяют фраг- ю менты ДНК из клеток известными методами. Получающийся таким образом фрагмент меньших размеров среди двух фрагментов ДНК является геном ДНК, кодирующим ИЛ-2-пептид.15

Пример 2. Плазмида pKCR состоит из сегментов ДНК вируса SV 40, содержащих промотор исходного гена, начало репликации (0,725 - 0,648 м.е.). сайт полиаденилирования 20 из исходного гена (О,169-0,144 м.е. части гена -глобина кролика (фрагмент BamHI-PVU II),сегмента из pBR322 (фрагмент EcoRI-BamHI), содержащего начало репликации и ген стойкости к25 ампициллину. Эту плазмиду рассекают с помощью BamHI и после заполнения обоих концов рассеченной ДНК ДНК-по- лимеразой I (фрагмент Кленова) вводят синтетическую ДНК линкера Pst I с тем, чтобы закончить построение pKCR (Pst I). -Плазмиду pKCR (Pst I) pacceкают ферментом Sail, обрабатывают фрагментом Кленова с целью заполнения концов, а затем частично рассекают ферментом EcoRI с тем, чтобы получить фрагмент EcoRI-Sall, который содержит всю ДНК, полученную из вируса SV 40, и ген глобина. Этот фрагмент затем подвергают лигации с куском pBR328 ДНК, который содержит ген стойкости к тетрациклину и начало репликации. Полученная в результате плазмида рСЕ-1 содержит единственный сайт Pst I в направлении вниз сразу 45 после полученного ранее промотора SV 40.

Вставку кДНК-плазмиды pIoi2-50A отсекают путем рассечения ферментом Pst I и подвергают лигации с рСЕ-1, 50

рассеченным Pst I, с целью построения pCEIoi-2, в котором экспрессия структурного гена ИЛ-2 должна осуществля-.. ться под контролем ранее вставленного промотора SV 40. Плачмида рСЕ-155 ранее строилась для клонирования . кДНК методом G-C-концов в бактерии и прямой экспрессии в клетках млекопитающего .

40

, 35

0

5

0 5

5

0

части плазмиды для экспрессии Клетки COS-7 (6 х 104/мл) сусЭту плазмиду обрабатывают при помощи Hhal, а затем вводят г помощью ДНК-трансфекции в линию COS-7 трансформированных клеток обезьяны, которая позволяет осуществить репликацию ДНК, содержащей начальные последовательности вируса SV 40.

Важным этапом является обработка плазмиды с помощью Hhal перед транс- фекцией для повышения эффективности экспрессии кДНК, так как последовательности, которые могли бы препятствовать репликации ДНК после трансфек- ции в COS клетки, удаляют из существеннойкДНК.

пендируют в 0,5 мл ДМЕМ, содержащего 5% F1S, которые находятся на пластине для культивирования с 24 углублениями (типа Нунк), и инкубируют в течение 4 ч при 37°С. Затем смесь 1 мкг описанного выше вектора, 17,6 мкл 1 мМ трис-HCl, содержащего 0,1 ммоль ЭДТК, 2,4 мкл 2М СаС1г и 120 мкл 2 х х HBS, содержащего 50 ммоль Pipes, 280 ммоль NaCl и 1,5 ммоль х х 12 (рН 7,10), добавляют в культивируемые клетки, которые инкубируют в течение 4 ч при 37 С. Культураль- ная среда обезвоживается. Затем клетки промывают 1 мл PBS и культивируют , в 1 мл ДМЕМ, содержащем 5% FCS. Каждые 24 ч 500 мл среды заменяют све- 5 жей средой. Каждую порцию среды, собранную Б определенный момент времени, хранят при 4 С до использования. Спустя 2-3 дня после трансфекции культуральную среду анализируют на активность ИЛ-2 человека.

Как показано в табл. 1, полученный в результате верхний слой культуры клеток COS-7 после траксфекции с использованием рСЕ1е6 2, обладает активностью ИЛ-2. Однако в культураль- ной среде клеток после трансфекции с использованием рСЕ-1 активности ИЛ-2 не обнаружено.

