СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФАКТОРА, СТИМУЛИРУЮЩЕГО ОБРАЗОВАНИЕ КОЛОНИЙ ГРАНУЛОЦИТОВ Российский патент 1996 года по МПК C12N15/27 

Изобретение относится к способу получения полипептида или гликопротеина, обладающих активностью фактора стимулирования образования колоний гранулоцитов G-CSF с использованием технологии рекомбинантных молекул ДНК.

Биологическим действием G-СSF, является их способность вызывать дифференциацию лейкемических клеток костного мозга и усиливать функции зрелых гранулоцитов, вследствие чего их использование в области лечения и предотвращения лейкемии является многообещающим. Предприняты попытки изолировать и очистить G-СSF из надосадочной жидкости клеточной культуры, но гомогенный G-СSF не был получен в больших количествах, поскольку продуцируется в низкой концентрации и после процедуры очистки получается в "следовых" количества из большого объема культуральной жидкости.

На фиг.1 представлены последовательности различных зондов, IWQ, А и LC; на фиг.2 нуклеотидная последовательность вставки pHCS-1; на фиг. 3-5 нуклеотидная последовательность вставки КДНК в pBRG4; на фиг.6 аминокислотная последовательность предшественника человеческого Г-КСФ, выведенная на рBRG4 КДНК; на фиг.7 аминокислотная последовательность человеческого Г-КСФ, выведенная из рBRG4 КДНК; на фиг. 8-10 нуклеотидная последовательность вставки КДНК в рBRV2; на фиг.11 аминокислотная последовательность предшественника человеческого Г-КСФ, выведенная из pBRV2 КДНК, на фиг.12 аминокислотная последовательность человеческого Г-КСФ, выведенная из pBRV2 КДНК; на фиг.13-17 нуклеотидная последовательность человеческого хромосомного гена, кодирующего Г-КСФ; на фиг.18 сайты расщепления растриктазой pBRG4 или PBRV2 КДНК человеческого Г-КСФ; на фиг. 19 сайты расщепления растриктазой человеческого хромосомного гена, кодирующего Г-КСФ; на фиг.20 частично способ получения tac-промотор-содержащего вектора (+ VSЕ линия); на фиг.21-22 способ получения P_L-промотор-содержащего вектора (+VSE линия); на фиг.23 cпособ получения t_rp промотор-содержащего вектора (+VSE линия); на фиг.24 частично способ получения tac-промотор-содержащего вектора (VSE линия); на фиг. 25-26 способ получения P_L-промоторсодержащего вектора (-VSЕ линия), на фиг.27 способ получения t_rp промотор-содержащего вектора (-VSЕ линия); на фиг.28 cхематически структура рНGA410; на фиг.29 способы конструирования рекомбинантных векторов экспрессии рТN-G4, pТN-G4VAα и рТN-G4VA β на фиг.30-31 два способа конструирования рН GG4-dhfr; на фиг.32 способы конструирования pG4DR1 и pGDR2; на фиг.33 схематически структура рН GV2; на фиг.34 способы конструирования рекомбинантных векторов экспрессии рТN-V2, рТN-VAα и рТN-VAβ на фиг. 35-36 два способа конструирования рекомбинантного вектора экспрессии рНGV2-dhfr; на фиг. 37 cпособы конструирования рV2DR1 и pV2DR 2; на фиг.38 схематически структура pML СЕЗ α; на фиг.39 схематически структура pТN CEЗ α; на фиг.40 cхематически по структуры pD26SVCEЗα и pDRCEЗ α.

Ген, кодирующий полипептид, обладающий активностью человеческого Г-КСФ (G-CSF), представляет собой ДНК (КДНК), которая является комплементарной и информационной РНК (ИРНК), которую получают в виде фракций 15-17S путем ценрифугирования в градиенте плотности сахарозы и которая кодируют полипептид, обладающий активностью человеческого Г-КСФ.

Получили две линии КДНК.

КДНК одной линии содержит полную последовательность или часть гена, кодирующего полипептид I или II (фиг.6 и 7). Более конкретно, эта КДНК имеет нуклеотидную последовательность, идущую от АТГ в нуклеотидных положениях 32-34, отсчитываемых от 5'-конца (фиг.3-5), до ЦЦЦ в положениях нуклеотидов 650-652, либо от АЦЦ в положениях 122-124 до ЦЦЦ в положениях 650-652. Альтернативно КДНК имеет нуклеотидную последовательность или ее часть, КДНК этой линии здесь ниже называют КДНК (+VSЕ).

КДНК другой линии имеет весь или часть гена, кодирующего полипептид I или II, показанный на фиг. 6-7. Более конкретно, эта КДНК имеет нуклеотидную последовательность, идущую от АТГ в нуклеотидных положениях 31-33, отсчитываемых от 5' конца [см.фиг. 8-10] до ЦЦЦ и нуклеотидных положениях 640-642, либо от АЦЦ в положениях 121-123 до ЦЦЦ в положениях 640-642. Альтернативно КДНК может иметь нуклеотидную последовательность, показанную на фиг. 8-10, или ее часть КДНК этой линии здесь ниже называют КДНК (-VSЕ).

Описанный выше ген можно получить следующими способами: сначала получают ИРНК, кодирующую Г-КСФ, из клеток млекопитающего животного или из других клеток хозяина, обладающих способностью продуцировать полипептид, имеющий активность Г-КСФ, затем ИРНК превращают в двухнитиевую КДНК любым известным способом; полученную библиотекой КДНК затем подвергают направленному отбору известными способами.

Ген по настоящему изобретению также включает человеческий хромосомный ген, кодирующий полипептид, обладающий активностью Г-КСФ. Этот ген содержит всю или часть нуклеотидной последовательности, показанной на фиг. 13-17.

Человеческий хромосомный ген можно получить из любого типа человеческих клеток, таких, как клетки, экстрагированные из печени или из почек, либо из малигнизированных клеток. Библиотеку человеческого хромосомного гена можно получить из человеческих клеток любым из известных способов [см. Maniatis et all, Cell, 15, 687(1978); and Manidtis et al. Molecular Cloning, Сold Spring Harbor Laboratory, р. 269, ff. (1982)] который проиллюстрирован ниже:
экстрагируют человеческую хромосомную ДНК из таких источников, как печень эмбриона человека, фенолом или другими подходящими реактивами, частично или полностью переваривают экстрагированную ДНК подходящей рестриктазой, чтобы получить фрагмент ДНК подходящей длины, вставляют фрагмент ДНК в векторный фрагмент ДНК λ -фага с помощью Т4 ДНК-лигазы или других подходящих лигаз, при необязательном присоединении линкера, содержащего ограничительный сайт для подходящего фермента, такого, как ЕсоRI, затем получают частицы λ -фага способом укладки in vitro и трансформируют клетки хозяина, такого, как Е.coli, c помощью полученных частиц λ -фага.

Примеры λ -фага, который можно использовать в качестве вектора в указанных способах, включают Charon 4А и ЕMBL-3 и ЕMBL-4.

Клетка млекопитающего, которую можно использовать в качестве источника ИРНК, представляет собой штамм клеток, например выведенный из клеток рака ротовой полости человека, СНU-2 депонированный в Национальной коллекции культур микроорганизмов или C.N.С.M. под инвентарным номером I-483). Получение и РНК можно осуществить одним из способов, которые уже были предложены для клонирования генов ряда других физиологически активных протеинов: например, всю РНК получают сначала путем обработок поверхностно-активным веществом и фенолом в присутствии рибонуклеозного ингибитора такого, как комплекс ванадила рибонуклеозида [см. Berger аnd Birkenmeier, Biochemistry, 18- 5143(1979)] или центрифугированием в градиенте плотности CsCl с последующей обработкой гуанидинтиоцианатом [см. Chirgwin et al. Biochemistry, 18,5294(1979)] затем получают поли(A⁺) РНК(ИРНК), подвергая всю РНК периодической адсорбционной или аффинной хроматографии на колонке олиго (dТ) целлюлозы или на поли-U-cефарозе, при использовании сефарозы 2В в качестве носителя. Поли(А⁺) РНК можно далее фракционировать подходящим способом, таким, как центрифугирование в градиенте плотности сахарозы. Способность полученной таким образом иРНК кодировать полипептид, обладающий активностью Г-КСФ, можно подтвердить с помощью ряда способов: например, ИРНК транслируют в протеин и проверяют его физиологические активности, альтернативно, определяют подлинность этого протеина с помощью антитела анти-Г-КСФ. Более конкретно, иРНК вводят в овоциты Хenopus Laevis для осуществления трансляции [см. Gurdon et al. Nature, 233, 177(1972)] либо можно провести трансляционные реакции с ретикулоцитами кролика или с зародышами пшеницы [Schleif and Wensink, "Practical Methods in Molecular Biology". Springer-Verlag, NY (1981)] Активность Г-КСФ можно попытать, применяя, применяя способ культивирования на мягком агаре с использованием клеток костного мозга, и методика проведения этого способа уже описана [Metcalf, "Hemopoietic Colonies", Springer-Verlag, Berlin, Неidelberg, NY 1977)]
Однонитевую КДНК синтезируют с помощью полученной таким образом иРНК, которую используют в качестве матрицы, затем из этой однонитевой КДНК синтезируют двухнитевую КДНК и двухнитевую КДНК вставляют в подходящий вектор ДНК, чтобы получить рекомбинантную плазмиду. Эту рекомбинантную плазмиду можно использовать для трансформации подходящего хозяина, скажем Еscherichia coli, с тем, чтобы получить библиотеку КДНК.

Двухнитевую КДНК получить из иРНК одним из следующих двух способов: иРНК обрабатывают обратной транскриптазой с олиго(dТ), который является комплементарным к поли-(А)-цепи на 3' -конце, используемом в качестве затравки, либо синтезируют олигонуклеотид, который соответствует части аминокислотной последовательности протеина Г-КСФ, и синтезируют КДНК, которая является комплементарной к ИРНК, путем обработки обратной скриптазой, причем используют в качестве затравки синтезированный олигонуклеотид. Двухнитевую КДНК можно также получить следующими способами: иРНК разлагают и удаляют путем обработки щелочью, и полученную однонитевую КДНК обрабатывают сначала реверстранскриптазой или ДНК-полимеразой I (например, фрагментном Кленоу(Klenow), затем S1 нуклеазой, альтернативно ИРНК можно непосредственно обработать РН-азой Н и ДНК-полимеразой (например, Е. сoli полимеразой I). Для более подробной информации см. Maniatis et al. "Molecular Clonig", Сold Spring Harbor Laboramory (1982); и Gubler and Нoffman, Gene, 25, 263 (1983).

Полученную таким образом двухнитевую КДНК вставляют в подходящий вектор, в такой, как например, один из плазмидных векторов ЕК-типа, типичными представителями которого являются pS CIOI, рDF 41, Сol Е1, рMB9, pBR322, pBR327 и рАСYC1, либо один из фаговых векторов, типичными примерами которых являются λgt, λc, λgt 10 и λgtWЕS, а после этого рекомбинантный вектор используют для трансформации штамма Е.coli (например, Х1776, НB101, ДН1 или С600) с тем, чтобы получить библиотеку сДНК (см.например, "Molecular Cloning", выше).

Двухнитевую КДНК можно присоединить к вектору следующими способами: конец КДНК снабжают присоединяемым концом путем прикрепления подходящего синтезированного химическим способом фрагмента ДНК, и вектор ДНК, который был отщеплен рестриктазой, присоединяют к указанной КДНК посредством обработки ДНК-лигазы фаза Т4 в присутствии АТФ. Альтернативно прикрепляют звенья dC, dG (или dТ, dА-звенья) соответственно двухнитевой сДНК и к вектору ДНК, который расщепляют рестриктазой, и подвергают ренетурации раствор, содержащий оба вида ДНК (см.выше "Molecular Cloning").

Клетку хозяина можно трансформировать полученной таким образом рекомбинантной ДНК любым из известных способов. Если клеткой хозяином является Е.Coli, то можно использовать способ, разработанный Нanahan [J. Mol. Biol. 166, 557(1983)] где рекомбинантную ДНК добавляют к компетентной клетке, полученной в присутствии CaCl₂, MgCl₂ или RbCl.

Направленный отбор клеток, несущих нужный ген, можно осуществить с помощью ряда способов, которые включают: плюс-минус способ, используемый при клонировании КДНК интерферона [Тaniguchi et al. Proc. Jpn. Асаd. 55, сер. В. 464 (1979)] способ анализа гибридизации трансляции [Nagata et al. Nature, 284, 316(1980)] и способ гибридизации колонии или пятна с использованием олигонуклеотидного зонда, синтезированного химическим образом на основе аминокислотной последовательности белка, обладающего активностью человеческого Г-КСФ [Wallace et al. Nucleic Acids Res. 9, 879(1981); и Benton Davis, Science, 196, 180(1977).

Фрагмент, включающий клонируемый таким образом ген, кодирующий полипептид, обладающий активностью человеческого Г-КСФ, встраивали в подходящий вектор ДНК с целью трансформации других прокариотических или эукариотических клеток хозяина (Proc. Natl. Acad. Sei, USA82, July 1985, рр 4360-4364) (прототип).

Е. сoli можно трансформировать рBR 322, которая представляет собой вектор, способный к репликации в Е. соli [см. Bolivar, Gene, 2, 95 (1975)] Этот вектор содержит гены, резистентные как к ампициллину, так и к тетрациклину, и любое из свойств можно использовать для идентификации трансформированных клеток. Примеры промотора, который нужен для генетической экспрессии в прокариотных хозяевах, включают промотор β -лактамазного гена [Сhang et al. Nature, 275, 615 (1978)] лактозный промотор [см. Goeddel et al. Nature 281, стр. 544(1979)] и триптофанный промотор [см. Goeddel et al. Nucleic Acid Res. 8, 4057 (1980)] и т.д.

Любой из этих промоторов можно использовать при получении полипептида, обладающего активностью человеческого Г-КСФ, по настоящему изобретению.

Эукариотический микроорганизм, такой как Saccharomусеs сerevisiae, можно трансформировать вектором, таким как плазмида YRp7 [см. Stinchcomb et al. Nature, 282, 39, (1979)] Эта плазмида имеет ген ТКP1 в качестве селекционного маркера для дрожжевых штаммов, лишенных способности продуцировать триптофан, поэтому трансформанты можно отобрать путем выращивания в отсутствии триптофана. Примеры промотора, который можно использовать для экспрессии гена, включают кислый фосфатазный промотор гена [Miyanohara et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80,1 (1983)] и алкокгольдегидрогеназный промотор гена [Valenzuela et al. Nature, 298, 347 (1982)]
Для трансформации клеток млекопитающих, таких как клетки СOS, клетки яичника китайского хомяка (СНО), клетки С-127 и клетки Hela можно использовать, например pSV2-gpt [см. Milligan and Berg; Proc. Natl. Асаd. Sci. USA, 78, 2072(1981)] Векторы, используемые для трансформации этих клеток, содержат сайт инициации, селективный маркер, промотор, положение которого предшествует положение экспрессуемого гена, сигнал полиаденилирования и т.д. Для экспрессии гена в клетках млекопитающих можно использовать промоторы ретровируса, вируса полиомы, аденовируса, обезьяньего вируса 40 (SV 40) и т.д. Если используют промотор SV 40, то нужную экспрессию гена можно легко осуществить по способу Маллигана с сотр. (Mulligan et al. описанному в Nature, 277,108(1979).

Сайты инициацини, которые можно использовать, получают из SV 40, полиомного вируса, аденовируса, вируса бычьей папилломы (BPV) и т.д. Используемые селективные маркеры включают ген фосфортрансферазы (АРН (3') II или I, ген тимидинкиназы, ген Е.coli хanthine гуанинфосфорибозилтрансферазы (Ecogpt), ген дигидрофолатредуктазы (DHFR) и т.д.

Эукаристические гены обычно проявляют полиморфизм, как это известно для гена человеческого интерферона [см. Nishi et al. J. Biochem. 97,153 (1985)] при этом либо изменение в нуклеотидной последовательности не приводит к какому-либо изменению в аминокислотной последовательности, либо изменения в аминокислотной последовательности не затрагивают функциональную активность белка.

Активностью Г-ГКС также может обладать полипептид с делецией, добавлением или замещением одной или более аминокислот в последовательности, показанной на фиг.6, 7 и 11 и 19.

Ниже описан способ получения фактора в соответствии с изобретением.

(I) Получение зонда.

Гомогенный протеин человеческого КСФ получали очисткой из поверхностного слоя культуры опухолевых клеток линии CНU-2 и определили ее аминокислотную последовательность от N-типа. Фрагменты получили путем разложения бромоцианом и обработкой трипсином, и аминокислотные последовательности этих фрагментов также были определены [пример 3(I), (II) и (III)]
На основании определенных аминокислотных последовательностей были синтезированы три нуклеотидных зонда (А), (LC) и (IWQ), имеющие последовательности, показанные на фиг.1 (пример 4). Зонд (А) был смешанного типа и состоял из 14 последовательных нуклеотидов. Зонд (IWQ) состоял из 30 последовательных нуклеотидов с деоксиинозином и представлял собой зонд такого типа, который используют при клонировании человеческого холецистокининового гена [Таkahashi et al. Proc. Natl. Асаd. Sci. USA 82, 1931 (1985)] Зонд (LC) представлял собой 24-нулеотидный зонд, который был синтезирован из нуклеотидов в 32-39 положениях от N-конца аминокислотной последовательности, показанной в примере 3(I), на основе нуклеотидной последовательности, показанной на фиг.3-5.

Химический синтез нуклеотидов можно осуществить путем применения усовершенствованного фосфотриэфирнго способа к твердофазному методу, и это было рассмотрено Hapaнгом (Narang) [Tetrahedron, 39,3-22(1983)]
Можно также использовать зонды на основе аминокислотных последовательностей, в положениях, которые отличны от используемых в вышеупомянутых зондах.

(2) Построение библиотеки КДНК.

Клетки СНU-2 были гомогенизированы после добавления гуанидинтиоцианатного раствора, и всю РНК получили центрифугированием в градиенте плотности, CsCl.

Поли (А⁺) РНК выделили из всей РНК с помощью колоночной хроматографии на олиго (dТ)-целлюлозе. После этого, синтезировали однонитевую КДНК с помощью реверстранскриптазы, и добавили рибонуклеазу Н и Е. cоli ДНК-полимеразу I, чтобы получить двухнитевую сДНК. Цепь dC присоединили к полученной двухнитевй сДНК, которую присоединили к вектору рВ R 322, к которой прикрепили цепь dG в сайте отщепления Pst-I; полученную рекомбинантную ДНК использовали для трансформации штампа Е.cоli Х1776, и построили библиотеку кДНК рВ R 322-линии (примеры 5 и 6).

Аналогичным способом двухнитевую КДНК присоединили к вектору λgt 10 с помощью линкера Есo RI и построили библиотеку КДНК линии λ -фага (пример 7).

(3) Направленный отбор.

Клоны библиотеки кДНК рВ R322-линии, фиксировали на фильтровальной бумаге Ватман S41, и путем гибридизации колоний с зондом (IWQ) меченным 32, можно было отобрать единственный клон. Последующее исследование методом пятен по Саузерну [Southern. J. Mol. Biol. 98,503(1975)] показало, что этот клон также гибридизуется с зондом (А). Нуклеотидную последовательность этого клона определили дидезоксиметодом [Sanger, Science, 214, 1205 (1981)]
Нуклеотидная последовательность полученной вставки КДНК показана на фиг. 2, где можно видеть, что эта вставка состоит из 308 пар оснований, включая зонды (IWQ) и (А), и имеет открытую рамку считывания, кодирующую 83 аминокислоты, последовательность которых показанав примере 3 (III) pB R 322-производное, содержащее эти 308 пар оснований pHCS-1 (пример 8).

Фрагмент ДНК, содержащий 308 пар оснований полученный из рНСs-I, пометили радиоактивной меткой по способу меченной трансляции (см. там же Molecular Cloning), и, используя этот фрагмент в качестве зонда, осуществили направленный отбор λgt 10 библиотеки КДНК с помощью гибридизации пятен [Benton and Davis, Science, 196, 180(1977)] чтобы получить пять клонов. С помощью того же способа, который описан выше, определяли нуклеотидную последовательность клона, который, как считали, содержит КДНК [фиг. 3-5]
Эта вставка КДНК имела единственную большую открытую рамку считывания.

Как показано на фиг. 3-5, можно вывести аминокислотную последовательность, кодируемую этой кДНК.

Сравнение с N-концевой аминокислотной последовательностью Г-КСФ протеина, приведенной в примере 3(1), обнаружил, что эта кДНК содержала нуклеотидную последовательность, которая соответствовала как сигнальному пептиду, кодируемому 90 пар оснований, начиная с последовательности АТГ в нуклеотидных положениях 32-34 от 5'-конца и кончая последовательностью ГЦЦ в положениях 119-121, так и полному Г-КСФ полипептиду, кодируемому 531 парами оснований, начиная с последовательности АЦЦ в положениях 122-124 и кончая последовательностью ЦЦЦ в положениях 650-652. Поэтому полипептид с аминокислотной последовательностью l, приведенной на фиг. 6-7, cостоял из 207 аминокислот, а рассчитанным молекулярным весом 22292, 67D. Полипептид с аминокислотной последовательностью II состоял из 177 аминокислот, его молекулярная масса была рассчитана в размере 18986, 74 D (пример 9).

Следует отметить, что АТГ в положениях 32-34 или в положениях 68-70 можно также считать сайтом инициации протеина.

Штамм Х1776 Escherichia coli, содержащей pB R 322, который имел эту КДНК (+VSE) в сайте ЕсoRI был отдан на хранение в Институт исследования ферментации бюро промышленных наук и технологии (Fermentation Research Institute, the Agencу оf Industrial Science and Technology (FERM ВР-954).

На фиг.18 показаны сайты рестрикции данной ДНК.

Эту КДНК лигировали с рB R327 Соберон с сотр. [Soberon et al. Gene, 9,287(1980)] в сайте ЕсоRI и полученную плазмиду называют здесь ниже pBRG4.

Полученную таким образом pBRG4 обработали рестриктазой ЕсоRI, чтобы получить фрагмент ДНК, содержащий КДНК, длиной примерно 1500 пар оснований. Этот фрагмент пометили радиактивной меткой способом меченой трансляции (см. там же Molecular Cloning) и, используя в качестве зонда этот фрагмент ДНК, меченный радиоактивной меткой, еще раз провели направленный отбор библиотеки λgt 10 КДНК клонов с помощью гибридизации пятна (см. Benton and Davis).

В этом способе гибридизации пятна приготавливают два листа нитроцеллюлозной фильтровальной бумаги со связанной ДНК λ -фага, один из этих листов используют для вышеуказанной гибридизации пятна, а другой подвергают гибридизации пятна с уже описанным зондом (LC). Отобрали фаги, которые оказались положительными для обоих зондов. Отобрали клон, который имел "полномерную" кДНК, и нуклеотидная последовательность вставки кДНК, определенная дидезокси-способом, показана на фиг. 8-10.

Эта кДНК имели единственную большую открытую рамку считывания, была определена аминокислотная последовательность, которую можно кодировать эта кДНК, показанная на фиг. 8-10.

Сравнение с N-концевой аминокислотной последовательностью Г-КСФ протеина, показанной в примере 3(1), открыло, что эта КДНК содержала нуклеотидную последовательность, которая соответствовала как сигнальному пептиду, кодируемому с помощью 90 пар оснований, начиная с последовательности АТГ в положениях нуклеотидов 31-33 от 5'-конца и кончая последовательностью ГЦЦ в положениях 118-120, так и законченному Г-КСФ полипептиду, кодируемому с помощью 522 пар оснований, начиная с последовательности АЦЦ в положениях 121-123 и кончая последовательностью ЦЦЦ в положениях 640-642. Поэтому полипептид с аминокислотной последовательностью l, показанной на фиг. 11 и 12, состоял из 204 аминокислот, и было рассчитано, что его молекулярный вес составлял 21977,35 дальтонов. Полипептид с аминокислотной последовательностью ll состоял из 174 аминокислот, было рассчитано, что его молекулярный вес составлял 18671,42 дальтонов (пример 10).

Следует отметить, что АТГ в положениях 58-60 или в положениях 67-69 также можно рассматривать как сайт инициации протеина.

Штамм Х1776 Еsherichia coli, несущий pBR322, которая имела эту КДНК (-VSЕ) в сайте ЕсоRI был отдан на хранение в Институт исследования ферментации бюро промышленных наук и технологии (Fermentation Research Institute, the Agency of Iнdustrial Science and Technology (FERM BP-955).

На фиг.18 показаны сайты рестрикции данной ДНК.

Эту КДНК лигировали с pBR327 в сайте ЕсoRI, чтобы получить плазмиду, которую здесь ниже называют плазмидой pBRV 2.

(4) Направленный отбор библиотеки человеческого хромосомного гена.

Библиотеку человеческого хромосомного гена, полученную в соответствии со способами, описанными Манятисом и сорт. (Maniatis et al. Molecular Cloning, там же), подвергали направленному отбору с указанной выше рНСS-I. Зонды, которые можно использовать при направленном отборе, включали: pHCS-I фрагмент ДНК длиной 308 пар оснований, pBRG4 фрагмент ДНК длиной примерно 1500 пар оснований pBRV 2 фрагмент ДНК длиной примерно 1500 пар оснований, фрагмент ДНК подходящей длины, содержащий часть одного или нескольких из этих фрагментов ДНК, а также вышеуказанные олигонуклеотидные зонды [т.е. (IWQ), (А) и (IC). Здесь ниже описан случай использования фрагмента ДНК pHCS-I.

Этот фрагмент ДНК пометили радиоактивной меткой ³²P в соответствии с методом меченой трансляции [см. Roop et al. Сеll, 15, 431 (1978)] Используя в качестве зонда полученный ³²Р меченый фрагмент, библиотеку человеческого хромосомного гена подвергли направленному отбору с помощью гибридизации пятен (см. там же Benton and Davis) c тем, чтобы получить десять с лишним клонов.

После выделения ДНК из клонов с помощью известных способов получили карту рестрикции [Fritsch et al. Сеll, 19, 959 (1980)]
Используя тот же зонд ДНК, осуществляли гибридизацию по Саузерну (см. там же Southern), было найдено, что фрагмент ДНК длиной примерно 4 тысячи оснований, вырезаемый с помощью ЕсoRI и ХhoI, может потенциально содержать участок, кодирующий человеческий полипептид Г-КСФ. Поэтому, фрагмент ДНК примерно 4 тысячи оснований вставили в рBR327 и сайт ЕcoRI, используя линкер ЕcoRI, с тем, чтобы получить pBRCE3 β. Используя эту плазмиду в качестве ДНК с определенной последовательностью оснований, определяли дидезокси-способом нуклеотидную последовательность участка примерно 3 тысячи оснований этого фрагмента ДНК длиной примерно 4 тысячи оснований. В результате было найдено, что указанный фрагмент ДНК является геном, кодирующим полипептид человеческого Г-КСФ (рис.5).

Штамм Х1776 Е.coli, несущий pBRCЕ3β (т.е. плазмида pBR327, имеющую указанный фрагмент ДНК примерно 4 тысячи оснований, вставленный в сайт ЕсoRI) был отдан на хранение в Институт Исследования Ферментации Бюро промышленных наук и технологии (Fermentation Research Institute, the Аgency of Industrial Science and Тесhnolohgy (FE RM ВР-956).

Сравнение вставки pBRG4 кДНК, показанной на фиг.3-5, и вставки pB RV2 кДНК, показанной на фиг.8-12, показано, что обсуждаемый фрагмент ДНК содержал пять экзонных частей, и он кодировал аминокислотные последовательности, выведенные из pB RG4 и pB RV 2.

На фиг.19 показаны сайты рестрикции полученного гена.

Этот фрагмент ДНК содержал хромосомный ген человеческого Г-КСФ, либо предшествующий участок, транскрибируемый в иРНК человеческого Г-КСФ, вместе с нуклеотидной последовательностью, принимающей участие в управлении транскрипцией [Benoist and Chambon, Nature, 290, 304 (1981), и Breathnack and Chambon, Ann. Rev. Biochem. 50, 349 (1981)]
(5) Построение рекомбинантного вектора для экспрессии в Е.coli.

А/ Рекомбинантный вектор линии +VSЕ.

Из плазмиды pB RG4, полученной в (3) (пример 9), вырезали фрагмент кДНК полипептида Г-КСФ с помощью рестриктазы, и построили рекомбинантный вектор с помощью одного из следующих способов: (I) используя ренатурированный синтетический линкер, фрагмент связали с фрагментом, полученным из tac-промотор-содержащей рКК223-3 (Pharmacia Fine Chemicals) (пример 12 и рис.8);
(II) три фрагмента, полученные из PL-промотор-содержащей PL-ламбда (Pharmacia Fine Chemicals), связали с ренатурированным синтетическим линкером, и продукт связывания и фрагмент кДНК подвергли стадиям повторного получения, чтобы построить рекомбинантный вектор (пример 13, фиг. 21-22) или
(III) используя, ренатурированный синтетический линкер, фрагмент связали с фрагментом, полученными из t_rp-промотор-содержащей плазмиды pOYI (пример 14 и фиг.23),
(В) Рекомбинантный вектор линии-VSЕ.

Тем же способом, какой описан выше, построили три рекомбинантных вектора, используя плазмиду pBRV2 (пример 10), показанную в примере 19 и на фиг. 24, 25, 26, 27.

(6) Получение трансформантов Е.coli и их выращивание и экспрессия
Используя три рекомбинантных вектора каждой из линий +VSE и -VSЕ, штамм Е. coli DН1, N 4830 или JM 105 трансформировали при обработке хлоридом кальция или хлоридом рубидия, описанной в Molecular Cloning там же (примеры 12,13,14 и 19). Каждый из полученных трансформантов культивировали в среде Луриа (Luria), содержащей ампициллин, причем затем проводили индуцирование, как это нужно, чтобы осуществить экспрессию (примеры 15 и 20).

(7) Выделение и очистки полипептида Г-КСФ из Е.coli и его аминокислотный анализ.

Культуральный раствор трансформантов подвергали центрифугированию, чтобы получить клеточный осадок после центрифугирования. Собранные клетки обработали лизоцином и после лизиса посредством циклического замораживания и оттаивания получили поверхностный раствор. Альтернативно клетки обрабатывали хлоридом гуанидия, центрифугировали, и получали поверхностный раствор.

Поверхностный раствор подвергали гель-фильтрации на колонке Ultrogel АСА54 (LKB), и активные фракции были сконцентрированы с помощью ультрафильтрационного устройства.

Затем водный раствор трифторуксусной кислоты, содержащий н-пропанол, добавляли к концентрату, и после выдерживания во льду, смесь отцентрифугировали и абсорбировали на колонке с обращенной фазой С18. После элюирования проверили фракции на их активность. Активные фракции собрали и подвергали тем же способам очистки, какие описаны выше. Очищенные фракции были высушены вымораживанием, и порошок растворили и подвергли высоко разрешающей жидкостной хроматографии с разделением по размерам. Полученные полипептиды подвергали SDS-полиакриламидному гельэлектрофорезу, и единственная полоса подтверждала наличие нужного полипептида (Г-КСФ) (примеры 16 и 20). Полученный таким образом полипептид проявлял активность человеческого полипептида Г-КСФ (примеры 17 и 20). Полипептид Г-КСФ анализировали методом аминокислотного анализа с помощью автоматического аминокислотного анализатора "Хитачи 835" (Hitachi, Ltd). Для анализа N-концевых аминокислот использовали газофазный определитель последовательности (для разложения по Эдману), хроматограф высокоэффективной жидкостной хрома- тографии и колонку Ultrasphere-ODS (примеры 18 и 21).

(8) Построение рекомбинантных векторов для клеток животных.

Рекомбинантные векторы (производные BPV) для использования в хозяйских клетках С 127 и N IН3ТЗ были построены для каждой КДНК линии +VSE и -VSЕ и для хромосомного гена. Рекомбинантные векторы (с dhar) для использования с клетками СНО также были построены для каждой КДНК линии +VSE и -VSЕ для хромосомного гена. Также были построены рекомбинантные векторы для использования в клетках СoS. Описаны показательные примеры, а для более подробного описания следует ссылаться на соответствующие рабочие примеры.

(А) Построение рекомбинантных векторов линии +VSЕ
Фрагмент кДНК (+VSЕ), полученный в (3), вставили в вектор pdKCR, чтобы получить плазмиду pНGA 410, (пример 22, фиг.28), которую частично переваривали с помощью Есо RI, а затем обрабатывали ДНК-полимеразой I (фрагмент Кленова), чтобы получить тупые концы. К ДНК прикрепили линкер Hind III, затем ее обработали Hind III, и Т4 ДНК лигазой, обработанную ДНК использовали для трансформации штамма ДНI Е. coli с применением хлорида рубидия (см. там же Molecular Cloning). Полученную плазмиду назвали рН GA 410 (Н) (фиг.29). рафии и колонку Ultrasphere-ODS (примеры 18 и 21).

(8) Построение рекомбинантных векторов для клеток животных.

Рекомбинантные векторы (производные BPV) для использования в хозяйских клетках С 127 и N IН3ТЗ были построены для каждой КДНК линии +VSE и -VSЕ и для хромосомного гена. Рекомбинантные векторы (с dhfr) для использования с клетками СНО также были построены для каждой КДНК линии +VSE и -VSЕ для хромосомного гена. Также были построены рекомбинантные векторы для использования в клетках СoS. Описаны показательные примеры, а для более подробного описания следует ссылаться на соответствующие рабочие примеры.

(А) Построение рекомбинантных векторов линии +VSЕ
Фрагмент кДНК (+VSЕ), полученный в (3), вставили в вектор pdKCR, чтобы получить плазмиду pНGA 410, (пример 22, фиг.28), которую частично переваривали с помощью Есо RI, а затем обрабатывали ДНК-полимеразой I (фрагмент Кленова), чтобы получить тупые концы. К ДНК прикрепили линкер Hind III, затем ее обработали Hind III, и Т4 ДНК лигазой, обработанную ДНК использовали для трансформации штамма ДНI Е. coli с применением хлорида рубидия (см. там же Molecular Cloning). Полученную плазмиду назвали рН GA 410 (Н) (фиг.29).

pН GA 410(Н) обработали SalI и после получения тупых концов ее обработали еще раз Hind III и выделили фрагмент Hind III Sal I. Плазмиду pdBPV-1, имеющую трансформированный фрагмент вируса бычьей папилломы, обработали Hind III и Pvu II, и выделили большой фрагмент ДНК и присоединили к отдельно приготовленному фрагменту Hind III Sal I. Соединенные фрагменты использовали для трансформации штамма DHI Е. соli, чтобы получить плазмиду pTN-G4, которая имела рН GA 410 выведенную СSF кДНК (фиг.29, пример 23) (CSF-КСФ, Прим. перев.).

Любую из плазмид, рН GA 410, или рН GA 410 (Н), в сочетании с плазмидой pAdD26SVpA использовали для построения рН GG4-dhfr, который представлял собой рекомбинантный вектор (+VSЕ для использования с клетками CHO (фиг. 30, 31, пример 26).

Фрагмент ДНК длиной 2 тыс. оснований, содержащий ген dhfr, выделили из pAdD26SVpA путем обработки с ЕсoRI и BamНI1 выделенный фрагмент вставили в рНGA 410(Н) в сайт Hind III c тем, чтобы построить pG4DR1 и pG4DR2 (фиг.32, пример 25).

(В) Конструирование рекомбинантных векторов линии-VSЕ.

Фрагмент КДНК (-VSЕ), полученный в (3), вставили в вектор pdKCR, чтобы получить плазмиду рН GV2 (пример 28), которую частично переваривали с Есо RI с последующей обработкой ДНК-полимеразой I (фрагмент Кленоу), чтобы получить тупые концы.

Линкер Hind III присоединили к ДНК, которую последовательно обработали Hind III и Т4 ДНК-лигазой. Обработанную ДНК использовали для трансформации штамма DH1 Е. сoli с применением хлорида рубидия (см. там же Melecular Cloning). Полученную плазмиду назвали рН GV2(Н) (фиг.34).

Плазмиду рН GV2 (Н) обработали Sal I после получения тупых концов, ее обработали ее раз Hind III и выделили фрагмент Hind III Sal I. Плазмиду pdBPV-1, имеющую трансформированный фрагмент вируса бычьей папилломы, обработали Hind III и Pvu II и отделили больший фрагмент ДНК и присоединили к отдельно приготовленному фрагменту Hind III Sal I.

Присоединенные фрагменты использовали для трансформации штамма DН1 Е.соli, чтобы получить плазмиду рTN V2, которая имела рН GV-2, выведенную КСФ-кДНК (фиг.34, пример 29).

Аналогичными способами либо плазмиду рН GV2, либо плазмиду рН GV2(Н), в сочетании с плазмидой рАdD 26SV pA использовали для построения рН GV2-dhfr, которая представляла собой рекомбинантный вектор (-VSЕ) для использования с клетками СНО (фиг.35, 36, пример 31).

Фрагмент ДНК примерно 2 тыс. оснований, содержащий ген dhfr, выделили из pAdD 26 SV pA обработкой с помощью ЕсoRI и BamН 1, и выделенный фрагмент вставили в рН GV2(Н), в сайт Hind III c тем, чтобы построить pV2DR1 и pV2DR2 (фиг.37, пример 31).

(С) Построение рекомбинантных векторов, содержащих хромосомный ген.

Плазмиду pBRCE3 β которую получили в (4) и которая содержала хромосомный ген, показанный на фиг. 13-17, обработали ЕсоRI. Плазмиду pSVН⁺K⁺, описанную Baner J1 et al. in Cell, 27, 299(1981), обработали Kpn I, чтобы удалить глобиновый ген. Затем плазмиду подвергали частичному перевариванию с Hind III c тем, чтобы удалить часть позднего гена SV40. Фрагменты повторно соединили, чтобы получить вектор экспрессии pML-Е⁺.

Этот вектор обработали рестриктазой, Есо RI и подвергали дефосфорилированию щелочной фосфатазой (Takara Shuzo Co. Ltd.), чтобы получить вектор ДНК, который был связан с вышеуказанным фрагментом хромосомной ДНК с помощью Т4 ДНК-лигазы (Takava Shuzo Co. Ltd.), чтобы получить pMLCЕЗ α, которая представляла собой рекомбинантный вектор для клеток СОS (пример 34). Как показано на фиг.31, эта плазмида содержала энхансер гена SV 40, начало репликации SV40, начало репликации pBR322 и β -лактамазный ген (Amp^r) pBR322 и человеческий Г-КСФ хромосомный ген, расположенный за энхансером SV 40.

Вектор экспрессии для клеток С127 построили следующими способами. Фрагмент ДНК, содержащий хромосомный ген КСФ, вырезали с помощью подходящей рестриктазы из pML CEЗα которая представляла собой вектор экспрессии для клеток СOS. Этот фрагмент присоединили с помощью Т4 ДНК лигазы к фрагменту присоединили с помощью Т4 ДНК лигазы к фрагменту ДНК, содержащему оrigin вируса бычьей папилломы (BPV) и фрагмент ДНК, содержащий ранний промотор SV40. Полученная рТ NCЕ3 α представляла собой вектор экспрессии, который имел хромосомный ген КСФ, расположенный за ранним промотором SV 40, и который содержал 65% часть BPV.

Вектор экспрессии для клеток СНО имел два фрагмента ДНК, соединенные с помощью Т4 ДНК-лигазы, один фрагмент содержал хромосомный ген КСФ и ранний промотор SV 40, как в случае вектора экспрессии для клеток С127, а другой фрагмент содержал ген pAdD 26 SV pА-dhfr. Полученная pD26SVCE3α представляла собой вектор экспрессии, который имел хромосомный ген КСФ, расположенный за промотором SV 40 и ген dhfr за основным поздним промотором аденовируса.

(9) Экспрессия в клетках животных
(А) Экспрессия в клетках мышей С127
Плазмиду pТN-G4 или рТN-V2 обработали BamHI. Обработанную плазмиду использовали для трансформации клеток С127 (предварительно выращенных путем культивирования) по методике с применением фосфата кальция. Выращивали трансформированные клетки, и отобрали клоны, имеющие высокую скорость продуцирования КСФ. Выделили гликопротеины, содержащие экспрессованный КСФ, и очистили от культурального раствора трансформированных клеток. Найдено, что они обладают активностью человеческого Г-КСФ. Наличие нужного гликопротеина было также подтверждено с помощью аминокислотного анализа и анализа содержания сахара в образце.

Для анализа содержания сахара образец КСФ, использованный в аминокислотном анализе, подвергали процедуре определения аминосахара по методу Элсона-Маргана (Еlson-Margan), определения нейтрального сахара по методу с применением орцинолсульфата, либо определения сиаловой кислоты по методу с применением тиобарбитурата. Методы каждого определения описаны в "Тohshitsu no Kagaku "Сhemistry of Saccharides" (ч. 2 из двух частей), ч. 13, т. 4 курса А в Биохимических экспериментах (Biochemical Ехperiments, published bу Тokyо Kagaku Dojin). Перевод измеренных величин в весовые проценты показал, что содержание сахара в полученном Г-КСФ было распределено в диапазоне 1-20 мас. в зависимости от типа клетки-хозяина, векторов экспрессии и от условий культивирования.

(В) Экспрессия в клетках СOS.

Клетки СOS, которые были выведены из клеток обезьян СV-I и которые были трансформированы с помощью мутанта, лишенного начала SV40, для выражения крупноразмерного Т-антигена SV 40 [см. Gluzman et al. Сell. 32, 175(1981)] были трансформированы вектором pML CEЗ α, который был получен в (5) (С) и который содержал человеческий хромосомный ген Г-КСФ. Надосадочная жидкость культуры клеток СOS проявляла активность человеческого Г-КСФ (пример 35).

Клетки СOS были выделены из подвергнуты анализу мРНК, который показал наличие двух мРНК, соответствующих аминокислотным последовательностям, показанным на фиг.3 и фиг.4, соответственно. Следующий пример иллюстрирует определение активности КСФ.

Проба активности, стимулирующей образование колоний (а) С клетками костного мозга человека:
Культивирование в монослое мягкого агара проводили в соответствии с методикой Brandley, Т.R. and Metcalf, D. (Аust. J. Ехр. Biol. Med. Sci. 44, 287-300, 1966). Смешали 0,2 мл сыворотки бычьего эмбриона, 0,1 мл образцы, 0,1 мл суспензии несросшихся клеток костного мозга человека (1-2х х10⁵ нуклеарных клеток), 0,2 мл модифицированного культурального раствора Мак-Кой 5А (Mc Coy) и 0,4 мл модифицированного культурального раствора Мак-Кой 5А, содержащего 0,75% агара, вылили в пластиковую чашку для культуры ткани (диаметром 35 мл), подвергли коагуляции и культивировали при 37^оС в 5% СО₂/95% воздуха при 100% влажности. Через десять дней подсчитали число полученный колоний (одна колония состояла из не менее 50 клеток) и определили колониистимулирующую активность, причем считали, что одна единица представляет собой активность, необходимую для образования одной колонии.

(в) С клетками костного мозга мыши:
Смешали лошадиную сыворотку (0,4 мл) 0,1 мл образца 0,1 мл суспензии клеток костного мозга (самок) мышей С3Н/Не (0,5-1x x10⁵ нуклеарных клеток) и 0,4 мл модифицированного культурального раствора Мак-Кой 5А, содержащего 0,75% агара, вылили смесь в пластиковую чашку для культуры ткани (диаметром 35 мм), подвергли коагуляции и культивировали в течение 5 дней при 37^оС в 5% СО₂ 95% воздуха и при 100% влажности. Подсчитали число образовавшихся колоний (одна колония состояла из не менее 50 клеток) и определила колониистимулирующую активность, считая, что одна единица соответствует активности, необходимой для образования одной колонии.

П р и м е р 1. Установление СНU-2.

Опухоль больного, имеющего рак ротовой полости, при котором наблюдалось выраженное увеличение числа нейтрофилов, трансплантировали в мышь nu/nu. Примерно через 10 дней после пересадки отмечали увеличение веса опухоли и числа нейтрофилов. Через двенадцать дней после пересадки опухоль извлекли асептически, нарезали на кубики 1-2 мм³ и выращивали следующим образом.