Активность ИЛ-2, обнаруженная в культуральной среде клеток после трансфекции клетки COS-7 с помощью pCEIoi-2, нейтрализует с помощью моно- клонального анти-ИЛ-2 человека антитела мыши (BALB/k). Тот факт, что COS-7 клетки после трансфекции с использованием pCEIoi-2 секретируют ИП-2 человека, показьюает, что эукариоти- ческие клетки, трансформированные рекомбинантной ДНК, содержащей ген,

111

кодирующий полипептид ИЛ-2, и вектор ДНК, способный к репликации в указанных клетках, может быть использован для получения ИЛ-2,

Пример 30 Escherichia coli X 1776/pI(x,2-50A, AT 11 996/FERM-BP- 226 прививают в 250 мл Л-бульона, содержащего 100мкг/мл диамичопимелино- вой кислоты, 50 мкг/мл тимидина, 1% триптофана, 0,5% экстрактов дрожжей, 0,5% NaCl и 0,1% глюкозы, и культивируют при встряхивании и температуре 37°С до достижения оптической плотности в области 562 нм культуральной средой 0,5. После завершения культивирования культуральную среду выдерживают при 0°С в течение 30 мин и клетки собирают с помощью центрифугирования, промывают один раз 20 ммоль трис-HCl при содержании 30 ммоль NaCl и вновь суспендируют в 1,8 мл того же буфера. Раствор, содержащий 0,2 мкл лизоцима (10 мг/мл) и 20 мл 0,5 М ЭДТК, добавляют в - клетки и смесь выдерживают при 0°С в течение 20 мин, а затем замораживают - размораживают 3 раза последовательно. Далее экстракты клеток (1,5 мл) получают после центрифугирования со скоростью 40 000 об/мин в течение 30 мин. Экстракт подвергают высаливанию с помощью 85%-ного раствора сульфата аммония, пропускают через Сефадекс G-15 с целью удаления солей, затем помещают на колонку хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе и фракцию, элюированную с помощью 0,06 М буфера трис-HCl (рН 7,6), собирают. Собранную таким образом фракцию сушат вымораживанием и помещают на стеклянные шарики с определенным размером пор 250 А, содержащемся в колонне для хроматографии, для анализа активности ИЛ-2 в элюенте с использованием 0,3 М буфера глицин-НС1. Фракция, содержащая ИЛ-2, обладает активностью ИЛ-2 12 ед./мл. Полученные результаты указывают на то, что E.Coli X1776/pIoi2-50A, AT 11996 действительно производит ИЛ-2.

Пример 4. Конститутивную линию клеток-производителей ИЛ-2 типа Т-А1886 (АТСС CRL 8130) выращивают аналогичным образом в роликовой колбе для культуры. Выращенные клетки суспендируют в свежую синтетическую среду RITC-55-9 при начальной плотности клеток 1x10 кл./мл и спус7900512

тя 8 ч после начала культивирования клетки используют для экстрагирования ИЛ-2 иРНК в виде фракции 11-12С.

сСинтезируют двунитевую кДНК, а

кДНК длиной, превышающей 600 пар оснований (2,4 мкг), получают после фракционирования с использованием градиента плотности сахарозы, кДНК

10 затем удлиняют с помощью дЦМФ-остат- ков с использованием терминальной деоксинуклеотидилтрансферазы (50 нг), ее подвергают ренатурации с 250 мг плазмиды pBR322, удлиненной с помощью

15 дГМФ и рассеченной с помощью Pst I. Полученные в результате гибридные плазмиды используют для трансформации Е. coli X 1776, в результате чего получают примерно 4000 трансфор20 мированных клонов. Отбирают три клона, комплементарных с кДНК плазмиды рЗ-16, которая используется в качестве зонда.

Пример 5. Плазмиду, которая

25 кодирует синтез ИЛ-2 человека в кишечной палочке Е. coli, строят следующим образом. Плазмиду 2-22 строят из pTr S-3 и pIoi2-50A, содержащей кДНК ИЛ-2. Плазмида pTr S-3

30 содержит вставку области промотора Тгр и Шайн Далгарно (Shine Dalgarno - SD) между сайтом EcoRI и сайтом Clal плазмиды pBR 322. Кроме того, эта плазмида содержит кодон АТС в 13 п.о.