От десяти до пятнадцати кубиков опухоли поместили в 50 мл пластиковую центрифужную пробирку. После добавления 5 мл раствора трипсина (содержащего 0,25% трипсина и 0,02% ЭДТА) пробирку трясли в течение 10 мин в теплой бане при 37^оС и надосадочную жидкость сливали. Добавили еще 5 мл порцию того же самого раствора трипсина, и трипсиновое переваривание проводили при перемешивании в течение 15 мин при 37^оС. Выделили надосадочную клеточную суспензию и хранили ее во льду после того, как трипсин дезактивировали путем добавления 1 мл сыворотки бычьего эмбриона.

После еще одного повторения этих способов, клеточную суспензию выделили, смешали с ранее полученной суспензией и подвергли центрифугированию при 15000 оборотов в 1 мин в течение 10 мин, чтобы получить клеточный осадок после центрифугирования. Осадок после центрифугирования дважды промыли F-10, содержащим 10% сыворотку бычьего эмбриона, и после этого поместили в пластиковую колбу для культуры (25 см²), чтобы получить клеточную концентрацию 5х10⁶ клеток/колбу. После инкубирования в течение ночи в инкубаторе с СО₂ (5% СО₂ и 100% влажность) с F-10 культуральным раствором, содержащим 10% сыворотки бычьего эмбриона, надосадочную жидкость удалили вместе с несросшимися клетками, и культивирование продолжали со свежим вливанием культурального раствора. Через шесть дней после начала культивирования колба заполнилась клетками, и культуральный раствор заменили свежим. На другой день культуральный раствор вылили, и в колбу загрузили 2 мл анти-мышинного эритроцитного антитела (Сappel), разбавленного в 5 раз с помощью RPMI-1640 и 2 мл хромосомного набора морской свинки (Kyokuto Seiyaku Co. Ltd.), разбавленного в 2,5 раза с помощью RPMI-1640. После инкубирования в течение 20 мин при 37^оС культуру дважды промыли F-10, содержащими 10% сыворотку бычьего эмбриона и удалили мышиные фибробласты. Затем добавили F-1 культуральный раствор, содержащий 10% сыворотку бычьего эмбриона, и культивирование проводили еще в течение 2 дней. После этого часть клеток выделили и подвергли клонированию по способу предельного разбавления.

У полученных II клонов проверили их КСФ активность, было найдено, что один клон (СН U-2) проявлял активность примерно в 10 раз более высокую, чем другие клоны.

П р и м е р 2. Выделение КСФ.

Клетки, полученные в примере 1, выращивали в совершенно плотной популяции в двух культуральных колбах (150 см³). Клетки выделили, суспендировали в 500 мл культурального раствора F-10, содержащего 10% сыворотку бычьего эмбриона, перенесли в стеклянную вращающуюся бутыль 1580 см³ (Belco) и подвергали вихревому культивированию при вращении со скоростью 0,5 оборотов 1 мин. Когда было найдено, что клетки выросли в совершенно плотной популяции на внутренней стенке вращающейся бутылки, культуральный раствор заменили на R PMI 1640, не содержащий сыворотки. После культивирования в течение 4 дней выделили надосадочную жидкость культуры и культиварование продолжали добавлением с F-10 раствора, содержащего 10% сыворотки бычьего эмбриона. После трехдневного культивирования культуральный раствор снова заменили на RPMI 1640, не содержащий сыворотки, и через 4 дня выделили надосадочную жидкость культуры. Путем повторения этих способов каждую наделю получали 500 мл не содержащую сыворотки надосадочную жидкость в расчете на одну бутыль. Кроме того, этот способ дает возможность выделять надосадочную жидкость культуры при поддержании клеток в течение существенно удлиненного периода.

Порцию, содержащую 5000 мл надосадочной жидкости полученной культуры, смешали с 0,01% Твин 20 и сконцентрировали примерно в 1000 раз путем ультрафильтрации через фильтры Hollow Fiber DC-4 and Amicon PM-10 (Amicon).

Концентрат очищали следующими способами.

(I) Порцию (5 мл) сконцентрированного поверхностного слоя культуры подвергали гель-фильтрации на колонке Ultrogel АСА54 (диаметр 4,6 см, длина 90 см, LKB) при скорости потока примерно 50 мл/ч с 0,01 моль/л Трис-HCl буфером (рН 7,4), содержащим 0,15 моль/л NaCl и 0,01% Твин 20 (Nakai Kagaku Co. Ltd. ). Колонку откалибровали с помощью сыворотки бычьего альбумина (мол.м. 67000), овоальбумина (мол. м. 45000) и цитохрома С (мол.м. 12400). После окончания гель-фильтрации 0,1 мл каждой из фракций разбавили в 10 раз, и провели направленный отбор активных фракций с помощью вышеописанного способа определения активности стимулирующей колонии (КСА) (в). Найдено, что фракции с Ve 400-700 мл проявляют макрофаг-доминантную колониистимулирующую активность, в то время как фракции с Ve 800-1200 мл проявляют гранулоцит-доминантную активность, стимулирующую колонии. Поэтому последние фракции собрали и сконцентрировали до объема примерно 5 мл на ультрафильтрующем устройстве с РМ-10 (Аmico).

(II) К концентрированным фракциям добавляли водный раствор 0,1% трифторуксусной кислоты, содержащий 30% н-пропанола (для определения аминокислотной последовательности, поставляемый фирмой "Тokyo Kasei K.K."). После выдерживания смеси во льду в течение примерно 15 мин осадок удалили путем центрифугирования в течение 10 мин при 15000 оборотах в минуту. Надосадочную жидкость адсорбировали на колонке С18 μ -Бондапак (8 мм х 30 см для полупрепаративного использования, Waters), уравновешенной водным раствором, содержащим н-пропанол и трифторуксусную кислоту, колонку непрерывно элюировали водным раствором 0,1% трифторуксусной кислоты, содержащим н-пропанол, который имел линейный градиент концентрации 30-60% Использовали жидкостный хроматограф высокого давления фирмы "Хитачи", модель 685-50(Hitaсhi. Ltd.) и детектор "Хитачи" модель 638-41 (Hitachi, Ltd.).

Для определения величин поглощения одновременно на 220 нм и на 280 нм. После элюирования, 10 мкл каждой из фракций разбавили в 100 раз, и провели направленный отбор активных фракций с помощью вышеописанного способа определения колонистимулирующей активности (в). Найдено, что пики, элюирование 40% н-пропанолом, обладают активностью стимулирующей колонии, поэтому их собрали, подвергли повторному хроматографированию в тех же самых условиях, и тем же самым способом определили их активность стимулирующую колонию. Снова наблюдали активность в пиках в 40% н-пропаноле. Поэтому эти пики собрали (4 фракции 4 мл) и высушили замораживанием.

(III) Полученный сублимационной сушкой порошок растворили в 200 мкл водного раствора, 0,1% трифторуксусной кислоты содержащей 40% н-пропанола, и раствор подвергали жидкостной хроматографии высокого давления на колонке ТSK-G3000SW (Тoуо Soda Manufacturing Co. Ltd. 7,5 ммх 60 см). Элюирование проводили с тем же самым водным раствором при скорости потока 0,4 мл/мин и фракции собирали порциями по 0,4 мл с помощью собирателя фракций FRAC-100 (Pharmacia Fine Chemical). Каждую из взятых фракций проверяли для определения ее колониистимулирующей активностью с помощью такого же способа, какой описан выше, и активность наблюдали во фракциях с временами удерживания 37-38 мин (соответствующей молекулярной массе примерно 2 х10⁴). Активные фракции выделяли и очищали на аналитической колонке μ -Bondapak C18 (4,6 мм х 30 см). Основные пики выделили и высушили вымораживанием. Полученный образец проанализировали с помощью способа определения колониистимулирующей активности (а). Найдено, что он обладал активностью человеческого Г-КСФ.

П р и м е р 3. Определение аминокислотной последовательности
(I) Определение N-концевой аминокислотной последовательности.

Образец подвергали разложению Эдмана с помощью газофазного определителя последовательности (Applied Biosystems), и полученную РТН-аминокислоту анализировали обычными способами с помощью жидкостного хроматографа высокого давления (Beckman Instruments) и колонки Ultrasphere ODS (Beckman Instruments). Колонку (5 мкм, 4,6 мм диаметром и длиной 250 мм) уравновесили исходным буфером водный раствор, содержащий 15 миллимоль/л натрийацетатного буфера (рН 4,5) и 40% ацетонитрила, и ввели образец (растворенный в 20 мкл исходного буфера). Разделение осуществляли при изократическом элюировании исходным буфером. Скорость потока составляла 1,4 мл/мин, а температуру колонки поддерживали при 40^оС. Детектирование РТН-аминокислоты осуществляли, используя поглощения в ультрафиолетовом диапазоне на длинах волн 269 и 320 нм. Стандартные образцы РТН-аминокислоты (Sigma) в 2-наномолярных порциях разделяли на той же самой линии, чтобы определить их времена удерживания, которые сравнивали с временами испытываемых образцов. В результате найдено, что образец имел следующую аминокислотную последовательность из 40 остатков от N-конца. Н₂N-Тhr-Про-Лей-Глу-Про-Ала-Сер-Сер-
(10) Лей-Про-Глн-Сер -Phе-Лей-Лей-Лиз-Цис-
(20) Лей-Глу-Глн-Вал-Арг-Лиз-Иле-Глн-Глу-
(30) Асп-Глу- Ала-Лей-Глн-Глу-Лиз-Лей-
(40) Цис-Ала-Тhr-Туr-Лиз- (II) Разложение бромцианом.

Образец растворили в 70%-ной муравьиной кислоте. К раствору добавили 200 эквивалентных количеств бромциана, который очищали сублимацией. Смесь оставили на ночь при 37^оС для реакции. Продукт реакции высушили вымораживанием и фракционировали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии и на колонке ТSKG3000SW (Тoyo Soda Manufacturins CO. Ltd.), получив четыре пика. Пики назвали CN-1, CN-2, СN-3, СN-4 в порядке убывания молекуляpной массы. Первые два пика (СN-1 и CN-2) имели лучшие выходы, и их аминокислотные последовательности проанализировали с помощью автоматического газофазного определителя последовательности (Applied Biosystems) при тех же самых условиях, какие использовали в (I).

В результате найдено, что СN-1 представляет собой пептид от N-конца протеина Г-КСФ, а СN-2 имел следующую аминокислотную последовательность: Про-Ала-Фен-Ала-Сер-Ала-Фен- Глн-Aрг-Арг-Ала-Гли-Гли-Вал- Лей-Вал-Ала-Сер-Гис-Лей-Глн- (III) Разложение трипсином.

Образец растворили в 0,1 моль/л трис-HCl буфере (рН 7,4), содержащем 8 моль/л мочевины и раствор смешали с 0,1 моль/л трис-НСl буфером (рН 7,4), содержащим 0,1,2-меркаптоэтанола, чтобы получить конечную концентрацию мочевины 2 моль/л. Добавляли ТРСК-обработанный трипсин (Sigma) с тем, чтобы отношение образца к ферменту составляло 50:1. Смесь выдерживали в течение 4 ч при 25^оС и после добавления равного количества ТРСК-обработанного трипсином, смесь выдерживали в течение еще 16 ч при 25^оС. После этого реакционный продукт подвергали высокоскоростной обращеннофазной колоночной хроматографии на колонке С8 (Yamamura Kagaku K.K.) при элюировании 0,1% трифторуксусной кислотой, содержащей н-пропанол, который имел линейный градиент плотности 5-60% Несмотря на то, что наблюдали несколько пиков при измерении поглощения на 280 нм, анализировали основной пик для определения его аминокислотной последовательности с помощью автоматического газофазного определителя последовательности (Applied Biosystems) при тех же самых условиях, какие и использовали в (I). В результате найдено, что основной пик представлял собой пептид, имеющий следующую последовательность, которая содержала часть CN-2 фрагмента, показанного в (II): Глн-Лей-Асп-Вал-Ала-Асп-Фен-Ала-Тре- Тре-Иле-Трп-Глн-Глн-Мет-Глу-Глу-Лей- Гли-Meт-Ала-Про-Ала-Лей-Глн-Про-Тре- Глн-Гли-Ала-Meт-Про-Ала-Фен-Ала-Cер-
П р и м е р 4. Получение ДНК зонда (I) Синтез зонда (IWQ)
Тридцать последовательных нуклеотидов (см.фиг.1) получили на основании последовательности 10 аминокислот (Иле-Трп-Глн-Глн-Meт-Глу-Глу-Лей-Гли-Мет), включенной в аминокислотную последовательность, полученную в примере 3(II). Нужно сделать одно замечание относительно обозначения нуклеотидов, показанных на фиг. 1, например, нуклеотид в положении 9, от 5'-конца представляет собой эквимолярную смесь dА и dG. Исходные нуклеотиды представляют собой по большей части димеры, но если необходимо, используют также и монокулеотиды. В колонку, снабженную стеклянным фильтром, загрузили 20 мг исходной нуклеотидной смолы Ap-d(G) (Yamasa Snoyu Co. Ltd.). После повторной промывки хлористым метиленом 4,4'-диметокситритиловую группу исключили путем обработки раствором метиленхлорида, содержещего 3% трихлоруксусную кислоту. Затем колону промыли несколько раз 1 мл метиленхлорида. После того, как колонку промыли безводным пиридином, чтобы заместитель растворитель, туда добавили 20 мг нуклеотидного димера (DMTr) ApТр (NHR₃), (Nippon Zeon; NHR₃-триэтиламмоний; DMТr-диметокситритил) и 0,2 мл пиридина и внутреннюю часть колонки высушили вакуумом с помощью вакуумного насоса. Затем добавили 20 мг 2,4,6-триметилбензолсульфонил-3-нитротриазолида (MSNТ of Wako Pure Chemical Inductries, Ltd.) и 0,2 мл безводного пиридина, и внутреннюю часть колонки вытеснили газообразным азотом. Нуклеотидную смолу сконцентрировали с димером путем реакции в течение 45 мин при комнатной температуре при перемешивании время от времени. После окончания реакции колонку промыли пиридином, и непрореагировавшие ОН группы ацетилировали пиридиновым раствором, содержащим избыток уксусного ангидрида и 4-диметиламинопиридина. После промывания колонки пиридином сконденсировали следующие димеры или мономеры, написанные по порядку, путем повторения вышеописанных способов (DMТr)Ip(NHR₃), (DMTr)GpGp(NНR₃), (DMTr)Ip(NHR₃), эквимолярная смесь (DMTr) CрТр(ТНR₃) и (DMTr) ТрТр(NHR₃), эквимолярная смесь (DMTr) ApAp(NHR₃) и (DMTr)ApGp(NHR₃), эквимолярная смесь (DMTr)ApGp(NHR₃) и (DMTr)GpGp(NHR₃), (DMTr)GpAp(NHR₃), (DMTr) TpGp(NHR₃), эквимолярная смесь (DMTr)ApAp(NHR₃) и (DMTr)GpAp(NHR₃), (DMTr)СрАр(NHR₃), эквимолярная смесь (DMTr)ApAp(NHR₃) и (DMTr)ApGp (NHR₃), (DMТr)GpCp(NHR₃), (DMTr)ТpGp(NHR₃), (DMTr)Ip(NHR₃) и (DMTr)ApТp(NHR₃), причем все эти нуклеотиды поставляются фирмой "Nippon Zeon" за исключением (DMТr) Ip (NHR₃), который поставляется фирмой "Yamasa Shoyu Co. Ltd.". После окончания реакции на конечной стадии смолу последовательно промывали пиридином, метиленхлоридом и эфиром без ацилирования и после этого сушили. Высушенную смолу суспендировали в 1,7 мл cмеси пиридина (0,5 мл), воды (0,2 мл) и диоксана (1 мл), содержащей 1 моль/л тетраметилгуанидина и 1 моль/л α-пиколиналдоксима. Суспензию оставили стоять в течение ночи при комнатной температуре и сконцентрировали до объема 100-200 мкл под вакуумом. Концентрат смешали с небольшим количеством (2-3 капли) пиридина и 2-3 мл концентрированного водного аммиака, смесь нагревали при 55^оС в течение 6 ч. После экстрагирования этилацетатом водный слой отделили и сконцентрировали под вакуумом. Концентрат растворили в растворе 50 ммоль/л ацетата триэтиламмония (рН 7,0) и раствор подвергали хроматографии на колонке С-18, (1,0 15 см; Waters), причем элюирование осуществляли ацетонитрилом (линейный градиент плотности 10-30%) в растворе 50 миллимоль/л ацетата триэтиламмония (рН 7,0). Пик фракции, элюируемой при концентрации ацетонитрила примерно 25% сконцентрировали под вакуумом.

К концентрату добавили 80% уксусную кислоту и смесь оставили стоять в течение 30 мин при комнатной температуре. После экстрагирования этилацетатом отделили водный слой и сконцентрировали его под вакуумом. Полученный концентрат затем очищали жидкостной хроматографией высокого давления на колонке С-18 (поставляемой Senshu Kagaku K.K. SSC-ODS- 272, диаметр 6х 200 мм). Элюирование проводили ацетонитрилом (линейный градиент плотности 10-20%) в растворе 50 ммоль/л ацетата триэтиламмония (рН 7,0). Синтетическую ДНК получили с выходом не ниже, чем 10А₂₆₀ единиц.

Анализ с помощью метода определения последовательности по Максаму-Джилберту [Maxam-Gilbert, Meth. Еnzym. 65,499(1980)] показал, что полученный олигонуклеотид имел нуклеотидную последовательность, показанную на рис.1.

(II) Cинтез зонда (А).

Четырнадцать последовательностей нуклеотидов (см.фиг.1) получили на основе последовательности 5 аминокислот (Мет-Про-Ала-Фен-Ала), включенных в аминокислотную последовательность, полученную в примере 3.

Способы синтеза были аналогичны тем, которые использовали при получении зонда (IWQ) и следующие нуклеотиды сконденсировали в нуклеотидную смолу Ар-d (Т) (Yamasa Shoyu Cо. Ltd.) в порядке написания: (DMTr)CpAp(NHR₃), (DMTr)GpGp(NHR₃), эквимолярная смесь (DMTr)CpAp(NHR₃), (DMTr)CрTр(NHR₃), (DMTr)CpGp(NНR₃) и (DMTr)CpCp(NHR₃), эквимолярная смесь (DMTr)ApGp(NНR₃), (DMTr)TpGp(NHR₃), (DMTr)GpGp(NHR₃) и (DMTr)CрGp(NHR₃), (DMTr)ApAp(NHR₃), эквимолярная смесь (DMTr)CpAp(NНR₃) и (DMTr)CpGp(NHR₃), и (DMТr)Gp(NНR₃), причем все нуклеотиды поставляются фирмой Nippon Zeon. Cинтетическую ДНК получили с выходом примерно 10А₂₆₀ единиц. Анализ с помощью метода определения последовательности по Максаму-Джилберту показал, что полученный олигонуклеотид имел нуклеотидную последовательность, показанную на фиг.1.

(III) Cинтез зонда (LC).

Автоматический синтез ДНК осуществляли с помощью синтезатора ДНК, модель 380А "Аpplied Biosystems". Эту методику, основанную на принципах, описанных Саruthers et al. [J. Am. Сhem. Soc. 103,3185 (1981)] обычно называют фосфорамидитной методикой.

Фосфорамидитную форму (DMTr)-dT, предварительно активированную тетразолом, конденсируют к dG-S (Si подложка), где деблокируют 5'-диметокситритильную группу (DMTr). После этого непрореагировавшие группы ацетилируют и окисляют йодом в присутствии воды, чтобы получить группы фосфорила. После деблокирования группы DMTr повторяют конденсацию таким же образом до тех пор, пока не синтезируют 24 нуклеотида, имеющих последовательность, показанную на фиг.1. Эти нуклеотиды отщепляют от подложки, деблокируют и очищают с помощью обращеннофазной жидкостной хроматографии высокого давления на колонке С-18 (Senshu Kagaku Co. Ltd. SSC-ODS-272).

П р и м е р 5. Культивирование клеток CHU-2 и получение иРНК
1/Культивирование и выделение клеток СНU-2.

Адаптированные клетки СНU-2 выращивали в совершенно плотной популяции в двух колбах для культивирования (150 см²), выделили, суспендировали в 500 мл культурального раствора RРMI 1640, содержащего 10% сыворотки бычьего эмбриона, перенесли в стеклянную вращающуюся бутыль 1580 см² (Belco) и культивировали при вращении в течение 4 дней со скоростью 0,5 оборота в 1 мин. Когда было найдено, что клетки выросли в совершенно плотной популяции на внутренней стенке вращающейся бутыли, культуральный раствор удалили на вращающейся бутыли, и в нее загрузили 100 мл предварительно нагретого (37^оС) физиологического солевого раствора, содержащего 0,02% ЭДТА. После нагревания при 37^оС в течение 2 мин клетки отделили с внутренней стенки колбы путем отсасывания пипеткой. Полученную клеточную суспензию центрифугирования при 1500 оборотах в минуту в течение 10 мин, чтобы получить клеточный осадок после центрифугирования. Клетки повторно суспендировали в 5 мл физиологического солевого раствора, не содержащего ЭДТА. Суспензию центрифугировали при 1500 оборотах в 1 мин в течение 10 мин, чтобы получить клеточный осадок после центрифугирования (влажный вес примерно 0,8 г). Полученные таким образом клетки хранили замороженными при -80^оС до тех пор, пока их не подвергли процедуре экстракции РНК.

2) Очистки иРНК.

Выделение иРНК из клеток СНU-2, полученных в 1) осуществляли с помощью способов, которые были по существу такими же как способы, описанные в "Molесular Cloning", Maniatis et al. Сold Spring Harbor, р. 196, 1982. Замороженные клетки СНU-2 (влажный вес 3,8 г) суспендировали в 20 мл раствора 6 моль/л гуанидина [6 моль/л изотиодианата гуанидиния, 5 ммоль/л цитрата натрия (рН 7,0) 0,1 моль/л β -меркаптоэтанола и 0,5% саркозилсульфата натрия] и cуспензию хорошо перемешали вихревым вращением в течение 2-3 мин. Смесь подвергали 10 циклам всасывания и выпрыскивания шприцем (емкостью 20 мл), снабженного иглой 18G. Примерно 6 мл вязкого гуанидиниевого раствора, содержащего разорванные клетки, наслоили на 6-мл подушку из 5,7 моль/л CsCl в 0,1 моль/л ЭДТА (рН 7,5) в центрифужной пробирке Вeckman SW40Тi polyallomer таким образом, чтобы пробирка была полностью заполнена. Четыре центрифужные пробирки приготовили описанными выше способами и их центрифугировали при скорости 30000 оборотов в 1 мин в течение 15 ч при 20^оС. Полученные осадки после центрифугирования промыли три раза небольшим количеством 70% этанола.

Осадки от центрифугирования, полученные из соответствующих пробирок, смешали, растворили в 550 мкл воды и обработали, чтобы получить концентрацию NaCl 0,2 моль/л. После обработки смесью 1:1 фенола и хлороформа, а затем одним хлороформом, добавили 2,5 объема этанола, чтобы осадить всю РНК (примерно 10,1 мг всей РНК получили из 3,8 г влажных клеток). Поли (А⁺) РНК очищали из всей РНК с помощью следующих способов аффинной хроматографии, используя преимущество прикрепления поли(А)цепи к 3'-концу иРНК. Адсорбцию на олиго (dТ)-целлюлозе (тип 7 Р-L Biochemicals) осуществляли путем пропускания через олиго (dТ)-целлюлозную колонку всей РНК в загрузочном буфере [содержащем 10 миллимоль/л трис-НСl (рН 7,5) 0,5 моль/л NaCl, 1 ммоль/л ЭДТА, и 0,1% раствора SDS] после того, как раствор нагревали при 65^оС в течение 5 минут. Колонку уравновешивали тем же самым нагрузочным буфером. Элюирование поли(А⁺) РНК осуществляли с помощью раствора ТЕ [содержащего 10 миллимоль/л трис-НСl (рН 7,5) и 1 миллимоль/л ЭДТА] Неадсорбированный выходящий поток повторно пропустили через колонку еще раз и элюат, полученный при повторении тех же самих способов, смешали с первым погоном элюата. В результате получили 400 микрограммов поли(А+) РНК.

Полученную таким образом иРНК фракционировали по размеру путем центрифугирования в градиенте плотности сахарозы в соответствии с методиками, описанными в Лабораторном руководстве Schleif and Wensink, "Practical Methods in Molecular Biology", Springer-Verlag, New York, Неidelberg, Berlin (1981).

Градиент плотности сахарозы 5-25% создавали в центрифужной пробирке Backman SW40Тi. Два сахарозных раствора приготовили путем растворения 5 и 25% сахарозы, не содержащей рН-азы (Schwarz/Mann), в растворе, содержащем 0,1 моль/л NaCl, 10 миллимоль/л Трис-HCl (рН 7,5), 1 миллимоль/л ЭДТА и 0,5 SDS. 7,5) и 1 миллимоль/л ЭДТА] Неадсорбированный выходящий поток повторно пропустили через колонку еще раз и элюат, полученный при повторении тех же самих способов, смешали с первым погоном элюата. В результате получили 400 микрограммов поли(А⁺) РНК.

Полученную таким образом иРНК фракционировали по размеру путем центрифугирования в градиенте плотности сахарозы в соответствии с методиками, описанными в Лабораторном руководстве Schleif and Wensink, "Practical Methods in Molecular Biology", Springer-Verlag, New York, Неidelberg, Berlin (1981).

Градиент плотности сахарозы 5-25% создавали в центрифужной пробирке Backman SW40Тi. Два сахарозных раствора приготовили путем растворения 5 и 25% сахарозы, не содержащей рН-азы (Schwarz/Mann), в растворе, содержащем 0,1 моль/л NaCl, 10 миллимоль/л Трис-HCl (рН 7,5), 1 миллимоль/л ЭДТА и 0,5 SDS.

Восемьсот микрограммов иРНК [поли (A⁺)-РНК] полученной уже описанным способом, растворили в 200-500 микролитрах ТЕ раствора. Раствор нагревали при 65^оС в течение 5 мин, и после резкого охлаждения, его поместили на растворы с градиентом плотности сахарозы, которые подвергали центрифугированию при 30000 оборотах в минуту в течение 20 ч. Собрали фракции массой 0,5 мл каждая, и измерили их поглощение при 260 нм. Размеры фракционированных РНК определяли на основе положений стандартных РНК (рибосомальные РНК, 28S, 18S, и 5S). В это же время определяли активность Г-КСФ каждой фракции, используя овоциты Хenopus laevis по следующими методикам. Сначала, иРНК каждой фракции перевели в водный раствор с концентрацией 1 мкг/1 мкл, овоциты были взяты от Хenopus (в возрасте примерно одного года) и раствор иРНК инжектировали таким образом, что 50-нанограммов иРНК ввели в один овоцит, десять таких овоцитов поместили в каждое из 96 углублений в микротитровальной чашке, овоциты культивировали в течение 48 ч при комнатной температуре в 10 мкл среды Берта (Barth) [88 ммоль/л NaCl; 1 ммоль/л KCl; 2,4 ммоль/л NaHCO₃; 0,82 ммоль/л MgSO₄; 0,33 ммоль/л Cа(NO₃)₂; 0,41 ммоль/л CaCl₂; 7,5 ммоль/л трис-HCl (рН 7,6); пенициллин 10 мг/л и стрептомицинсульфат 10 мг/л] надосадочную жидкость культуры выделили, сконцентрировали и очистили до чистоты достаточной для определения активности Г-КСФ.

Найдено, что активность Г-КСФ присутствовала во фракциях 15-17S.

П р и м е р 6. Синтез КДНК (построение библиотеки КДНК pBR-линии).

На поли (А⁺), полученной в примере 5, синтезировали кДНК по методу Лэнда с сотр. (Land et al. [Nucleic Acids Res. 9, 2251 (1981)] модифицированного по способу Gubler and Hoffman [Gene, 25,263 (1983)]
(I) Синтез однонитевой кДНК.

В пробирку Эппендорфа (вместимостью 1,5 мл) поместили реагенты в следующем порядке: 80 мкл реакционного буфера (500 ммоль/л KCl, 50 ммоль/л MgCl₂, 250 ммоль/л трис-НСl, рН 8,3), 20 мкл 200 ммоль/л дитиотрептола, 32 мкл, 12,5 ммоль/л дезоксинуклеотидтрифосфата (содержащего по 12,5 ммоль/л каждого из дезоксиаденозинтрифосфата, дезоксигуанозинтрифосфата, дезоксицитозинтрифосфата и дезокситимидентрифосфата), 10 мкг α -³²Р дезоксицитозинтрифосфата (dЦТФ) (РВ 10205 Amerscham), 32 микролитра олиго (dТ)12-18 (из фирмы P-L Biochemicals, 500 мкг/мл), 20 микрограммов поли(А⁺) РНК (2,1 мкг/мл) и 206 мкл дистиллированной воды. Всего 400 мкл реакционного раствора нагревали при 65^оС в течение 5 мин, а после этого нагревали при 42^оС в течение 5 мин. К нагретому раствору добавляли 120 единиц реверстранскриптазы (Тakara Shuzo Co. Ltd.). После проведения реакции в течение более 2 ч при 43^оС добавили 2 мкл ингибитора РНК-азы (Bethesda Research Laboranories), 20 мкл ТЕ раствора, 16 мкл 100 ммоль/л пирофосфата натрия и 48 единиц (4 мкл) реверстранскриптазы, и реакцию проводили при 46^оС в течение 2 ч. Реакцию гасили путем добавления 0,5 моль/л ЭДТА (8 микролитров) и 10% SDS (8 микролитров). Путем последующей обработки фенолом/хлороформом и осаждение этанолом (дважды) получили однонитевую КДНК.

2) Прикрепление dC-цепи к однонитевой КДНК.

Однонитевую кДНК, полученную в 1), растворили в дистиллированной воде. К раствору добавили 60 мкл dC-цепьсодержащего буфера [400 ммоль/л какодилата калия, 50 ммоль/л трис-НСl (рН 6,9), 4 ммоль/л дитиотреитола, 1 ммоль/л CoCl₂ и 1 ммоль/л дезоксицитозинтрифосфата (dЦТФ)] и смесь нагревали при 37^оС в течение 5 мин. К реакционному раствору добавили 3 мкл концевой трансферазы (27 единиц/мкл, Р-L Biochemicals) и смесь нагревали при 37^оС в течение 2,5 мин. После обработки фенолом/хлороформом (один раз) и осаждения этанолом (дважды), dC-привязанную КДНК растворили в 40 мкл ТЕ раствора, содержащего 100 миллимоль/л NaCl.

3) Cинтез двухнитевой КДНК.

К 40 мкл раствора ДНК, полученного в 2) добавили 4 мкл олиго (dG)12-18 (200 мкг/мл, Р-L Biochemicals) и смесь нагревали сначала при 65^оС в течение 5 мин, а затем при 43^оС в течение 30 мин. В то время, как реакционный раствор поддерживали при 0^оС, в него добавили 80 мкл буфера [100 ммоль/л трис-HCl (рН 7,5), 20 ммоль/л MgCl₂, 50 ммоль/л (NH₄)₂SO₄, и 500 ммоль/л KCl] 4 мкл 4 ммоль/л дезоксинуклеотидтрифосфата (содержащего по 4 ммоль/л каждого dAТФ, dЦТФ, dГТФ и dТТФ), 60 микролитров 1 ммоль/л, β -NAD, 210 мкл дистиллированной воды, 20 мкл Е.coli ДНК-полимеразы I (Тakara Shuzo Co. Ltd. ), 15 мкл Е.coli ДНК-лигазы (Тakara Shuzo Co. Ltd.) и 15 микролитров Е.coli РН-азы Н (Тakara Shuzo Cо. Ltd.) и смесь подвергали реакции при 12^оС в течение 1 ч. После добавления 4 миллимоль/л дезоксинуклеотидтрифосфата (4 мкл), реакцию проводили при 25^оС в течение 1 ч. Путем последующей обработки фенолом/хлороформом и осаждением этанолом(один раз) получили примерно 8 микрограммов двунитевой КДНК. Эту двунитевую КДНК растворили в ТЕ растворе и подвергли 1,2% агарозному гель-электрофорезу. Фрагменты, соответствующие размеру примерно от 560 пар оснований до 2 тыс. пар оснований, адсорбировали на Ватман DE 81, и выделили посредством элюирования примерно 0,2 мкг двунитевой КДНК.

4) Соединение dC-цепи с двунитевой кДНК.

Двунитевую КДНК, полученную в 3), растворили в 40 мкл ТЕ раствора. После того, как добавили 8 мкл несущего dC-хвост буфера такого типа, какой описан в 2), cмесь нагревали при 37^о в течение 2 мин. После добавления 1 мкл концевой трансферазы (27 единиц/микролитр) смесь подвергали реакции при 37^оС в течение 3 мин. После этого реакционный раствор немедленно охладили до 0^оС, и реакцию погасили путем добавления 1 мкл 0,5 моль/л ЭДТА. После обработки фенолом/хлороформом и осаждения этанолом, полученный осадок суспендировали в 10 мкл ТЕ раствора.

5) Построение библиотеки КДНК рB R-линии
Четыре микролитра коммерческого олиго (dГ)-сшитого рBR 322 вектора (Bethesda Research Laboratories; 10 нано-граммов/микролитр) и 2 мкл dC-сшитой двунитевой кДНК, полученной в 4), ренатурировали в ТЕ растворе, содержащем 5 мкл 0,1 моль/л раствора NaCl. Ренатурация состояла из трех стадий: нагревание при 65^оС в течение 5 мин, последующий нагрев при 40^оС в течение 2 ч с последующим охлаждением до комнатой температуры.

В соответствии со способом, описанным в лабораторном руководстве Манятиса с сотр. [Maniatis et al. Molecular Cloning, Сold Spring Harbor, р. 249 и далее (1982)] (здесь можно также использовать другие известные методы), компетентные клетки получали из штамма Х 1776 Е.сoli и трансформировали с помощью ренатурированной плазмиды, чтобы получить трансформанты.

П р и м е р 7. Синтез КДНК (построение библиотеки λ -фага)
1/Синтез однонитевой КДНК.

В соответствии со способами, описанными в примере 5, 3,8 г замороженных СНU-2 клеток дважды очищали на колонке олиго (dТ)-целлюлозы, а затем подвергли обработке, чтобы получить 400 мкг поли(A⁺)-РНК.

ТЕ раствор (10 мкл), в котором растворено 12 мкг поли(А⁺)-РНК, поместили в реакционную пробирку, содержащую 10 мкг антиномицина D (Cигма). После этого в пробирку загрузили реагенты в следующем порядке: 20 мкл буфера для обратной транскриптазы [250 ммоль/л трис-НСl (рН 8,3); 40 ммоль/л MgCl₂; 250 ммоль/л KCl] 20 мкл 5 ммоль/л дезоксинуклеотидтрифосфата (содержащего по 5 ммоль/л каждого из dAТФ, dГТФ, dЦТФ и dТТФ), 20 мкл олиго (dТ)12-18 (0,2 мкг/мл, Р-L Biochemicals); 1 мкл 1 моль/л дитиотреитола, 2 мкл РН-азина (30 единиц) мкл, Promeda Biotech); 10 мкл реверстранскриптазы (10 единиц/мкл, Seikagаku Kogyo Co. Ltd.); 1 мкл α-³²Р- dАТФ(10 μСi; Аmerscham) и 16 мкл воды. Реакционный раствор, объем которого составлял 100 мкл, выдерживали при 42^оС в течение 2 ч, а затем реакцию погасили путем добавления 0,5 моль/л ЭДТА (5 мкл) и 20% SDS (1 мкл). Последующей обработкой фенолом/хлороформом (100 мкл) и осаждением этанолом (дважды) получили примерно 4 мкг однонитевой КДНК.

2) Синтез двунитевой КДНК
кДНК, полученную в 1), растворили в 29 мкл ТЕ раствора, и реакционный раствор приготовили путем добавления следующих реагентов в написанном порядке: 25 мкл полимеразного буфера [400 миллимоль/л Hepes (рН 7,6); 16 ммоль/л MgCl₂, 63 ммоль/л β -меркаптоэтанол и 270 ммоль/л KCl] 10 мкл 5 ммоль/л дезоксинуклеотидтрифосфата; 1,0 мкл 15 ммоль/л β -NAD; 1,0 мкл α -³²-Р-dAТР (10 мки/мкл); 0,2 мкл Е.coli ДНК-лигазы (60 единиц/мкл, Тakara Shuzo Co. Ltd.); 5,0 мкл Е.coli ДНК-полимеразы I (New Еngland Biolabs; 10 единиц/мкл); 0,1 мкл рН-азы Н (60 единиц/мкл; Тakara Shuzo Co. Ltd.); и 28,7 мкл дистиллированной воды.

Реакционный раствор инкубировали при 14^оС в течение 1 ч, позволили ему остыть до комнатной температуры, и затем инкубировали его еще в течение часа. Затем реакцию погасили путем добавления 0,5 моль/л ЭДТА (5 мкл) и 20% SDS (1 мкл) и обработали реакционную смесь фенолом/хлороформом и провели осаждение этанолом. Полученную ДНК растворили и 20 мкл, 0,5 ммоль/л ЭДТА и получили реакционный раствор путем добавления 3 мкл буфера Кленоу [500 миллимоль/л Трис-НСl (рН 8,0) и 50 ммоль/л MgCl₂] 3 мкл 5 ммоль/л дезоксинуклеотидтрифосфата и 4 мкл воды. После добавления 1 мкл ДНК-полимеразы (фрагмент Кленоу, Тakara Shuzo Co. Ltd.) реакционный раствор инкубировали при 30^оС в течение 15 мин.

Инкубированный реакционный раствор разбавили 70 мкл ТЕ раствора, и реакцию погасили путем добавления 0,5 моль/л ЭДТА (5 мкл) и 20% SDS (1 мкл). Путем последующей обработки фенолом/хлороформом и осаждением этанолом получили примерно 8 микрограммов двунитевой КДНК.

3) Метилирование двунитевой кДНК
Водный раствор (30 мкл) двунитевой кДНК, синтезированной в 2), смешали с 40 мкл буфера метилирования [500 ммоль/л трис-HCl (рН 8,0), 50 ммоль/л ЭДТА] 20 мкл раствора SAM [800 мкмоль/л S-аденозил-L-метилметионин (SAM), 50 миллимоль/л β -меркаптоэтанола] и 100 микролитрами воды. К смеси добавили 15 мл ЕсoRI метилазы (New Еngland Biolabs; 20 единиц/мкл), чтобы получить реакционный раствор, объем которого составлял 200 мкл. После инкубирования при 37^оС в течение 2 часов, провели обработки фенолом и эфиром, и осаждение этанолом, чтобы выделить ДНК.

4) Добавление линкера ЕсoRI.

Примерно к 1,2 мкг метилированной двунитевой ДНК добавили 1,5 мкл лигазного буфера [250 ммоль/л трис-НСl (рН 7,5) и 100 ммоль/л MgCl₂] 0,5 мкл предварительно фосфорилированного ЕсoRI линкера (10-мер; Тakara Shuzo Co. Ltd. ), 1,5 мкл 10 ммоль/л AТФ, 1,5 мкл 100 ммоль/л, дитиотреитола и 2 мкл H₂О, чтобы получить реакционный раствор, объем которого составлял 15 мкл. После добавления 0,7 мкл Т₄ ДНК-лигазы (3,4 единицы/микролитр, Тakara Shuzo Co. Ltd. ) реакцию проводили в течение ночи при 4^оС. После этого лигазу дезактивировали посредством нагревания при 65^оС в течение 10 мин. Реакционный раствор разбавили до полного объема 50 мкл путем добавления 100 ммоль/л трис-HCl (рН 7,5), 5 ммоль/л MgСl₂, 50 ммоль/л NaCl и 100 мкг/мл желатина. После добавления ЕсoRI (3,5 мкл, 10 единиц/мкл) реакцию проводили при 37^оС в течение 2 ч. Затем добавили 2,5 мкл 0,5 моль/л ЭДТА, и 0,5 мкл 20% SDS, после чего провели обработку фенолом/хлороформом и осаждение этанолом с тем, чтобы выделить ДНК. После этого, непрореагировавший ЕсoRI линкер удалили гельфильтрацией на UltrogelАсА34 (LKB) или агарозным гельэлектрофорезом с тем, чтобы выделить примерно 0,5-0,7 мкг двунитевой кДНК с добавленным линкером.

5) Присоединение двунитевой кДНК к вектору λ gt 10
Двунитевую кДНК с добавленным линкером смешивали с 2,4 мкг предварительно ЕсoRI-обработанного вектора λgt 10 (cистема клонирования вектора), с добавлением 1,4 мкл лигазного буфера (250 ммоль/л трис-HCl и 100 ммоль/л MgCl₂) и 6,5 мкл дистиллированной воды, и смесь нагревали при 42^оС в течение 15 мин. После этого добавили 1 мкл 10 ммоль/л AТФ, 1 мкл 0,1 моль/л дитиотреитола и 0,5 мкл Т₄ ДНК лигазы, чтобы получить полный объем 15 мкл, и реакцию проводили в течение ночи при 12^оС.

6) Упаковка in vitro
Примерно третью часть рекомбинантных ДНК, полученных в 5), упаковали с помощью набора для упаковки in vitro (Promeda Biotech), чтобы получить фаговые пятна.

П р и м е р 8. Направленный отбор библиотеки рB R-линии с помощью зонда (IWQ).

Бумагу Ватман 541 поместили на агаровую среду с растущими колониями и оставили при 37^оС в течение 2 ч. Фильтровальную бумагу затем обработали по следующему методу Тауба и Томпсона [Тaub and Thompson, Anal. Biochem. 126, 222 (1982)]
Колонии, перенесенные на бумагу 541, затем выращивали на агаровой среде, содержащей хлоранфеникол (250 мкг/мкл), в течение ночи при 37^оС.

Бумагу 541 извлекли и оставили при комнатной температуре на 3 мин на другом листе фильтровальной бумаге, которая была пропитана 0,5 н. раствором NaOН. Эту процедуру повторяли дважды. Два аналогичных опыта проводили в течение 3 мин, используя раствор 0,5 моль/л трис-НСl (рН 8). При 4^оС проводили обработки раствором 0,05 моль/л трис-НСl (рН 8) в течение 3 мин и раствором лизоцима 1,5 мг/мл [содержащим 0,05 моль/л трис-НСl (рН 8) и 25% сахарозы] в течение 10 минут, затем при 37^оС проводили обработки раствором 1 SSC (0,15 моль/л NaCl и 0,015 моль/л цитрата натрия) в течение 2 мин и раствором 1 SSC, cодержащим 200 мкг/мл протеиназы К, в течение 30 мин, наконец, при комнатной температуре проводили обработки раствором 1 х SSC в течение 2 мин и раствором 95% этанола в течение 2 минут. Конечную стадию повторяли дважды. После этого бумагу 541 высушили. Высушенную бумагу 541 погружали в смесь 25: 24: 1 фенола/хлороформа/изоамилового спирта [уравновешенную 100 миллимоль/л трис-НСl (рН 8,5), 100 ммоль/л NaCl и 10 ммоль/л ЭДТА] на 30 мин при комнатной температуре. Затем аналогичные процедуры повторяли три раза с раствором 5 х SSC в течение 3 мин, затем дважды с 95% этанольным раствором в течение 3 минут. После этого высушили фильтровальную бумагу.

Зонд (IWQ) пометили меченным атомом 32Р в соответствии с известными способами (см. Molecular Cloning), и гибридизацию колоний осуществляли по методу Wallace et al. [Nucleic Acids Res. 9, 879 (1981)] Предгибридизацию проводили при 65оС в течение 4 ч в гибридизационном буфере, содержащем 6 х NET [0,9 моль/л NaCl; 0,09 моль/л трис-HCl (рН 7,5) и 6 миллимоль/л ЭДТА] 5 х раствор Денгардта (Denhardt), 0,1% SDS и 0,1 мг/мл денатурированной ДНК (тимуса теленка). После этого гибридизацию проводили в течение ночи при 56^оС в гибридизационном буфере (его рецепт см. выше), содержащем 1x10⁶ счетов в минуту/мл радиоактивного меченного зонда (IWQ). После окончания реакции бумагу 541 дважды промыли раствором 6 х SSC (содержащим 0,1% SDS) в течение 30 мин при комнатной температуре, затем промыли при 56^оС в течение 1,5 мин. Промытую бумагу 541 затем подвергали авторадиографии.