35 расположенный вниз от SD-последова- тельности, а также единственньй сайт Sph I. Этот вектор является эффективным для продуцирования указанного J протеина, если ДНК-последовательность, 40 соответствующую указанному протеину, вставляют в область, расположенную в направлении вниз сразу же после кодо- на АТС, которая образуется в результате SphI ферментации и последующей

45 обработки при помощи ДНК-полимеразы Т4 плазмиды pTr S-3. Плазмиду pTr S-3 (30 мкг) рассекают ферментом сечения Sph I известными методами и после серии обработок фенолом и хлороформом

50 этаноловые осадки извлекают, затем оба конца снабжают наплывом путем обработки ДНК-полимеразой Т4. Далее ДНК (21,4 мкг) извлекают путем аналогичной обработки фенолом, хлороформ

55 мом и осаждения этанолом. С другой стороны, 380 мкг плазмиды ploi 2-50A, содержащей кДНК ИЛ-2, рассекают с помощью фермента Pst I и ИЛ-2 кДНК- вставку изолируют с помощью электрофореза на агаровом геле. кДНК-встав- ку (11 мкг) рассекают с помощью Hgi AI, обрабатывают с помощью ДНК-поли- меразы ТА и 10 мкг ДНК больших размеров изолируют с помощью электрофореза на агаровом геле. Получают кДНК (7,2 мкг), содержащую информацию относительно синтеза 132 аминокислот, причем этот фрагмент ДНК имеет тупые концы.

Затем полученный таким образом фрагмент кДНК сшивают с вектором pTr S-3, предварительно подвергнутым ферментации с использованием Sph I и обработанным ДНК-полимеразой Т4, в точке, расположенной в направлении вниз сразу после АТС-последовательности. Сшитую таким образом плазмиду затем используют для трансформации клеток Е. соli HBIOI известными методами.

Сшивку осуществляют следующим образом. Более длинный фрагмент кДНК ИЛ-2 (0,4 мкг) и 0,2 мкг ДНК вектора pTr S-3 смешивают с 0,8 ед. ДНК-лига зы Т4 в 66 ммоль трис-HCl при рН 7,5 при содержании 6,6 ммоль MgCl,, 1 ммоль АТФ и 10 ммоль ДТТ. Смеси дают возможность взаимодействовать при 4°С в течение ночи. Среди трансформированной культуры, образующейся на агаровой пластине с Л-бульоном, содержащим ампициллин, отбирают колонии, содержащие порцию ИЛ-2 кДНК, кото- рая включает информацию относительно 132 аминокислот. Такую селекцию осу- . ществляют на месте аналитическим методом гибридизации колоний. Выбранны таким образом колонии культивируют (10 мл), чтобы получить ДНК-плазмиды в результате обработки лизоцимом и замораживания-размораживания. ДНК- плазмиды рассекают с помощью Pst I и Xbal и полученные в результате про дукты подвергают анализу с помощью электрофореза на агаровом геле, чтоб идентифицировать рТ1об2-22, в кото- ,ром кДНК сшита с АТС-последовательностью плазмиды pTr S-3 с правильной ориентацией. Е. coli HBIOI, содержащую pTIoi-2-22, выращивают при стандартных условиях, которые используют для размножения микроорганизмов. Клетки выращивают в 10 мл Х-бульона (2,5% бактотриптона, 1,0% экстрактов дрожжей, 0,1% глюкозы, 20 ммоль MgS04, 50 ммоль трис-HCl, рН 7,5), содержащего 25 мкг/мл стрептомицина

и 2j мкг ампициллина при 37°С в течет ние ночи.

Суспензию объемом 1 мл культуры прививают на том же бульоне (100 мл) и культивирование осуществляют при 37°С. Когда оптическая плотность достигает примерно 1,5-2,0, добавляют 3-иидолакриловую кислоту (ИАК), Спустя 3 ч после добавления индуктора клетки собирают, промывают 20 ммоль трис-HCl (рН 7,5; 30 ммоль NaCl) и вновь суспендируют в 8 мл того же буфера. Для эффективного функционирования промотора Тгр такой индуктор, как ИАК, добавляют так, чтобы его конечная концентрация составила 50 мкг/мл. Полученные таким образом в бактериальных клетках протеины экстрагируют в результате обработки ультразвуком (06С, 2 мин) или в результате ферментации лизоцимом 8 мкг/л (0°С, 20 мин) и осуществляют трижды последовательно замораживание-размораживание. В соответствии с этими процедурами ИЛ-2 в общем случае экстрагируется из организмов. Активность экстрагированного ИЛ-2 изменяется в области 10000 - 120000 ед./мл.