Плазмиду отделили от положительных клонов и подвергали пятнообразованию по Саузерну (Southern) c зондом (IWQ). Гибридизацию и авторадиографию проводили при тех же самых условиях, какие описаны выше.

Аналогично пятнообразование по Саузерну проводили с зондом (А). Используя гибридизационный буфер, имеющий указанный выше состав, гибридизацию проводили сначала при 49^оС в течение 1 ч. После остывания до 39^оС продолжали затем гибридизацию при этой температуре в течение 1 ч. После окончания реакции нитроцеллюлозный фильтр дважды промыли 6 SSC, содержащим 0,1% SDS, в течение 30 мин при комнатной температуре, а затем промыли при 39^оС в течение 3 мин. Промытую бумагу затем подвергали авторадиографии. моль/л трис-НСl (рН 8) в течение 3 мин и раствором лизоцима 1,5 мг/мл [содержащим 0,05 моль/л трис-НСl (рН 8) и 25% сахарозы] в течение 10 минут, затем при 37^оС проводили обработки раствором 1 х SSC (0,15 моль/л NaCl и 0,015 моль/л цитрата натрия) в течение 2 мин и раствором 1х SSC, cодержащим 200 мкг/мл протеиназы К, в течение 30 мин, наконец, при комнатной температуре проводили обработки раствором 1 х SSC в течение 2 мин и раствором 95% этанола в течение 2 минут. Конечную стадию повторяли дважды. После этого бумагу 541 высушили. Высушенную бумагу 541 погружали в смесь 25:24:1 фенола/хлороформа/изоамилового спирта [уравновешенную 100 миллимоль/л трис-НСl (рН 8,5), 100 ммоль/л NaCl и 10 ммоль/л ЭДТА] на 30 мин при комнатной температуре. Затем аналогичные процедуры повторяли три раза с раствором 5 х SSC в течение 3 мин, затем дважды с 95% этанольным раствором в течение 3 минут. После этого высушили фильтровальную бумагу.

Зонд (IWQ) пометили меченным атомом ³²Р в соответствии с известными способами (см. Molecular Cloning), и гибридизацию колоний осуществляли по методу Wallace et al. [Nucleic Acids Res. 9, 879 (1981)] Предгибридизацию проводили при 65^оС в течение 4 ч в гибридизационном буфере, содержащем 6 х NET [0,9 моль/л NaCl; 0,09 моль/л трис-HCl (рН 7,5) и 6 миллимоль/л ЭДТА] 5 х раствор Денгардта (Denhardt), 0,1% SDS и 0,1 мг/мл денатурированной ДНК (тимуса теленка). После этого гибридизацию проводили в течение ночи при 56^оС в гибридизационном буфере (его рецепт см. выше), содержащем 1x10⁶ счетов в минуту/мл радиоактивного меченного зонда (IWQ). После окончания реакции бумагу 541 дважды промыли раствором 6 х SSC (содержащим 0,1% SDS) в течение 30 мин при комнатной температуре, затем промыли при 56^оС в течение 1,5 мин. Промытую бумагу 541 затем подвергали авторадиографии.

Плазмиду отделили от положительных клонов и подвергали пятнообразованию по Саузерну (Southern) c зондом (IWQ). Гибридизацию и авторадиографию проводили при тех же самых условиях, какие описаны выше.

Аналогично пятнообразование по Саузерну проводили с зондом (А). Используя гибридизационный буфер, имеющий указанный выше состав, гибридизацию проводили сначала при 49^оС в течение 1 ч. После остывания до 39^оС продолжали затем гибридизацию при этой температуре в течение 1 ч. После окончания реакции нитроцеллюлозный фильтр дважды промыли 6 х SSC, содержащим 0,1% SDS, в течение 30 мин при комнатной температуре, а затем промыли при 39^оС в течение 3 мин. Промытую бумагу затем подвергали авторадиографии.

В результате было найдено, что единственный клон является положительным. Определение последовательности нуклеотидов с помощью дидезокси-способа показало, что этот клон имел ДНК, состоящую из 308 пар оснований, содержащую части как зонда (IWQ), так и зонда (А), рB R 322-производную плазмиду, содержащую эту вставку, назвали рНСS-1.

П р и м е р 9. Направленный отбор библиотеки линии λ -фага с помощью зонда рНСS-1 ДНК.

Гибридизацию пятен проводили по способу Бентона и Дэвиса (Benton and Davis [Science, 196,180(1977)] рНСS-1, полученную в примере 8, обработали Sau3A и ЕСORI, чтобы получить фрагмент ДНК примерно 600 пар оснований. Этот фрагмент ДНК пометили радиоактивной меткой с помощью меченой трансляции по обычным методикам. Нитроцеллюлозный фильтр (S&S) пометили на фаговое пятно, растущее на агаровой среде, чтобы перевести фаги на фильтр. После денатурации ДНК фага с помощью 0,5 моль/л NaOH, фильтровальную бумагу обработали следующими способами: обработка 0,1 моль/л NaOН и 1,5 моль/л NaCl в течение 20 с, две обработки 0,5 моль/л трис-НСl (рН 7,5) и 1,5 моль/л NaCl в течение 20 с, наконец, обработка 120 ммоль/л NaCl, 15 ммоль/л цитрата натрия, 13 ммоль/л KH₂PO₂ и 1 ммоль/л ЭДТА (рН 7,2) в течение 20 с.

Фильтр затем высушили и нагревали при 80^оС в течение 2 ч, чтобы иммобилизовать ДНК. Предгибридизацию проводили в течение ночи при 42^оС в предгибридизационном буфере, содержащем 5 х SSC, 5 х раствор Денгардта, 50 ммоль/л фосфатного буфера, 50% формамида, 0,25 мг/мл денатурированной ДНК (ДНК из спермы лосося) и 0,1% SDS. После этого гибридизацию проводили при 42^оС в течение 20 ч в гибридизационном буфере, содержащем 4 х10⁵ счетов в минуту/мл зонда pНСS-1, который был помечен радиоактивной меткой с помощью меченной трансляции. Этот гибридизационный буфер представлял собой смесь 5 х SSC, 5 х раствора Денгардта, 20 ммоль/л фосфатного буфера (рН 6,0), 50% формамида, 0,1% SDS, 10% декстрансульфата и 0,1 мг/мл денатурированной ДНК (ДНК из спермы лосося).

Гибридизованный нитроцеллюлозный фильтр промывали в течение 20 мин 2 х SSC, содержащим 0,1% SDS, при комнатной температуре, затем в течение 30 мин с помощью 0,1 х SSC, содержащего 0,1% SDS при 44^оС, и наконец, в течение 10 мин с помощью 0,1 х SSC при комнатной температуре. Затем проводили детектирование с помощью авторадиографии.

В результате получили пять положительных клонов (G1-G5) Клон, содержащий "полномерную" кДНК, подвергали проверке для определения нуклеотидной последовательности его ДНК посредством дидезокси-способа, и была идентифицирована нуклеотидная последовательность, показанная на фиг. 3-5. Эту кДНК вырезали из вектора λ gt и присоединили к pBR 327 (Soberon et al. Gene, 9, 287 (1980)] в сайте ЕсoRI, чтобы получить плазмиду, которую можно получать в больших масштабах. Эту плазмиду назвали pBRG4.

П р и м е р 10. Направленный отбор библиотеки линии λ -фаза с помощью зонда pBRG4 и зонда (LC)
Гибридизацию пятна проводили по способу Бентона и Дэвиса (см. там же Science), использованному в примере 9. Нитроцеллюлозный фильтр (S&S) поместили на пятно растущего фага на анаровой среде, чтобы перевести фаги на фильтр. После денатурации фаговой ДНК с помощью 0,5 моль/л NaOН фильтр обработали следующими способами: обработка с помощью 0,1 моль/л NaOН и 1,5 моль/л NaСl в течение 20 с, затем две обработки с помощью 0,5 моль/л трис-НСl (рН 7,5) и 1,5 моль/л NaCl в течение 20 с, ноконец обработка с помощью 120 ммоль/л NaCl, 15 ммоль/л цитрата натрия, 13 ммоль/л КН₂PO₄ и 1 ммоль/л ЭДТА (рН 7,2) в течение 20 с. Фильтр затем высушили и нагревали при 80^оС в течение 2 ч, чтобы иммобилизовать ДНК. Два листа одного и того же фильтра приготовили описанным выше способом и подвергли их направленному отбору с помощью зонда рBRG4 выведенной ДНК и зонда (LC).

Направленный отбор с помощью зонда pBRG4-выведенной ДНК проводили следующим способом. рBRG4-обработали ЕсoRI, чтобы получить фрагмент ДНК примерно 1500 пар оснований. Этот фрагмент ДНК пометили радиоактивной меткой с помощью меченной трансляции в соответствии с обычными методами. Один из двух нитроцеллюлозных фильтров подвергали предгибридизации в течение ночи при 42^оС в предгибридизационном буфере, содержащем 5 х SSC, 5 х раствора Денгардта, 50 ммоль/л фосфатного буфера, 50% формамида, 0,25 мг/мл денатурированной ДНК (ДНК из спермы лосося) 0,1% SDS. После этого фильтр подвергали гибридизации при 42^оС в течение 20 ч в гибридизационном буфере, содержащем меченный радиоактивной меткой зонд ДНК (примерно 1 х 10⁶ счетов в минуту/мл) примерно 1500 пар оснований. Этот гибридизационный буфер представлял собою смесь 5 х SSC, 5 х раствор Денгардта, 20 ммоль/л фосфатного буфера (рН 6,0), 50% формамида, 0,1% SDS, 10% декстрансульфата и 0,1 мг/мл денатурированной ДНК (ДНК из спермы лосося). Гибридизованный нитроцеллюлозный фильтр промыли в течение 20 мин 2 х SSC cодержащим 0,1% SDS, при комнатной температуре, затем в течение 30 минут, 0,1 х SSC, содержащим 0,1% SDS, при 44^оС, и наконец, в течение 10 мин с помощью 0,1 SSC при комнатной температуре. Затем проводили детектирование с помощью авторадиографии.

Направленный отбор с помощью зонда (LC) осуществляли следующим образом. Другой фильтр предварительно обработали 3хSSC, cодержащим 0,1% SDS, при 65^оС в течение 2 ч. Затем проводили предгибридизацию при 65^оС в течение 2 ч в растворе, содержащем 6 х NEТ, 1 х раствор Денгардта и 100 мкг/мл денатурированной ДНК (ДНК из спермы лосося). Затем проводили гибридизацию в течение ночи при 63^оС в гибридизационном буфере, содержащем меченный радиоактивной меткой зонд (LC) (2 х 10⁶ счетов в мин/мл). Этот гибридизационный буфер также представлял собой смесь 6 х NEТ, 1 х раствор Денгардта и 100 мкг/мл денатурированной ДНК (ДНК из спермы лосося). Гибридизованный нитроцеллюлозный фильтр промыли три раза (каждый раз по 20 мин) 6 х SSC, содержащим 0,1% SDS, при комнатной температуре, затем промыли 6 х SSС, содержащим 0,1% SDS, при 63^оС в течение 2 мин.

Фильтр высушили, и дезактивирование осуществляли с помощью авторадиографии.

В описанном выше направленном отборе отбирали клоны, которые были положительны к обоим зондам, и клон, содержащий "полномерную" кДНК, подвергали проверке для определения ее нуклеотидной последовательности с помощью дидезокси-способа. Было найдено, что она имела нуклеотидную последовательность, показанную на фиг. 8-10. Эту кДНК вырезали из вектора λgt 10 и присоединили к pBR 327 в сайте ЕсоRI чтобы получить плазмиду pBКU 2.

П р и м е р 11. Направленный отбор библиотеки человеческого хромосомного гена.

1/Построение библиотеки человеческого хромосомного гена
Библиотеку человеческого хромосомного гена, полученную благодаря любезности доктора Манятиса из Гарвардского университета, приготовили следующим образом: всю хромосомную ДНК экстрагировали из печени эмбриона человека с помощью фенола или других подходящих химических реагентов и подвергли частичному перевариванию с рестриктазами Hae III и AluI, полученные фрагменты ДНК обработали центрифугированием в градиенте плотности сахарозы, чтобы сконцентрировать фрагменты, имеющие длины цепей примерно 18-25 тысяч оснований, сконцентрированные фрагменты присоединили к плечу ДНК Е.coli фага λ Сharon 4А, причем вставили короткоцепные синтетические нуклеотиды, имеющие сайты расщепления рестриктазой ЕсoRI с тем, чтобы получить инфекционные фаговые ДНК-рекомбинанты, с целью получения повышенной инфекционности, при упаковке получили больше очищенных частиц λ -фага. Теоретически считается, что полученная таким образом библиотека человеческого гена представляет собой набор рекомбинантов, содержащих человеческие ДНК с длинами цепей 18-25 тысяч оснований, которые содержат практически все человеческие гены.

2) Направленный отбор библиотеки человеческого хромосомного гена с помощью зонда рНСS-1 ДНК.

Гибридизацию пятен проводили по способу Бентона и Дэвиса [Science, 196,180(1977)] pНСS-1, полученную в примере 8, обработали Sau3A и ЕсoRI, чтобы получить фрагмент ДНК примерно 600 пар оснований. Этот фрагмент ДНК пометили радиоактивной меткой с помощью меченной трансляции по известным методикам. Нитроцеллюлозный фильтр (S&S) поместили на фаговое пятно, растущее на агаровой среде, чтобы перенести фаги на фильтр. После денатурации фаговой ДНК с помощью 0,5 моль/л NaOH, фильтровальную бумагу обработали следующими способами: обработка 0,1 моль/л NaOН и 1,5 моль/л NaCl в течение 20 с, две обработки 0,5 моль/л трис-НСl (рН 7,5) и 1,5 моль/л NaCl в течение 20 с, наконец, обработка 120 ммоль/л NaCl, 15 ммоль/л цитратом натрия, 13 ммоль/л КН₂PO₄ и 1 ммоль/л ЭДТА (рН 7,2) в течение 20 с.

Фильтр затем высушили и нагревали при 80^оС в течение 2 ч, чтобы иммобилизировать ДНК. Предгибридизацию проводили в течение ночи при 42^оС в предгибридизационном буфере, содержащем 5 х SSC, 5 х раствор Денгардта, 50 ммоль/л фосфатного буфера, 50% формамида, 0,25 мг/мл денатурированной ДНК (ДНК из спермы лосося) и 0,1% SDS. После этого гибридизацию проводили при 42^оС в течение 20 ч в гибридизационном буфере, содержащем 4 х 10⁵ счетов в минуту/мл зонда рНСS-1, который был радиоактивно помечен с помощью меченной трансляции. Этот гибридизационный буфер представляет собой смесь 5 х SSC, 5 х раствор Денгардта, 20 ммоль/л фосфатного буфера (рН 6,0), 50% формамида, 0,1% SDS, 10% декстрансульфата и 0,1 мг/мл денатурированной ДНК (ДНК из спермы лосося).

Гибридизованный нитроцеллюлозный фильтр промывали в течение 20 мин 2 х SSC, содержащим 0,1% SDS, при комнатной температуре, затем в течение 30 мин, 0,1 х SSC, cодержащим 0,1% SDS при 44^оС, и, наконец, в течение 10 мин 0,1 х SSC при комнатной температуре. Затем проводили детектирование с помощью авторадиографии.

В результате получили десять случайных положительных клонов. Рекомбинантные ДНК получили из этих клонов по методу Манятиса [Maniatic, Cell, 15, 687 (1978)] Полученные ДНК обработали рестриктазами, такими как ЕсoRI, BamHI и Bgl II, проанализировали с помощью агарозного гель-электрофореза, и получили их рестриктазную карту по способу Фриша с сотр. [Fritsh et al. Сell, там же)]
Гибридизацию по Саутерну проводили с помощью зонда, представляющего собой меченный радиоактивной меткой рНСS-1 выведенный фрагмент ДНК, который был таким же, какой использовали в вышеописанных способах направленного отбора. Фрагмент ДНК примерно 8 тысяч пар оснований, вырезанный с помощью ЕсoRI, отобрали из клонов, которые гибридизовались с зондом. Этот фрагмент субклонировали к сайту ЕсоRI pНR327. Субклонированную ДНК подвергали другой обработке рестриктазами, и повторно проводили гибридизацию по Саутерну. Найдено, что фрагмент ДНК примерно 4 тыс. пар оснований, вырезанный с помощью ЕсoRI и ХhoI, содержал ген, кодирующий полипептид человеческого Г-КСФ. Этот фрагмент подвергали проверке для определения последовательности его части длиной примерно 3 тыс. пар оснований с помощью дидезокси-способа, была определена нуклеотидная последовательность, показанная на фиг. 13-17. Этот фрагмент ДНК имел сайты расщепления рестриктазой, показанные на фиг.19.

Направленный отбор человеческих хромосомных генов проводили, используя также pBRG4 выведенную ДНК и pBRV-2-выведенную ДНК в качестве зондов. В каждом случае фрагмент ДНК в 1500 пар оснований, уже обработанный ЕсoRI был непосредственно радиоактивно помечен с помощью меченной трансляции вышеописанным способом, либо альтернативно фрагмент ДНК примерно 700 пар оснований, полученный последовательными обработками ЕсoRI и DraI, пометили радиоактивной меткой с помощью меченной трансляции. Полученный таким образом зонд использовали в способе гибридизации пятен, который проводили при тех же самых условиях, какие описаны выше. Отобранные клоны анализировали посредством гибридизации по Саузерну с тем, чтобы получить фрагмент ДНК, имеющий нуклеотидную последовательность, показанную на фиг.13-17. Полученную таким образом плазмиду назвали pBRCE3 β.

П р и м е р 12. Построение Е.сoli рекомбинантного вектора и трансформация (с использованием tac-промоторсодержащего вектора)
1) Построение рекомбинантного вектора
1) Получение вектора
5 мкг tac-промотор-содержащего вектора рКК223-3 (Pharmacia) обработали 8 единицами ЕсoRI (Тakara Shuzo Co. Ltd.) в течение 2 ч при 37^оС в 30 мкл реакционного раствора (40 ммоль/л трис-HCl, 7 ммоль/л MgCl₂, 100 ммоль/л NaCl и 7 ммоль/л 2-меркаптоэтанола). Затем добавили 3 мкл щелочной фосфатазы (Takara Shuzo Co. Ltd.), и обработку проводили при 60^оС в течение 30 мин. Фрагмент ДНК выделили путем трех обработок фенолом, одной обработкой эфиром и осаждением этанолом, причем все обработки проводили обычным образом.

Выделенный фрагмент ДНК растворили в 50 мкл смеси, состоящей из 50 ммоль/л трис-НСl, 5 ммоль/л 10 ммоль/л DТТ и по 1 ммоль/л каждого из d АТФ, dЦТФ, dГТФ и dТТФ. После добавления 3 мкл Е.coli-ДНК-полимеразы 1-фрагмента Кленоу (Takara Shuzo Co. Ltd.), реакцию проводили при 14^оС в течение 2 ч, чтобы создать тупые концы.

(II) Получение синтетического линкера.

3 мкг олигонуклеотидов, имеющих последовательности синтетических линкеров ЦГААТГАЦЦЦЦЦЦТГГГЦЦ и ЦАГГГГГГТЦАТТЦГ, фосфорилировали путем проведения реакции в 40 мкл реакционного раствора (состоящего из 50 ммоль/л трис-НСl, 10 ммоль/л MgCl₂, 10 ммоль/л 2-меркаптоэтанола и 1 ммоль/л AТФ) при 37^оС в течение 60 мин в присутствии 4 единиц Т₄ полинуклеотид-киназы.

Каждый фосфорилированных олигонуклеотидов (0,2 мкг) растворили в 20 мкл 100 ммоль/л NaCl содержащего раствора ТЕ [10 ммоль/л трис-НСl (рН 8,0) и 1 ммоль/л ЭДТА] После обработки при 65^оС в течение 10 мин олигонуклеотиды ренатурировали путем медленного охлаждения до комнатной температуры.

(III) Получение КДНК фрагмента Г-КСФ
Шестьдесят микрограммов рB RG4, полученной в примере 9, которая содержала КДНК, показанную на фиг.3-5, обработали 100 единицами рестриктазы АpaI (New Еngland Biolabs) и 50 единицами Dra I (Takara Shuzo Cо. Ltd.) при 37^оС в течение 3 ч в 200 мкл реакционного раствора, состоящего из 6 ммоль/л трис-НСl, 6 ммоль/л MgCl₂ и 6 ммоль/л 2-меркаптоэтанола. Примерно 2 мкг фрагмента АраI-DraI (примерно 590 пар оснований) выделили с помощью 1,2% агарозного гель-электрофореза.

(IV) Cвязывание фрагментов.

Примерно 0,1 мкг каждого из фрагментов, полученных в стадиях (I)-(III), растворили в 20 мкл связывающего раствора (66 ммоль/л трис-НСl, 6,6 ммоль/л MgCl₂, 10 ммоль/л DТТ и 1 ммоль/л ATФ). После добавления 175 единиц Т₄ ДНК-лигазы раствор выдерживали в течение ночи при 4^оС, чтобы получить рекомбинантный вектор (фиг.20).

2) Трансформация.

Используя 20 мкл реакционного раствора, содержащего рекомбинантный вектор, полученный в (IV), трансформировали штамм Е.coli JM105 путем обработки хлоридом рубидия (см. Т. Maniatis et al. Molecular Cloning, р. 252 (1982)] Плазмиду выделили из культуры устойчивости к ампициллину колонии трансформантов и обработали рестриктазами BamHI, АссII и ApaI, чтобы подтвердить получение нужных трансформантов.

П р и м е р 13. Построение рекомбинантного вектора Е.Coli (+VSE) и трансформации (с использованием PL-промотор-содержащего вектора).

1) Построение рекомбинантного вектора.

1) Получение вектора.

Cто микрограммов PL-промотор-содержащего вектора PL-ламбда (Pharmacia) обрабатывали в течение ночи при 37^оС с помощью 50 единиц рестриктазы BamHI и 100 мкл реакционного раствора [10 ммоль/л трис-НСl (рН 7,6), 7 ммоль/л MgCl₂, 100 ммоль/л NaCl и 10 ммоль/л DТТ] Подвергая реакционный раствор 1% агарозному гель-электрофорезу, выделили примерно 49 мкг фрагмента длиной 4 тысячи оснований и примерно 11 мкг фрагмента примерно 1,2 тыс. оснований.

Фрагмент 4 тыс.оснований растворили в 100 мкл ТЕ буфера (см. выше состав) и подвергли ее дефосфорилированию путем реакции с щелочной фосфатазой (Тakara Shuzo Co. Ltd.) при 60^оС в течение 60 мин.

Другой фрагмент длиной примерно 1,2 тыс. оснований, растворили в 20 мкл буфера (10 ммоль/л трис-НСl, 10 ммоль/л MgCl₂, 6 ммоль/л KCl и 1 ммоль/л DТТ) и обрабатывали в течение ночи с 20 единицами рестриктазы и Mbo II (New Еngland Biolabs) при 37^оС.

Путем гель-электрофореза 4% полиакриламидного геля выделяли примерно 0,9 мкг Bam HI-Mbo II фрагмента (примерно 200 пар оснований) и примерно 1,9 мкг MboII-BamHI фрагмента (примерно 310 пар оснований).

(II) Получение синтетического линкера.

Олигонуклеотиды, имеющие последовательности синтетических линкеров ТААГГАГАТТЦАТЦГАТ и ТЦГАТГААТТЦТЦЦТТАГ, подвергали фосфорилированию и ренатурации, как в (II) в примере 12, с тем, чтобы приготовить синтетический S/D линкер.

(III) Получение вектора экспрессии.

Одну десятую микрограмма фрагмента длиной примерно 4 тыс. оснований, 0,05 мкг каждого BamHI-MboII фрагмента, имеющего участок O_LP_L и Mbо II BamHI фрагмента, имеющего участок tL1 [три фрагмента получили в (1)] и 0,1 мкг ренетурированного синтетического S/D линкера, полученного в (II), подвергали реакции в течение ночи при 12^оС в 40 мкл реакционного раствора (66 ммоль/л трис-НСl, 6,6 ммоль/л MgCl₂, 10 ммоль/л ДТТ и 1 ммоль/л AТФ) в присутствии 175 единиц Т₄ ДНК-лигазы (Тakara Shuzo Co. Ltd.). Двадцать микролитров реакционного раствора использовали для трансформации штамма N99Cl⁺ Е.сoli (Pharmacia) по методу с использованием хлорида кальция (см. там же Molecular Cloning).

Культивировали трансформанты и выделяли плазмиду из культуры их колоний, которые были устойчивы к ампициллину. Обработка плазмиды рестриктазами ЕсoRI BamHI и SмaI показала, что это была целевая плазмида.

Два микрограмма этой плазмиды контактировали с рестриктазой СlaI (New Еngland Biolabs) при 37^оС в течение 2 ч в 20 мкл буфера (10 ммоль/л трис-НСl, 6 ммоль/л MgCl₂ и 50 ммоль/л (NaCl). После этого фермент инактивировали путем нагревания при 65^оС в течение 10 мин.

Один микролитр реакционного раствора контактировали в течение ночи при 12^оС с 175 единицами Т₄ ДНК-лигазы [Тakara Shuzo Co. Ltd.) в связывающем растворе, имеющем вышеописанный состав. Затем реакционный раствор использовали для трансформации штамма N 99 Cl⁺ Е. сoli (Pharmacia). Плазмиду выделили из культуры устойчивых к ампициллину колоний трансформаторов и обработки ЕсоRI и BamНI, чтобы подтвердить что указанная плазмида является нужной плазмидой.

(IV) Получение рекомбинантного вектора и трансформаторов, экспрессующих Г-КСФ.

Плазмиду экспрессии, полученную в (III), обработали рестриктазой СlaI. После создания тупых концов плазмиду затем обработали как в примере 12, чтобы получить рекомбинантный вектор с вставкой КДНК фрагмента Г-КСФ. Этот вектор использовали для трансформации штамма N 4830 Е.сoli (Pharmacia Fine Chemicals) по способу с использованием хлорида кальция, описанному в Molecular Cloning (cм.выше) Отождествление нужных трансформантов производили, как в примере 12 (фиг.21-22).

П р и м е р 14. Построение Е.coli-рекомбинантного вектора (+VSЕ) и тронсформация (с использованием trp-промотор-содержащего вектора).

1) Построение рекомбинантного вектора.

1) Получение вектора.

Плазмиду pOY1 получили путем вставки триптофанного промотора, содержащего фрагмент HpaII-ТagI (примерно 330 пар оснований) в pBR322 в сайт СlAl. Десять микрограммов этой плазмиды обработали 7 единицами рестриктазы СlAl и 8 единицами Pvu II при 37^оС в течение 3 ч в 30 мкл реакционного раствора, состоящего из 10 ммоль/л трис-НСl, 6 ммоль/л MgCl₂ и 50 ммоль/л NaCl.

Затем добавили 2 мкл щелочной фосфатазы (Тakara Shuzo Co.0, Ltd.) и реакцию проводили при 60^оС в течение 1 ч.

Фрагмент ДНК (примерно 2,5 мкг) примерно 2,6 тыс. оснований длиной выделили из реакционного раствора путем гельэлектрофореза 1% агарозного геля.

(II) Получение синтетического линкера.

Олигонуклеотиды, имеющие последовательности синтетических линкеров ЦГЦГААТГАЦЦЦЦЦЦТГГГЦЦ и ЦАГГГГГГТЦАТТЦГ, фосфорилировании и ренатурировали, как в (II) в примере 12, с тем, чтобы получить синтетический линкер.

(III) Получение рекомбинантного вектора.

Примерно 1 мкг векторного фрагмента, полученного в (I), примерно 1 мкг синтетического линкера, полученного в (II), и примерно 1 мкг фрагмента ДНК Г-КСФ, полученного в (III) в примере 12, контактировали с 175 единицами Т₄ ДНК-лигазы в течение ночи при 12^оС в 20 мкл связывающего раствора, имеющего состав, описанный в примере 12,1) (IV), с тем, чтобы получить рекомбинантный вектор (фиг.23).

2) Трансформация.

Двадцать микролитров реакционного раствора, полученного в (III), использовали для трансформации Е.сoli DНI по методу с использованием хлорида рубидия, описанного выше в Molecular Cloning.

Как и в примере 12, плазмиду выделили из устойчивых к ампициллину колоний трансформантов, и обработали эту плазмиду рестриктазами АpaI, Dra I, NruI и Pst I, что показало, что получены нужные трансформанты.

П р и м е р 15. Культивирование трансформантов.

1) Культивирование трансформантов (с tac), полученных в примере 12.

Трансформанты культивировали в течение ночи при 37^оС и 1 мл культуры добавили к 100 мл среды Луриа (Luria), содержащей 25 мкг/мл или 50 мкг/мл ампициллина. Культивирование проводили в течение 2-3 ч при 37^оС.

Культивирование проводили при 37^оС в течение 2-4 ч после добавления изопропил- -D-тиогалактозиды, чтобы получить конечную концентрацию 2 ммоль/л.

2) Культивирование трансформантов (с P_L), полученных в примере 13.

Трансформанты культивировали в течение ночи при 28^оС и 1 мл культуры добавили к 100 мл среды Луриа (Luria), содержащей 25 или 50 мкг/мл ампициллина. Культивирование осуществляли примерно в течение 4 ч при 28^оС.

Культивирование продолжали в течение 2-4 ч при 42^оС.

3) Культивирование трансформантов (с trp), полученных в примере 14.

Трансформанты культивировали в течение ночи при 37^оС, и 1 мл культуры добавили к 100 мл среды М9, содержащей 0,5% глюкозы, 0,5% казаминокислот (Сasamino acids (Difco)) и 25 или 50 мкг/мл ампициллина. Культивирование проводили в течение 4-6 ч при 37^оС. После добавления 50 мкг/мл 3-β -индолакриловой кислоты (IAA), культивирование продолжали в течение 4-9 ч при 37^оС.

П р и м е р 16. Выделение и очистка полипептида Г-КСФ из Е.coli
1) Выделение.

Три вида трансформантов, культивированных в примере 15, подвергали следующим способам выделения.

Культуру (100 мл) подвергали центрифугированию, чтобы получить клеточный осадок после центрифугирования, который суспендировали в 5 мл смеси 20 миллимоль/л трис-НСl (рН 7,5) и 30 миллимоль/л NaCl.

Затем добавили 0,2 моль/л фенилметилсульфонилфторида 0,2 моль/л ЭДТА, чтобы получить концентрации, соответственно 1 ммоль/л, 10 ммоль/л и 0,2 мг/мл, и суспензию ставили на 30 мин при 0^оС.

Клетки лизировали с помощью трех циклов замораживания/оттаивания, после чего желательно обработать ультразвуком. Лизат центрифугировали, чтобы получить надосадочную жидкость. Альтернативно, лизат обработали 8 моль/л гуанидинхлоргидрата так, что конечная его концентрация стала 6 моль/л гуанидинхлоргидрата, после чего провели центрифугирование при 30000 оборотов в минуту в течение 5 ч и выделили надосадочную жидкость.

2) Очистка
(I) Надосадочную жидкость, полученную в 1), подвергали гель-фильтрации на колонке Ultrogel AcA54 (диаметром 4,6 мм, длиной 90 см, LKB) при скорости потока примерно 50 мл/ч с использованием 0,01 моль/л трис-НСl буфера (рН 7,4), содержащего 0,15 моль/л NaCl и 0,01% Твин 20 (Nakai Kagaku Co. Ltd.).

Отобрали фракции, которые проявляли активность при анализе способом определения колониистимулирующей активности (b) (описанным ранее в этом описании), и их сконцентрировали до объема примерно 5 мл с помощью устройства для ультрафильтрации рМ-10 (Аmicon).

(II) К cконцентрированным фракциям добавили н-пропанол (чистоты, пригодной для определения аминокислотной последовательности, Тokyo Kasei Co. Ltd. ) и трифторуксусную кислоту, и смесь обработали так, чтобы конечные концентрации н-пропанола и трифторуксусной кислоты составляли 30 и 0,1% соответственно. Обработанную смесь оставили во льду примерно на 15 мин и подвергали центрифугированию при 15000 оборотах в минуту в течение 10 мин, чтобы удалить осадок. Надосадочную жидкость адсорбировали на колонке μ -Bondapak C18 (полупрепаративного сорта; Waters; 8 ммх х30 см), которую уравновешивали водным раствором, содержащим н-пропанол (см. выше) и трифторуксусную кислоту. Колонку непрерывно элюировали водным раствором 0,1% трифторуксусной кислоты, содержащей н-пропанол с линейным градиентом плотности 30-60% Используя "Хитачи" модель 685-50 (жидкостный хроматограф высокого давления фирмы "Хитачи"), "Хитачи" модель 638-41 (детектор фирмы "Хитачи"), одновременно измеряли величины поглощения на длинах волн 220 и 280 нм. После элюирования 10 микролитровую оликвоту каждой фракции разбавляли в 100 раз, и разбавленные растворы подвергали отбору для поиска активных фракций по способу определения колониистимулирующей активности (b). Активность наблюдали в пиках, которые элюировали при 40% н-пропанола. Эти пики смешали и повторно хроматографировали при тех же самых условиях, какие использовали выше, и фракции подвергали проверке для определения их активности по способу (b). Опять активность была найдена в пиках при 40% н-пропанола. Эти активные пики собрали (четыре фракции 4 мл) и высушили вымораживанием.

(III) Высушенный вымораживанием порошок растворили в 200 мкл водного раствора 0,1% трифторуксусной кислоты, содержащего 40% н-пропанола, и раствор подвергали жидкостной хроматографии высокого давления на колонке ТSK-G300 SW (7,5 мм х 60 см, Тoyo Soda Manufacturins Co. Ltd.). Элюирование осуществляли при скорости потока 0,4 мл/мин водным раствором 0,1% трифторуксусной кислоты, содержащим 40% н-пропанол, и фракции по 0,4 мл собрали с помощью коллектора фракций FRAC-100 (Pharmacia Fine Chemicals). Эти фракции проверили описанным выше способом анализа колониистимулирующей активности, и выделили активные фракции. Затем их очищали на аналитической колонке μ -Bondapak C18 (4,6 мм х 30 см), и выделили основной пик и высушили вымораживанием.

Полученный таким образом протеин обработали 2-меркаптоэтанолом и подвергали гель-электрофорезу с SDS-полиакриламидным гелем (15,0%) (15 мВ, 6 ч). При окрашивании красителем Сoomassie Blue нужный полипептид Г-КСФ можно было идентифицироват в виде единственной полосы.

П р и м е р 17. Определение активности Г-КСФ (+VSE).

Образец КСФ, полученный в примере 16, анализировали способом анализа КСФ(а), описанным ранее в этом описании. Результаты приведены в табл.1.

П р и м е р 18. Аминокислотный анализ (+VSЕ)
1) Анализ аминокислотного состава
Образец КСФ, очищенный в примере 16, гидролизовали обычными способами, и аминокислотный состав протеиновой части гидролизата анализировали способом аминокислотного анализа с помощью автоматического аминокислотного анализатора "Хитачи 835" (фирмы "Хитачи"). Результаты приведены в табл.2. Гидролиз проводили при следующих условиях: (I) 6 н. раствор НСl 110^оС, 24 часа в вакууме, (II) 4 н. раствор метансульфокислоты + 0,2% 3-(2-аминоэтил) индола, 110^оС, 24 ч, 48 ч, 72 ч в вакууме.

Образец растворили в растворе (1,5 мл), содержащем 40% н-пропанола и 0,1% трифторуксусной кислоты. Аликвоты массой по 0,1 мл высушили с помощью сухого газообразного азота и после добавления реагентов, перечисленных в (I) или в (II), емкости герметически закрыли в вакууме, после чего проводили гидролиз содержимого.

Каждая из величин, приведенных в табл.2, представляла собой среднее значение из четырех измерений, величины для 24 ч для (I) и величины для 24,48 и 72 ч для (II), за исключением того, что содержания Тpe, Ceр, 1/2 Цис, Meт, Вал, Иле и Трп рассчитывали с помощью следующих способов (см. "Тampaku Kagaku (Protein Chemistry) II", A Course in Biochemical Ехperiments, Тokyo Kagaku Dohjin):
Для Тре, Сер, 1/2 Цис и Мет кривую зависимости от времени величин для 24, 48 и 72 ч для (I) экстрагировали к нулю часов.

Для Вал и Иле использовали величину для 72 ч для (II).

Для Трп использование: среднее значение величин для 24,48 и 72 ч для (II).

2/ Анализ N концевых аминокислот
Образец подвергали разложению по Эдману с помощью газофазного определителя последовательности (фирмы "Aпплайд" Биосистемз"), и полученную РТН-аминокислоту анализировали обычными способами с помощью жидкостного хроматографа высокого давления (фирмы Бекмен инструментс") и колонки Ultrasphere-ODS (фирмы "Бекмен инструментс"). После того, как колонку (5 микрон, диаметр 4,6 мм х длина 250 мм) уравновесили исходным буфером [водный раствор, содержащий 15 ммоль/л натрий-ацетатного буфера (рН 4,5) и 40% ацетонитрила] инжектировали образец (растворенный в 20 мкл исходного буфера) и осуществляли разделение при изократическом элюировании исходным буфером. Во время этих стадий поддерживали скорость потока 1,4 мл/мин и температуру колонки 40^оС. Детектирование РТН-аминокислоты осуществляли, измеряя величины поглощения в ультрафиолетовой области спектра на длинах волн 269 нм и 320 нм. Стандартные образцы (весом по 2 нмоль) РТН-аминокислоты ("Сигма") разделяли на той же самой линии, чтобы определить их времена удерживания, которые сравнивали с временем удерживания образца с целью идентификации N-концевых аминокислот. В результате были обнаружены РТН-метионин и РТН-треонин.

П р и м е р 19. Построение Е.coli рекомбинантного вектора (-VSЕ) и трансформация
1) Использование tac-промотор-содержащего вектора.

Повторили способы примера 12, за исключением того, что "pBRG 4, полученную в примере 9, который содержала КДНК, показанную на фиг.3-5 [cм.(III) в примере 12] заменили на "pBRV2, полученную в примере 10, которая содержала КДНК, показанную на фиг. 8-10". Как и в примере 12, было подтверждено, что полученные трансформанты представляют собой нужные трансформанты фиг.24.

2) Использование PL-промотор-содержащего вектора
Повторили способы примера 13, используя КДНК (-VSЕ), и было подтверждено, что полученные трансформанты представляют собой нужные трансформанты (фиг.25-26).

3) Использование trp-промотор-содержащего вектора.

Повторили способы примера 14, используя КДНК (-VSЕ), и было подтверждено, что трансформанты представляли собой нужные трансформанты (фиг.27).

П р и м е р 20. Анализ активности Г-КСФ (-VSЕ).

Три вида трансформантов, полученных в примере 19, культивировали по способу, описанному в примере 15. Из культивированных клеток Е.coli выделили полипептиды Г-КСФ и очищали их способом, описанным в примере 16, в результате чего полипептид человеческого Г-КСФ получили в виде единственной полосы.

Полученный таким образом образец КСФ анализировали способом анализа активности КСФ(а), описанным ранее в этом описании.

Результаты приведены в табл.3.

П р и м е р 21. Аминокислотный анализ (-VSЕ)
1) Анализ аминокислотного состава.

Аминокислотный состав образца КСФ, очищенного в примере 20, анализировали по способу, описанному в 1) в примере 18. Результаты приведены в табл. 4.

2) Анализ N-концевых аминокислот,
Образец подвергали анализу N-концевых аминокислот по способу, описанному в 2) в примере 18. В результате были обнаружены РТН-метионин и РТН-треонин.

П р и м е р 22. Получение вектора рН GA410 (для использования с клетками животных, +VSЕ линия)
Фрагмент ЕсoRI, полученный в примере 9, который имел КДНК, показанную на фиг. 3-5, обрабатывали рестриктазой Dra I при 37^оС в течение 2 ч, после чего обработали с фрагментом Кленоу ДНК-полимеразы I (Тakara Shuzo Co. Ltd), чтобы создать тупые концы. Один микрограмм линкера (8 mer, Takara Shuzo Co. Ltd. ) фосфорилировали с АТФ и присоединили к отдельно полученной смеси фрагментов ДНК. Присоединенные фрагменты обработали рестриктазой Bgl II и подвергли гель-электрофорезу с агарозным гелем. Затем выделили только самый большой фрагмент ДНК.

Этот фрагмент ДНК был эквивалентен кодирующей части полипептида человеческого Г-КСФ, содержащей примерно 710 пар оснований (см.фиг.18) Вектор pdKCR [Fukunaga et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81,5086(1984)] обработали рестриктазой BamНI, а затем дефосфорилировали щелочной фосфатазой (Тakara Shuzo Co. Ltd. ). Полученный вектор ДНК присоединили к фрагменту КДНК длиной 710 пар оснований в присутствии Т₄ ДНК-лигазы (Takara Shuzo Co. Ltd.) с тем, чтобы получить рНGА410 (фиг.28). Как показано на фиг.28, эта плазмида содержала ранний ген промотора SV40, начало репликации SV40, часть гена кроличьего β -глобина, участок инициации репликации pBR322 и pBR322-выведенного β-лактамазного гена Аmp^r), причем ген человеческого Г-КСФ присоединен ниже по потоку от промотора раннего гена SV40.

П р и м е р 23. Построение рекомбинантного вектора (+VSЕ), используемого для трансформации клеток С127
1) Построение рНGA410(Н)
Двадцать микрограммов плазмиды pHGA410 (фиг.28), полученной в примере 22, растворили в реакционном растворе, состоящем из 50 ммоль/л трис-НСl (pH 7,5), 7 ммоль/л MgCl₂, 100 ммоль NaCl, 7 ммоль/л 2-меркаптоэтанола и 0,01% сыворотки бычьего альбумина (БСА). Добавили рестриктазу EcoRl (10-15 единиц; Takara Shuzo Co. Ltd.), и реакционный раствор выдерживали при 37^оС в течение примерно 30 мин, чтобы вызвать частичное переваривание Есо RI. Затем фрагмент ДНК подвергали двум обработкам с помощью 1:1 cмеси фенола/хлороформа, затем обработали эфиром и провели осаждение этанолом.

Полученный фрагмент ДНК растворили в 50 мкл раствора, состоящего из 50 ммоль/л трис-НСl, 5 ммоль/л MgCl₂, 10 ммоль/л DТТ и по 1 ммоль/л каждого из dАТФ, dЦТФ, dГТФ и dТТФ. После добавления 5 мкл фрагмента Кленоу Е.сoli ДНК-полимеразы (Тakara Shuzo Co. Ltd.) раствор инкубировали при 14^оС в течение 2 ч, чтобы создать тупые концы.

Путем последующего гель-электрофореза 0,5% агарозного геля выделили 6 мкг фрагмента ДНК длиной примерно 5,8 тыс.пар оснований.

Пять микрограммов выделенного фрагмента ДНК повторно растворили в 50 мкг реакционного раствора, состоящего из 50 ммоль трис-НСl (рН 7,6), 10 ммоль/л MgCl₂, 10 ммоль/л DТТ и 1 ммоль/л АТФ. После добавления 2 мкг линкера Hind III (Takara Shuzo Co. Ltd.) и 100 единиц Т₄ ДНК-лигазы (Тakaro Shuzo Co. Ltd.) реакцию проводили в течение ночи при 4^оС.

Затем провели обработки фенолом и эфиром и осаждение этанолом. Осадок растворили в 30 мкл раствора, состоящего из 10 ммоль/л трис-НСl (рН 7,5), 7 ммоль/л MgCl₂ и 60 ммоль/л NaCl и раствор инкубировали при 37^оС в течение 3 ч в присутствии 10 единиц Hind III. После повторной обработки Т₄ ДНК-лигазой, полученную ДНК использовали для трансформации штамма DHI Е.сoli посредством обработки с использованием хлорида рубидия (см.выше Molecular Cloning). Из устойчивых к ампициллину (Amp^v) колоний трансформантов отобрали клетки, несущие плазмиду, которая была идентична рНGAA 410 за исключением того, что Hind III был вставлен в сайт ЕсoRI. Полученную таким образом плазмиду назвали pНGA410(Н) (фиг.29).