Пример 6. Плазмиду pTUIei 2-22, несущую ИЛ-2 кДНК, строят из pTUBIP-5 и рТ1 об2-22. Плазмида рТ pTUBIP-5 включает вставку промоторной последовательности tufB в pBR 322. Кроме того, плазмида содержит единственный сайт Clal, и он расположен вниз на 2 п.о. от SD-последовательно- сти. Так как pTr S-3 кроме того, содержит сайт Clal между SD-последова- тельностью и кодоном АТС инициирования и так как этот сайт Clal не разрушается в процессе конструкции плазмиды экспрессии с использованием pTr S-3 и кДНК ИЛ-2, бактериальный промотор trp просто заменить промотором tufB так, что ИЛ-2 кДНК подвергается экспрессии при управлении промотором tufB.

Поэтому плазмиду (30 мкг) рассекают ферментами рестрикции Clal и PVU II с использованием стандартных процедур. Фрагмент (2,2 kb), содержащий кДНК ИЛ-2, изолируют и подвергают очистке с помощью электрофореза на агаровом геле, в результате чего получают 3 мкг ДНК. С другой стороны, 20 мкг вектора pTUBIP-5 рассекают аналогичным образом с помощью Clal и PVU III и больший фрагмент (3,4 kb).

содержащий ген стойкости к ампициллину, изолируют и подвергают очистке с помощью электрофореза на агаровом геле, чтобы извлечь 3,5 мкг ДНК.

Затем полученные таким образом дв фрагмента, один из которых (3,4 kb) содержит промотор tufB, а другой (2,2 kb) - кДНК ИЛ-2, подвергают ли- гации, которую осуществляют следующим образом. Фрагмент, содержащий кДНК ИЛ-2 (1,2 мкг) и 0,3 мкг фрагмента, содержащего промотор tufB, смешивают с 0,8 ед. ДНК-лиг азы Т4 в 66 ммоль трис-HCl (рН 7,5) при содержании 6,6 ммоль MgCl4, 1 ммоль АТФ и 10 ммоль ДТТ, и смеси дают возможность взаимодействовать при 4°С в течение ночи. Эту плазмиду после лигации используют для трансформации кишечной палочки. Е. со 11 HBIOI в соответствии со стандартными процедурами. Среди трансформированных клеток, образующихся на агаровой пластинке с Л-бульоном, содержащим ампициллин, отбирают восемь колоний, содержащих порцию кДНК ИЛ-2 такую, как pTUIo62-22 и получают ДНК плазмиды. Клетки Е. coli HBIOI, содержащие pTUIo62-22, культивируют в Л-бульоне (100 мл) при 37°С. Когда оптическая плотность в области 650 нм достигает примерно 0,5-1,0 бактер - альные клетки собирают, промывают 20 ммоль трис-HCl (рН 7,5; 30 ммоль NaCl) и вновь суспендируют в 2 мл того же буфера. Полученные таким образом протеины экстрагируют. Активность экстрагированного ИЛ-2 изменяется в области 6000 - 56000 ед/мл.

Пример 7. Плазмиду pGI 2-22, несущую кДНК ИЛ-2, строят из pGoftOI и .

Плазмиду pGoilOI (20 мкг), содержащую промотор lac, рассекают ферментом сечения PVU II стандартным методом, чтобы получить 17 мкг ДНК путем последовательной обработки фенолом, хлороформом и осаждения этанолом. С другой стороны, рТ1оЈ 2-22 (75 мкг) рассекают с помощью Clal и Sail с тем, чтобы извлечь 2,2 мкг фрагмента ДНК, содержащего кДНК ИЛ-2 с помощью электрофореза на агаровом геле. Этот фрагмент снабжают наплывом путем обработки ДНК-полимеразой I (фрагмент Кленова), затем полученные таким образом два фрагмента (0,25 мкг и 0,66 мкг) подвергают лигации с 1,0 ед. ДНК-лигазы Т4. Полученную таким образом после лигации плазмиду затем используют для трансформации клеток Е. coli HBIOI no стандартной методике.

Среди трансформированных клеток отбирают клетки, содержащие вставку фрагмента Clal - Sail, включающего

кДНК ИЛ-2. Эти трансформированные клетки затем культивируют в Х-бульо- не (10 мл), содержащем 26 мкг/мл ампициллина, получают ДНК-плазмиды. ДНК-плазмиду, содержащую последова5 тельность АТС инициирования кДНК ИЛ-2 в направлении вниз сразу же после промотора lac, получают путем рассечения с использованием ферментов Pst I и Xbal.