2) Построение рекомбинантного вектора экспрессии рТN-G4
Двадцать микрограммов полученной таким образом рН GA410 (Н) растворили в 50 мкл реакционного раствора, состоящего из 10 ммоль/л трис-НСl (рН 7,5), 7 ммоль/л MgCl₂, 175 ммоль/л NaCl, 0,2 ммоль/л ЭДТА, 7 ммоль/л 2-меркаптоэтанола и 0,01% сыворотки бычьего альбумина. После добавления 20 единиц SalI (Тakara Shuzo Co. Ltd.), реакционный раствор инкубировали при 37^оС в течение 5 ч. После обработки фенолом и осаждения этанолом проводили инкубирование, как в 1), в течение примерно 2 ч при 14^оС в присутствии фрагмента Кленсу ДНК-полимеразы (Тakara Shuzo Co. Ltd.) с тем, чтобы создать тупые концы. Не проводя выделения ДНК с помощью гель-электрофореза агарозного геля, реакционный раствор сразу же подвергли осаждению этанолом. Полученный фрагмент ДНК обработали Hind III и выделили 5 г фрагмента Нind III Sal I (примерно 2,7 тыс. пар оснований) с помощью гель-электрофореза 1% агарозного геля. В отдельной стадии плазмиду pd BPV-I, имеющую вирус бычьев папилломы [эту плазмиду получили благодаря доктору Хоули, и она описана в Sarver, N, Sbyrne, J.С. Нowley, P.M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 7147-7151 (1982)] обработали с помощью Hind III и Pvu II, как описано Нагата с сотр. [Nagata et al.) [Fukunaga, Sokawa and Nagata, Proc. Natl. Асаd. Sci. USA, 81, 5086-5090(1984)] чтобы получить фрагмент ДНК длиной 8,4 тыс. оснований. Этот фрагмент ДНК 8,4 тыс. оснований и отдельно полученный Hind III-Sal I фрагмент ДНК (примерно 2,7 тыс. оснований) связывали с помощью Т₄ ДНК-лигазы. Продукт связывания использовали для трансформации штамма DHI Е.coli по способу с применением хлорида рубидия, описанному в Molecular Cloning, см.выше. Отобрали колонии Е.coli, несущие плазмиду, имеющую рНGA 410-выведенную КДНК Г-КСФ. Эту плазмиду назвали рТN-G4 (фиг.29).

Аналогично обработали аденовирус типа II [Tanpakushitsu, Kakusan, Koso (протеины, нуклеотидные кислоты и ферменты), 27 декабря 1982, Kyoritsu Shuppan] чтобы получить плазмиду ΔpVA, которая содержала SalI-Hind III фрагмент длиной примерно 1700 пар оснований, несущий VAI и VAII и фрагмент, содержащий VAI и VAII, выделили из этой плазмиды. Этот фрагмент вставили в рТNGA в сайт Hind III с тем, чтобы получить рТNG4VAα и pTNG4VAβ (фиг.29). Из-за наличия VA гена аденовируса эти плазмиды были способны увеличивать экспрессию продукта транскрипции от раннего промотора SV40.

П р и м е р 24. Трансформация клеток С127 и экспрессия в них Г-КСФ (+VSЕ).

Перед тем, как использовать для трансформации клеток мыши С127, рТN-G4, полученную в примере 23, обработали рестриктазой BamHI. Двадцать микрограммов плазмиды рТ N-G4 растворили в 100 мкл реакционного раствора [10 ммоль/л трис-НСl (рН 8,0), 7 ммоль/л MgCl₂, 100 ммоль/л NaCl, 2 ммоль/л 2-меркаптоэтанола, 0,01% бычьего сывороточного альбумина] и обработали с помощью 20 единиц Bam HI (Тakara Shuzo Co. Ltd), после чего обработали смесь фенолом и эфиром и провели осаждение этанолом.

Клетки мышей С127 выращивали в минимальной существенной среде Дульбекко, содержащей 10% сыворотки бычьего эмбриона ("Джибко"). Клетки, растущие на чашках (диаметром 5 см), трансформировали отдельной полученной ДНК, в количестве 10 мкг, на чашку, по способу с использованием фосфата кальция/(cм. Haynes, J. Weissman, С. Nuclec Асids Res. II, 687-706 (1983)] После обработки глицерином клетки инкубировали при 37^оС в течение 12 ч.

Инкубированные клетки перенесли на три новые чашки (диаметром 5 см), и среду меняли дважды в неделю. На 16-й день очаги перенесли в свежие чашки и подвергли последовательному культивированию на минимальной существенной среде Дульбекко, содержащей 10% сыворотку бычьего эмбриона ("Джибко") с тем, чтобы отобрать клоны, обладающие высокой скоростью продуцирования Г-КСФ. Эти клоны продуцировали Г-КСФ в концентрации примерно 1 мг/л. Последующее клонирование дало клоны, которые могли продуцировать Г-КСФ в концентрациях 10 мг/л или выше. Кроме клеток С1271, в качестве клеток хозяина можно также использовать клетки NIН3Т3.

П р и м е р 25. Экспрессия Г-КСФ в клетках СНО (+VSЕ)
1) Построение рНGG4-dhfr.

Двадцать микрограммов плазмиды рНGA410, полученной в примере 22, растворили в 100 мкл реакционного раствора, содержащего 10 ммоль/л трис-НСl (рН 7,5), 7 ммоль/л MgCl₂, 175 ммоль/л NaCl, 0,2 ммоль/л и ЭДТА, 0,7 ммоль/л 2-меркаптоэтанола и 0,01% бычьего сывороточного альбумина. Реакцию проводили в течение ночи при 37^оС в присутствии 20 единиц рестриктазы Sal I (Тakara Shuzo Co. Ltd.), после чего проводили обработку фенолом и эфиром и осаждали этанолом.

Осадок ДНК растворили в 100 мкл реакционного раствора, состоящего из 50 ммоль/л трис-НСl, 5 ммоль/л MgCl₂, 10 ммоль/л DТТ и по 1 ммоль/л каждого из dАТФ, dЦТФ, dГТФ и dТТФ, и реакцию проводили при 14^оС в течение 2 ч в присутствии фрагманта Кленоу Е. сoli ДНК-полимеразы (10 микролитров; Тakara Shuzo Co. Ltd.), после чего проводили обработки фенолом и эфиром и осаждали этанолом.

Есo RI-линкер прикрепили к ДНК в осадке с помощью следующих способов: ДНК растворили в 50 мкл реакционного раствора, состоящего из 50 ммоль/л трис-НСl (рН 7,4), 10 ммоль/л DТТ, 0,5 ммоль/л cпермидина, 2 ммоль/л АТФ, 2 ммоль/л гексамин-кобальтхлорида и 20 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина. Реакцию проводили при 4^оС в течение 12-16 ч в присутствии Есо RI-линкера (Тakara Shuzo Co. Ltd.) и 200 единиц Т₄ ДНК-лигазы (Тakara Shuzo Co. Ltd.). После обработки фенолом, промывки эфиром и осаждения этанолом, которые проводили в соответствии с обычными способами, осадок ДНК частично переваривали с Есo RI и с помощью гель-электрофореза 1% агарозного геля получили 3 мкг фрагмента ДНК длиной примерно 2,7 тыс. пар оснований.

Плазмиду pAdD26SVpA [Kaufman, R. G. Sharp, Р.А. Mol. Сеll Biol. 2, 1304-1319 (1982)] обработали с ЕсoRI и дефосфорилировали путем обработки бактериальной щелочной фосфатазой. Более конкретно, 20 мкг рАdD26SVpА и 20 единиц ЕсoRI добавили к реакционному раствору [50 ммоль/л трис-НСl (pН 7,5), 7 ммоль/л MgCl₂, 100 ммоль/л NaCl, 7 ммоль/л 2-меркаптоэтанола и 0,01% бычьего сывороточного альбумина и реакцию проводили при 37^оС в течение 10 ч. Затем 5 единиц бактериальной щелочной фосфатазы добавили к реакционному раствору, реакцию проводили при 68^оС в течение 30 мин. После обработки фенолом посредством электрофореза выделили ЕсoRI фрагмент pAdD26SVpA с выходом примерно 5 мкг. Ренатирировали фрагмент длиной примерно 2,7 тыс. пар оснований и pAdD26SVpA, которые весили по 0,5 мкг каждый. Полученную плазмиду использовали для трансформации штамма DHI Е.coli по методу с использованием хлорида рубидия, и отобрали колонии, несущие плазмиду pНGG4-dhfr. Полученную плазмиду назвали рНGG4-dhfr (фиг.30).

Альтернативный способ заключался в следующем: плазмиду рН GA 410 обработали Sal I и частично переваривали с Есo RI без присоединения какого-либо ЕсoRI-линкера. Выделили фрагмент ДНК длиной примерно 2,7 тыс. пар оснований и обработали с фрагментом Кленоу Е.coli ДНК-полимеразы, чтобы создать тупые концы. Фрагмент ЕсoRI, имеющий тупые концы, получили из pАdD26SVpА, как описано выше. Этот ЕсoRI-фрагмент и отдельно полученный фрагмент (примерно 2,7 тыс. пар оснований) обработали Т4 ДНК-лигазой, чтобы получить pНGG4-dhfr.

Плазмиду рН GA 410(Н), полученную в примере 23, обработали рестриктазами Hind III и Sal I, как описано в 2) в примере 23, и фрагмент Hind III Sal I присоединили к тупоконечному Есо RI фрагменту pAdD26SVpА, описанному выше. Этот способ можно также использовать для получения рНGG 4-dhfr (фиг.31)
2) Построение pG4DRI и pG4DR2.

Десять микрограммов плазмиды pAdD26SVpA, указанной в I), растворили в 50 мл реакционного раствора, содержащего 50 ммоль/л трис-НСl (рН 7,5), 7 ммоль/л MgCl2, 100 ммоль/л NaCl, 7 ммоль/л 2-меркаптоэтанола и 0,01% бычьего сывороточного альбумина. После добавления 10 единиц каждой из рестриктаз EcoRI и BamHI, реакцию проводили при 37оС в течение 10 ч, после чего смесь обработали фенолом и промыли эфиром. Фрагмент ДНК примерно 2 тыс. оснований выделили с помощью электрофореза через 1% агарозный гель с низкой точкой плавления. Выделенный фрагмент ДНК обработали фрагментом Кленоу ДНК-полимеразы по обычной методике с тем, чтобы создать тупые концы. Тупоконечный фрагмент ДНК подвергали обработке с фенолом, промыли эфиром и провели осаждение этанолом. ли Sal I и частично переваривали с Есo RI без присоединения какого-либо ЕсoRI-линкера. Выделили фрагмент ДНК длиной примерно 2,7 тыс. пар оснований и обработали с фрагментом Кленоу Е.coli ДНК-полимеразы, чтобы создать тупые концы. Фрагмент ЕсoRI, имеющий тупые концы, получили из pАdD26SVpА, как описано выше. Этот ЕсoRI-фрагмент и отдельно полученный фрагмент (примерно 2,7 тыс. пар оснований) обработали Т₄ ДНК-лигазой, чтобы получить pНGG4-dhfr.

Плазмиду рН GA 410(Н), полученную в примере 23, обработали рестриктазами Hind III и Sal I, как описано в 2) в примере 23, и фрагмент Hind III Sal I присоединили к тупоконечному Есо RI фрагменту pAdD26SVpА, описанному выше. Этот способ можно также использовать для получения рНGG 4-dhfr (фиг.31)
2) Построение pG4DRI и pG4DR2.

Десять микрограммов плазмиды pAdD26SVpA, указанной в I), растворили в 50 мл реакционного раствора, содержащего 50 ммоль/л трис-НСl (рН 7,5), 7 ммоль/л MgCl₂, 100 ммоль/л NaCl, 7 ммоль/л 2-меркаптоэтанола и 0,01% бычьего сывороточного альбумина. После добавления 10 единиц каждой из рестриктаз EcoRI и BamHI, реакцию проводили при 37^оС в течение 10 ч, после чего смесь обработали фенолом и промыли эфиром. Фрагмент ДНК примерно 2 тыс. оснований выделили с помощью электрофореза через 1% агарозный гель с низкой точкой плавления. Выделенный фрагмент ДНК обработали фрагментом Кленоу ДНК-полимеразы по обычной методике с тем, чтобы создать тупые концы. Тупоконечный фрагмент ДНК подвергали обработке с фенолом, промыли эфиром и провели осаждение этанолом.

Десять микрограммов плазмиды рНРА 410(Н), полученной в 1) примера 23, растворили в 50 мкл реакционного раствора, содержащего 10 ммоль/л трис-НСl (рН 7,5), 7 ммоль/л MgCl₂ и 60 ммоль/л NaCl. Реакцию проводили при 37^оС в течение 6 ч в присутствии 10 единиц Hind III. Фрагмент ДНК выделили посредством электрофореза через 1% агарозный гель с низкой точкой плавления, который проводили по обычной методике. Выделенный фрагмент ДНК затем обработали бактериальной щелочной фосфатазой, и тупые концы получили путем обработки фрагментом Кленоу. После обработки фенолом и промывки эфиром фрагмент ДНК присоединили тупыми концами к ранее полученному фрагменту ДНК примерно 2 тыс. оснований с помощью Т₄ ДНК-лигазы по следующей методике: по 1 мкг каждого фермента ДНК растворили в 30 мкл реакционного раствора, содержащего 66 ммоль/л трис-HCl, (рН 7,5), 6,6 ммоль/л MgCl₂, 5 ммоль/л DТТ и 1 ммоль/л AТФ, и реакцию проводили при 6^оС в течение 12 ч в присутствии 50 единиц Т₄ ДНК-лигазы. Продукт связывания использовали для трансформации штамма DHI Е. сoli. В результате получили рG4DR1 и pG4DR2, показанные на фиг.32.

3) Трансформация и экспрессия.

Клетки СНО (штамм dhfr-любезно предоставленный доктором L. Сhasin из Колумбийского университета) культивирования для роста в альфа-минимальной существенной среде, содержащей 10% сыворотки теленка (α -МЕН с добавкой аденозина, дезоксиденозина и тимидина) в чашках (диаметром 9 см, Nunc). Культивированные клетки трансформировали по методике с использованием фосфата кальция [Wigler et al. Сеll, 14,725,(1978)] следующим образом.

Носитель ДНК (ДНК тимуса теленка) добавили в подходящем количестве к 1 мкг плазмиды рНGG4-dhfr, полученной в 1), и смесь растворили в 375 мкг ТЕ раствора, после чего добавили 125 мкл 1 моль/л CaCl₂. После охлаждения раствора на льду в течение 3-5 мин, к раствору добавили 500 мкл 2x xНBS (50 ммоль/л Hepes, 280 ммоль NaCl, 1,5 ммоль/л фосфатного буфера). После повторного охлаждения на льду раствор смешали с 1 мл культуры СНО клеток, перенесли в чашки и инкубировали в течение 9 ч в инкубаторе с СО₂. Среду удалили из чашки после промывки трис-буферным солевым раствором и добавления 20% глицерин-содержащего трис-буферного солевого раствора и повторной промывки добавили неселективную среду (описанная выше α -МЕ N среда за исключением того, что в нее добавили нуклеотиды). После инкубирования в течение 2 дней, культуру, разбавленную в 10 раз, перенесли на селективную среду (без добавок нуклеотидов). Продолжали культивирование, причем среду заменяли на свежую селективную среду через каждые 2 дня, и полученные колонии отобрали и перенесли на свежие чашки, где клетки выращивали в присутствии 0,02 мкмоль/л метотрексата, после чего производили клонирование путем выращивания в присутствии 0,05 мкмоль/л метотрексата, содержание которого потом увеличили до 0,01 мкмоль/л.

Трансформацию СНО клеток можно также осуществить путем совместной трансформации с РНGG4 и PAdD26SVpA [cм. Scahill et al. Proc. Natl. Асаd. Sci. USA, 80, 4654-4658 (1983)]
Клетки СНО трансформировали также следующими способами: pG4DRI или pG4DR2, полученные в (2), предварительно обрабатывали, соответственно, с помощью SalI и KpnI, чтобы получить фрагменты ДНК, и 10 мкг этих фрагментов использовали для трансформации клеток СНО, как указано выше, трансформированные клетки подвергали продолжительному культивированию в ряде селективных сред по описанному выше способу, примерно через 7 дней появилось не менее 100 отдельных колоний на чашку, эти колонии перенесли целиком на свежую чашку и подвергали продолжительному культивированию в ряде селективных сред в присутствии 0,01 мкмоль/л метатрексата, после чего появилось десять с лишним колоний, те же процедуры повторяли при последовательном увеличении концентрации метотрексата до 0,02 мкмоль/л 0,05 мкмоль/л и 0,1 мкмоль/л, и отобрали колонии, которые выживали, отбор колоний можно осуществить аналогичным способом, даже если по отдельности собрать полученные 10 с лишним колоний и подвернуть их культивированию при возрастающих концентрациях метотрексата.

Рекомбинантный вектор, несущий "полицистронный ген", также можно использовать для трансформации СНО клеток. Пример этого альтернативного способа заключается в следующем: pAdD26SVpA обработали Pst I и выделенные два фрагмента присоединили к рBRG4-выведенному фрагменту КДНК КСФ c тем, чтобы построить рекомбинантный вектор, в котором адaновирусный промотор, КДНК КСФ, DHFR и поли(А) cайт SV40 были вставлены в написанном порядке. Этот рекомбинантный вектор использовали для трансформации клеток СНО.

П р и м е р 26. Анализ активности Г-КСФ (+VSЕ).

Надосадочные жидкости культур клеток С127 и СНО, полученных, соответственно, в примерах 24 и 25, довели до рН 4 с помощью уксусной кислоты. После добавления равного объема н-пропанола, полученный осадок удалили центрифугированием. Надосадочную жидкость пропускали через открытую колонку (диаметром 1 см и длиной 2 см), заполненную С8 обращенно-фазным носителем (Yamamura Kagaku K. K. ) и элюрование осуществляли с помощью 50% н-пропанола. Элюент разбавили вдвое водой и подвергали его обращенно-фазной жидкостной хроматографии высокого давления на колонке YMC-C8 (Yamamura Kaguka K.K.), после чего элюировали н-пропанолом (30-60% линейный градиент плотности), содержащим 0,1% трифторуксусную кислоту. Фракции, которые элюировали при концентрациях н-пропанола около 40% выделили, высушили вымораживанием и растворили в 0,1 моль/л глицинолом буфера (рН 9). В результате этих процедур человеческий Г-КСФ в клетках С127 и СНО cконцентрировали примерно в 20 раз.

В качестве контроля клетки трансформировали плазмидами, не содержащими КДНК человеческого Г-КСФ, и надосадочные жидкости этих культур были сконцентрированы в соответствии с описанными выше методами. Активности человеческого Г-КСФ образцов анализировали с помощью способов анализа активности человеческого Г-КСФ (а), описанного ранее в этом описании. Если эффективность экспрессии является достаточно высокой, то надосадочные жидкости культур можно анализировать непосредственно без предварительного концентрирования. Результаты сведены в табл.5, где данные основаны на концентрированных образцах.

П р и м е р 27. Аминокислотный анализ и анализ сахара (+VSЕ)
1) Анализ аминокислотного состава
Неочищенный образец КСФ, полученный в примере 26, очищали способами, описанными в примере 2(III). Очищенный образец КСФ гидролизовали обычными способами и протеиновую часть гидролизата проанализировали для определения его аминокислотного состава с помощью специального способа аминокислотного анализа с использованием автоматического аминокислотного анализатора "Хитачи 835" (фирмы "Хитачи"). Результаты приведены в табл.6. Гидролиз проводили при следующих условиях: (I) 6 н. раствор НСl 110^оС, 24 часа, в вакууме (II) 4 н. раствор метансульфокислоты + 0,2% 3-(2-aмино-этил), индола, 110^оС, 24 ч, 48 ч, 72 ч, в вакууме.

Образец растворили в растворе (1,5 мл), содержащем 40% н-пропанол и 0,1% трифторуксусную кислоту. Аликвоты по 0,1 мл каждая сушили с помощью сухого газообразного азота, и после добавления реагентов, перечисленных в (I) или в (II), емкости герметически закрыли в вакууме, после чего проводили гидролиз содержимого.

Каждая из величин, приведенная в табл.6, представляла собой среднее значение из четырех измерений, величины для 24 ч для (l) и величины для 24 ч для (I) и величины для 24,48 и 72 ч для (II), за исключением того, что содержания Тре, Сер, 1/2 Цис, Мет, Вал, Иле и Трп были рассчитаны следующими методами (см. "Таmpaku Kagaku (Protein Chemistry) II", А Соurse in Biochemical Ехperiments, Тokyo Kagaku Dohjin):
-Для Тре, Сер, 1/2 Цис и Мет зависимость от времени величин для 24,48 и 72 часов для (II) экстраполировали к нулю часов.

-Для Вал и Иле использовали величину для 72 ч Для (II).

-Для Трп использовали средние величины для 24,48 и 72 ч (II).

2) Анализ сахарного состава.

Внутренний стандарт (25 нмоль инозитола) добавили к 200 нг очищенного образца КСФ, использованного в анализе аминокислотного состава 1). После добавления метанольного раствора (500 мкл), содержащего 1,5 и раствор НСl проводили реакцию при 90^оС в течение 4 ч в продуваемой азотом закрытой пробирке. После этого, как пробирку открыли, добавили карбонат серебра (Ag₂CO₃), чтобы нейтрализовать содержимое. После этого добавили 50 мкл уксусного ангидрида, и пробирку встряхивали в течение достаточного периода времени. Затем пробирку оставили в течение ночи в темноте при комнатной температуре. Верхний слой поместили в образцовую пробирку и сушили с помощью газообразного азота. К осадку добавили метанол, и смесь промыли и слегка отцентрифугировали. Верхний слой поместили в ту же самую пробирку и высушили. После добавления 50 мкл реагента ТMS (смесь 5:1:1 пиридина, гексаметилдисилазана и триметилхлоросилана) проводили реакцию при 40^оС в течение 20 мин, и реакционный продукт хранили в низкотемпературном морозильнике. Стандартный образец приготовили путем смешивания 25 нмоль инозитола с 50 нмоль каждого из реагентов, галактозы (Гал), N-ацетилгалактозамина (Gal Nac), сиаловой кислоты и любых других подходящих реагентов.