0 Полученную таким образом плазмиду pGI бЈ 2-22 помещают в 1 00 мл Л-бульо- на, содержащего 25 мкг/мл ампициллина и 25 мкг/мл стрептомицина, и затем культивируют. Когда оптическая плот5 кость в области 650 нм достигает примерно 0,5, добавляют изопропил-p-D- -тиогалактопиранозид (ИПТГ) концентрации 1 мМ, а спустя 1 ч бактериальные клетки собирают. Активность экст0 рагированного ИЛ-2 изменяется в области 6000 - 80000 ед./мл.

Пример 8. Плаэмиду pTr S-3 (10 мкг) сначала рассекают ферментом расщепления Sail и сайт Sail снабжа5 ют наплывом путем обработки ДНК- полимеразой (фрагмент Кленова) или ДНК-полимеразой Т4. После рассечения ферментом Clal больший фрагмент, содержащий область промотора trp, изо-

0 лируют с помощью электрофореза на агаровом геле с использованием стандартных методов, в результате чего получают 3 мкг ДНК.

11 мкг кДНК-вставки, полученной

5 в результате сечения ферментом Pst I плазмиды р об2-50 А, рассекают с помощью Hgi AI, обрабатывают ДНК-полимеразой Т4 и больший фрагмент изолируют и подвергают очистке с помощью

0 электрофореза на агаровом геле. Таким образом, фрагмент кДНК, содержащий информацию о 132 аминокислотах ИЛ-2, получают в количестве 7,2 мкг. Затем 0,45 мкг фрагмента, содержаще5 го промотор trp, 0,5 мкг фрагмента HgiAI-Pst I, содержащего кДНК ИЛ-2 и синтетические олигонуклеотиды (5)CG АТАА G CTATGG СА(З ) и (3) ТАТТС G ATACCGT(5 ) каждого по 20 на 1 моль,

каждый из которых фосформирован в 5 -терминале, подвергают лигации с 1 ед. ДНК-лигазы ТА.

Полученную таким образом после лигации плазмиду затем используют для трансформации клеток Е. coli HBIOI. Среди образующихся трансформированных клеток искомые трансформированные клетки отбирают следующим 10 образом.

Сначала отбирают в качестве кандидатов- трансформированные клетки, способные к гибридизации как с кДНК ИЛ-2,так и с синтетическими олигонук- 15 леотидами (эту процедуру осуществляют с использованием метода гибридизации колонии). Затем с помощью сечения ферментами Pst I, Xbal отбирают трансформированные клетки, содержащие20 вставку фрагмента ДНК, начинающегося с ССТ-последовательности в позиции с III по 113 ССТАСТ - в направлении вниз сразу же после AT GG СА-последователь нос ти.25

Трансформированные клетки после селекции культивируют П-бульоне, при этом высокую активность ИЛ-2 устанавивают в экстрактах клеток.

Результаты исследований приведе- 30 ны в табл. 2 и 3.

Клетки-хозяева Е. coli 1776 и BIOI, которые использовались, полуены из сданных на хранение трансфорированных клеток с помощью культиви- 35 ования трансформированных клеток в

Л-бульоне при 37еС, чтобы получить со соответствующие рекомбинантные ДНК в трансформированных клетках, и отделения штаммов, которые становятся чувствительными к тетрациклину и ампициллину, в качеств клеток-хозяев.

Формула изобретения

Способ получения интерленкина-2 человека, предусматривающий культивирование клеток в среде с последующим выделением и очисткой полученного г продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода интерлейнина-2, штамм бактериальных клеток Escherichia coli трансформируют рекомбинантной плазмидной ДНК рТ1ос2-22 или pTUI oU-22, или pGIot 2-22, или pTIoi,2-21a, или pTIoi.2-21b, содержащей вставку, кодирующую интер- лейкин-2.

Таблица I

Изобретение относится к области генетической инженерии и касается способа получения интерлейкина - 2 человека в клетках бактерий ESCHERICHIA COLI. Целью изобретения является повышение выхода интерлейкина - 2. Повышение выхода белка в клетках ESCHERICHIA COLI обеспечивается за счет того, что конструируют рекомбинантные плазмидные ДНК PTJΑ 2-22, PTU-JΑ 2-22, PGJΑ 2-22, PTJΑ 2-21а, PTJΑ 2-21в, кодирующие синтез интерлейкина -2, полученными плазмидами трасформируют бактериальные клетки E.COLI. 3 табл.

Таблица 2

19

Составитель Н. Кузенкова Редактор р. Петраш Техред Л.СердюковаКорректор С.Шекмар

Заказ 2378/58

Тираж 501

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат Патент, г.Ужгород, ул. Гагарина,101

1479005

20 Таблица

Подписное