Полученные таким образом образцы подвергали газохроматографическому анализу при следующих условиях:
Условия анализа Колонка: 2% OV HP, 60-80
17 VIN port меш, 3М,
стекло
Температура: повышающаяся от
110 до 250^оС со скоростью
4^оС/мин.

Давление газа-носителя (N₂):
начальное 1,2-1,6 кг/см²
конечное 2-2,5 кг/см²
Чувствительность: диапазон
10³ М Ω range, 0,1-0,4 В
Давление: H₂ 0,8 кг/см²
воздух 0,8 кг/см²
Подача образца: 2,5-3,0 мкл.

В результате анализа, в образце КСФ по настоящему изобретению были идентифицированы галактоза, N-ацетилгалактозамин и сиаловая кислота.

П р и м е р 28. Получение вектора рН GV2 (для использования с клетками животных, линия -VSE).

ЕсoRI фрагмент, полученный в примере 10, который имел КДНК, показанную на фиг. 8-10, обработали рестриктазой Dra I при 37^оС в течение 2 ч, после чего обработали фрагментом Кленоу ДНК-полимеразы I (Тakava Shuzo Co. Ltd.), чтобы создать тупые концы. Один микрограмм линкера Bgl II (8 mer, Тakara Shuzo Co. Ltd.) фосфорилировали с помощью АТФ и присоединили к примерно 1 мкг отдельной полученной смеси фрагментов. Соединенные фрагменты обработали рестриктазой Bgl II и подвергали агарозному гель-электрофорезу. Затем выделили только самый большой фрагмент ДНК.

Этот фрагмент ДНК был эквивалентен примерно 700 парам оснований, содержащим участок, кодирующий полипептид человеческого Г-КСФ (см.фиг.18). Вектор pdKCR[Fukunagа et al. Proc. Natl. Асаd. Sci. USA, 81, 5086 (1984)] обработали рестриктазой BamHI, а затем дефосфорилировали щелочной фосфатазой (Тakara Shuzo Co. Ltd.). Полученный вектор ДНК присоединили к фрагменту КДНК длиной примерно 700 пар оснований в присутствии Т4 ДНК-лигазы (Тakara Shuzo Co. Ltd. ) с тем, чтобы получить рН GV2 (фиг.33). Как показано на фиг.33, эта плазмида содержала промотор раннего гена SV 40, участок инициации репликации SV 40, часть гена кроличьего β -глобина, участок инициации репликации рНR322 и pBR 322 выведенный β -лактамазный ген (Amp^r), причем ген человеческого Г-КСФ присоединен ниже потоку от промотора раннего гена SV 40.

П р и м е р 29: Построение рекомбинантного вектора (-VSЕ) для использования при трансформации клеток С127.

1) Построение рН GV 2(Н).

Двадцать микрограммов плазмиды рН GV2 (рис.17)), полученной в примере 28, обрабатывали способами, описанными в 1) в примере 23, с тем, чтобы получить плазмиду, названную рН GV2 (Н) (фиг.34).

2) Построение рекомбинантных векторов экспркессии рТNV2, рТNVAα и рТNVА β.

Используя 20 микрограммов рН GV2(Н), повторяли способы, описанные в 2) в примере 23, чтобы отобрать Е.coli, несущую плазмиду, имеющую рН GV2 выведенную КДНК Г-КСФ. Эту плазмиду назвали рТ N-V2 (фиг.34).

Аналогично обработали аденовирус типа II [Тampakushitsu, Kakusan, Koso (Протеины, нуклеиновые кислоты и ферменты), 27 декабря 1982, Kyoritsu Shuppan] чтобы получить плазмиду ΔpVA, которая содержала SalI-Hind III, фрагмент примерно 1700 пар оснований, несущий VAI и VAII и фрагмент, содержащий VAI и VAII, выделили из этой плазмиды. Этот фрагмент вставили в pТN-V2 в сайт Hind III с тем, чтобы получить рТNVAα и рТNVA β (рис.18). Из-за наличия VA гена аденовируса эти плазмиды могли усиливать экспрессию продукта транскрипции от раннего промотора SV40.

П р и м е рно 30. Трансформация клеток С127 и экспрессия в них Г-КСФ (-VSЕ) рТN-V2, полученную в примере 29, обработали рестриктазой BamHI перед тем, как ее использовали для трансформации клеток мышей С127.

Клетки мыши С1271 трансформировали с помощью полученной таким образом ДНК, чтобы экспрессовать Г-КСФ (см. пример 24), и отобрали клоны, имеющие высокую скорость продуцирования Г-КСФ. Эти клоны продуцировали Г-КСФ в концентрации примерно 1 мг/л.

Путем последующего клонирования можно отобрать клоны, которые могут продуцировать Г-КСФ в концентрации 10 мг/л. Аналогичным образом клетки С127 трансформировали с рТNVАα и рТNVAβ полученными в примере 29, и трансформанты отобрали для клонов, обладающих высокой способностью продуцировать Г-КСФ, что касается рТNVAα можно получить клоны способные продуцировать Г-КСФ с выходами 20 мг/л или более, в то время как посредством трансформации с рТNVA β получали клоны, имеющие более низкую продуктивность (несколько мг/л).

Кроме клеток С1271, в качестве клеток хозяина можно также использовать клетки N1H3Т3.

П р и м е р 31. Экспрессия Г-КСФ в клетках СНО (-VSЕ).

1) Построение рНGV-2dhfr.

Фрагмент ДНК длиной примерно 2,7 тыс. пар оснований приготовили из 20 микрограммов плазмиды рНGV2 (пример 28) с помощью способов, описанных в 1) в примере 25. Этот фрагмент (0,5 мкг) и ЕсоRI-фрагмент pAdD26SVpА (0,5 мкг) подвергали ренатурации. Полученную плазмиду использовали для трансформации штамма DHI Е. cоli по способу с использованием хлорида рубидия, и отобрали колонии, несущие плазмиду pНGV2-dhfr. Полученную плазмиду назвали рНGV2-dhfr (фиг.35).

Альтернативный способ заключался в следующем: плазмиду рНGV2 обрабатывали Sal I и частично переваривали с Есo RI без присоединения какого-либо линкера Есo RI. Выделили фрагмент ДНК длиной примерно 2,7 тыс.пар оснований, и его обработали с фрагментом Кленоу Е.соli ДНК-полимеразы, чтобы создать тупые концы. Тупоконечный ЕсоRI-фрагмент приготовили из pAD26SVpA, как описано выше. Этот ЕсоRI-фрагмент и отдельно полученный фрагмент (примерно 2,7 тыс. пар оснований) обработали Т₄ ДНК-лигазой, чтобы получить рНGV2-dhfr.

рНGV2(Н), полученную в 1) примера 29, обрабатывали рестриктазами Hind III и SalI как описано в 2) в примере 29, и Hind III Sal I фрагмент присоединили к тупоконечному Есо RI фрагменту pAdD26SVpA, описанному выше. Этот способ можно также использовать для получения рНGG4-dhfr (фиг.36).

2) Построение pV2DR1 и pV2DR2
Десять микрограммов плазмиды pAdD26SVpA, упомянутой в 1), растворили в 50 мл реакционного раствора, содержащего 50 ммоль/л трис-НСl (рН 7,5), 7 ммоль/л MgCl₂, 100 ммоль/л NaCl, 7 ммоль/л 2-меркаптоэтанола, и 0,01% бычьего сывороточного альбумина. Реакцию проводили при 37^оС в течение 10 ч в присутствии 10 единиц каждой из рестриктаз ЕсoRI и BamHI. Поэтому обработку фенолом и промывку эфиром проводили обычным путем. Фрагмент ДНК длиной примерно 2 тыс. оснований выделили посредством электрофореза через 1% агарозный гель с низкой точкой плавления. Выделенный фрагмент ДНК обработали с фрагментом Кленоу ДНК-полимеразы по обычному способу с тем, чтобы создать тупые концы. Тупоконечный фрагмент ДНК обрабатывали фенолом, промывали эфиром и проводили осаждение этанолом.

Десять микрограммов плазмиды рНGV2(Н), полученной в 1) примера 29, растворили в 50 мкл реакционного раствора, содержащего 10 ммоль/л, трис-НСl (рН 7,5), 7 ммоль/л MgCl₂ и 60 ммоль/л NaCl. Реакцию проводили при 37^оС в течение 6 ч в присутствии 10 единиц Hind III. Фрагмент ДНК выделили с помощью электрофореза через 1% агарозный гель с низкой точкой плавления, который проводили обычным способом. Выделенный фрагмент ДНК затем обработали бактериальной щелочной фосфатазой, и тупые концы создавали посредством обработки фрагментом Кленова. После обработки фенолом и промывки эфиром, фрагмент ДНК присоединили тупыми концами к ранее полученному фрагменту ДНК длиной примерно 2 тыс. оснований с помощью Т₄ ДНК-лигазы по следующей методике: 1 микрограмм каждого фрагмента ДНК растворили в 50 микрограммах реакционного раствора, содержащего 66 миллимоль/л трис-НСl (рН 7,5), 6,6 миллимоль/л MgCl₂, 5 ммоль/л DТТ и 1 ммоль/л AТФ, и реакцию проводили при 6^оС в течение 12 ч в присутствии 50 единиц Т₄ ДНК-лигазы. Продукт связывания использовали для трансформации штамма DHI Е.сoli. В результате получили плазмиды pV2DR1 и pV2DR2, показанные на фиг. 37.

3) Трансформация и экспрессия.

Клетки СНО трансформировали с плазмидов рН GV2-dhfr для экспрессии Г-КСФ в соответствии со способами, описанными в 3) в примере 25.

Трансформацию клеток СНО можно также осуществить путем совместной трансформации с рНGV2 и pAdD26SVpA.

Клетки СНО трансформировали также следующими способами: pV2DR1 или pV2DR2, полученные в 2), предварительно обработали с Sal I и Kpn I соответственно, чтобы получить фрагменты ДНК, и 10 мкг в этих фрагментов использовали для трансформации клеток СНО, как описано выше, трансформированные клетки подвергали непрерывному культивированию в ряде селективных сред таким образом, как описано выше, примерно через 7 дней было не менее 100 отдельных колоний на чашку, эти колонки переносили целиком на свежую чашку и подвергали непрерывному культивированию в ряде селективных сред в присутствии 0,01 мкмоль/л метотрексата, после чего появилось десять с лишним колоний, те же самые способы повторяли при концентрации метотрексата, последовательно возрастающей до 0,02 мкмоль/л 0,05 мкмоль/л и 0,1 мкмоль/л, и отобрали колонии, которые выжили, отбор колоний можно осуществить аналогичным образом, дале если полученные 10 с лишним колоний по отдельности отобрать и подвергнуть культивированию при возрастающих концентрациях метотрексата.

Рекомбинантный вектор, несущий "полицистронный ген" также можно использовать для трансформации клеток СНО. Пример этого альтернативного способа состоит в следующем: pAdD26SVрА обработали PstI и выделенные два фрагмента присоединили к pBRV2 выведенному фрагменту КДНК КСФ с тем, чтобы построить рекомбинантный вектор, в котором аденовирусный промотор, КДНК КСФ DНFR и сайт поли(А)SV 40 вставлены в написанном порядке. Этот рекомбинантный вектор использовали для трансформации клеток СНО.

П р и м е р 32. Анализ активности Г-КСФ (-VSЕ)
С помощью способов, описанных в примере 26, человеческий Г-КСФ получили из надосадочных жидкостей культур клеток С127 и клеток СНО, которые получили в примере 30 и 31, соответственно. Активность человеческого Г-КСФ каждого из выделенных образцов анализировали, как в примере 26. Результаты приведены в табл.7.

П р и м е р 33. Аминокислотный анализ и сахарный анализ (-VSE)
1) Анализ аминокислотного состава.

Неочищенный образец КСФ, полученный в примере 32, очищали в соответствии с методиками, описанными в примере 2(III). Очищенный образец КСФ подвергали анализу его аминокислотного состава по способам, описанным в 1) в примере 27. Результаты приведены в табл.8.

2) Анализ сахарного состава.

Очищенный образец КСФ, использованный для анализа аминокислотного состава в 1), подвергали анализу для определения его сахарного состава с помощью тех же способов и при тех же самых условиях, как описано в 2) в примере 27. В результате этого анализа было подтверждено наличие галактозы, N-ацетилгалактозамина и сиаловой кислоты в образце КСФ по настоящему изобретению.

П р и м е р 34. Построение рекомбинантного вектора, содержащего хромосомный ген для экспрессии в клетках СOS.

Плазмиду рBRCЕЗ β, которая была получена в примере 11 и которая содержала хромосомный ген, показанный на фиг. 13-17, обработали ЕсоRI. Плазмиду рSVH⁺K⁺, описанную Banerji et al. Сеll, 27, 299 (1981), обработали Kpn I, чтобы удалить глобиновый ген. Затем плазмиду подвергали частичному перевариванию с Hind III и, чтобы удалить часть позднего гена SV40. Фрагменты соединили повторно, чтобы получить вектор экспрессии pML -Е⁺.

Этот вектор обработали рестриктазой ЕсоRI и дефосфорилировали щелочной фосфатазой (Тakara Shuzo Co. Ltd), чтобы получить вектор ДНК, который связали с вышеупомянутой хромосомной ДНК с помощью Т₄ ДНК-лигазы (Тakara Shuzo Co. Ltd.), чтобы получить рМL СЕЗ α. Как показано на рис. 20, эта плазмида содержала усилитель гена SV40, начало репликации SV40, начало репликации pB R322 и pBR322 выведенный β -лактамазный ген (Аmp^r), и имела хромосомный ген человеческого Г-КСФ, присоединенный ниже по потоку от усилителя гена SV40.

П р и м е р 35. Экспрессия хромосомного гена человеческого КСФ в клетках СОS.

Клетки СОS-I (полученные благодаря любезности доктора Глузмана из лаборатории Коулд спринг харбор, США), которые выращивали до плотности примерно 70% в чашках Петри (диаметром 9 см, Nunc), используя среду DMEM (модифицированная Дульбекко среда Игл, поставляемая фирмой Nissui Seiyaku K. K. под торговым названием "Nissui"), содержащую 10% сыворотки теленка, трансформировали либо путем обработки фосфатом кальция [Wigler et al. Сell, 14, 725, (1978)] либо способом с использованием DEАЕ-декстрана, хлорохина, см. например, Гордон с сотр. Sciencе, 228, 810 (1985)]
Трансформацию по способу с использованием фосфата кальция проводили следующим образом: 160 мкг плазмиды pMLCЕЗα полученной в примере 34, растворили в 320 мкл ТЕ раствора и после добавления дистиллированной воды (3,2 мл) добавили 504 мкл 2 моль/л CaCl₂.

К полученному раствору добавили 4 мл 2 НBS (50 ммоль/л Hepes, 280 ммоль/л NaCl, 1,5 ммоль/л фосфатного буфера, рН 7,12) и смесь охлаждали на льду в течение 20-30 мин. Охлажденную смесь добавляли по каплям к среде в количестве 1 мл на чашку Петри, где выращивали клетки СOS-1. После культивирования в течение 4 ч при 37^оС в инкубаторе с СО₂, клетки промывали безсывороточной DMEM средой, затем оставили стоять в течение примерно 3 мин при комнатной температуре в 5 мл среды DMEM, содержащей 20% глицерина, после чего промыли повторно безсывороточной средой DМЕМ. После удаления безсывороточной среды DМЕМ, добавили 10 мл среды DМЕМ, содержащей 10% сыворотки теленка, и культивирование продолжали в течение ночи в инкубаторе с СО₂. После того, как среду заменили свежей средой такого же типа, культивирование продолжили еще в течение 3 дней.

Трансформацию по способу с использованием DEАЕ-декстрана, хлорохина проводили следующим образом: как в методике с использованием фосфата кальция, культивировали клетки СOS-1, чтобы они выросли до плотности 70% и промыли их дважды безсывороточной средой DМЕМ, к промытым клеткам добавили безсывороточную среду DМЕМ, содержащую 250 микрограмм/мл DEAЕ-декстрана в 2 мкг/мл плазмиды pML CEЗ α полученной в примере 34, и культивирование продолжали при 37^оС в течение 12 ч, затем клетки дважды промыли безсывороточной средой DМЕМ и подвергали дальнейшему культивированию при 37^оС в течение 2 ч в среде DMEM, содержащей 10% сыворотки теленка и 1 ммоль/л хлорохина, после этого клетки промыли дважды безсывороточной средой DМЕМ и культивировали при 37^оС в течение дополнительных 3 дней в среде DМЕМ, содержащей 10% сыворотку теленка.

Надосадочную жидкость полученной таким образом культуры клеток СOS-1 довели до рН 4 с помощью 1 н. раствора уксусной кислоты. После добавления равного объема н-пропанола, полученный осадок удалили центрифугированием. Поверхностный раствор пропускали через открытую колонку (диаметром 1 и длиной 2 см), заполненную 68 обращенно-фазным носителем (Yamamura Kagaku K.K.), и элюирование осуществляли с помощью 50% н-пропанола. Элюат разбавили в два раза водой и подвергали обращенно-фазной жидкостной хроматографии высокого давления на колонке YMC-С8 (Yamamura Kagaku K.K.), после чего проводили элюирование н-пропанолом (30-60% линейный градиент плотности), содержащим 0,1% трифторуксусную кислоту. Выделили фракции, которые элюировали при концентрациях н-пропанола примерно 40% затем их высушили вымораживанием и растворили в 0,1 моль/л глицидиновом буфере (рН 9). В результате этих процедур человеческий Г-КСФ в надосадочной жидкости культуры клеток СOS-1 сконцентрировали примерно в 20 раз.

В качестве контроля, клетки СOS-1 трансформировали pML-Е⁺, не содержащей хромосомного гена Г-КСФ, с помощью вышеописанного способа, и сконцентрировали надосадочную жидкость полученной культуры.

Активности человеческого Г-КСФ в полученных образцах анализировали по "Способу анализа активности человеческого Г-КСФ (а)", описанному ранее в данном описании. Результаты приведены в табл.9.

П р и м е р 36. РНК-анализ Г-КСФ (хромосомного гена).

Клетки СОS, выращенные до клеточной концентрации 8 х 10⁶ клеток/чашку (диаметром 9 см), трансформировали с помощью 80 мкг плазмиды рML CEЗ αЧерез 48 ч получили всю РНК по способу Сhirgwin [Biochemistry, 18, 5294-5299 (1979)]
Плазмиду рBRG4, полученную в примере 9, расщепили с помощью рестриктазы Aha III, и полученный pBRG4-выведенный фрагмент ДНК пометили радиоактивной меткой с помощью [ γ-³²P] AТФ, используя Т₄, полинуклеотидкиназу, чтобы получить фрагмент ДНК длиной 2,8 тыс. оснований, содержащий КДНК Г-КСФ. Фрагмент выделили и использовали в качестве зонда ДНК. После того, как денатурировали зонд ДНК (1,5 x10⁵ счетов в минуту, 2,8 x10⁶ счетов в 1 мин/мкг ДНК), его смешали с 20 мкг всей РНК, полученной из клеток СOS. Гибридизацию проводили при 45^оС в течение 15 ч. Смесь переваривали с 200 единиц/мл или с 400 единиц/мл нуклеазы S1 (P.L. Biochemicals) по методикам Weaver and Weissmann [Nucleic Acid Res. 7, 1175-1193(1979)] после чего проводили гель-электрофорез через 4% полиакриламидный гель в присутствии 8,3 моль/л мочевины. Затем проводили детектирование с помощью авторадиографии.

В результате наблюдали полосу, соответствующую 722 парам основания, в виде сильно радиоактивно-меченной полосы в клетках СOS, где также отмечали полосу, соответствующую 487 парам основания.

Поэтому было найдено, что РНК клеток СOS содержала иРНК Г-КСФ обеих линий +VSЕ и -VSЕ.

П р и м е р 37. Аминокислотный анализ и сахарный анализ (хромосомного гена).

1) Анализ аминокислотного состава.

Неочищенный образец КСФ, полученный в примере 35, очищали в соответствии с методиками, описанными в примере 2 (III). Очищенный образец КСФ подвергали анализу его аминокислотного состава по способам, описанным в 1) в примере 27. Результаты приведены в табл.10.

2) Анализ сахарного состава.

Очищенный образец КСФ, использованный в анализе аминокислотного состава в 1), также подвергали анализу его сахарного состава с помощью тех же самых способов и при тех же самых условиях, какие описаны в 2) в примере 27. В результате этого анализа было подтверждено наличие галактозы, N-ацетилгалактозамина и сиаловой кислоты в образце КСФ по настоящему изобретению.

П р и м е р 38. Экспрессия хромосомного гена человеческого Г-КСФ в клетках С127.

Плазмиду pML СЕЗ α полученную в примере 34, обработали ЕсоRI, и выделили фрагмент примерно 4 тыс. оснований с помощью способов, описанных в Molecular Cloning, там же. Выделенный фрагмент использовали в качестве источника хромосомного гена Г-КСФ.

Фрагмент обработали фрагментом Кленоу ДНК-полимеразы I, чтобы создать тупые концы (А).

Промотор SV40 (Есo RI-ЕсоRI фрагмент примерно 0,4 тыс. оснований) вырезали из плазмиды рНGA410 (полученной, как в примере 22) с помощью способов, описанных в Molecular Cloning, там же, и затем обработали с фрагментом Кленоу ДНК-полимеразы (В).

В отдельной стадии плазмиду pdBPV-I, имеющую вирус бычьей папилломы (BPV) [эту плазмиду получили благодаря любезности доктора Хоули, и она описана в Sarver, N. Sbyrne, J.С. Нowleу, P.М. Proc. Natl. Асаd. Sei. USA, 79, 7147-7151 (1982)] обработали Hind III и Pvu II, чтобы получить фрагмент ДНК примерно 8,4 тыс. оснований. Этот фрагмент обработали с фрагментом Кленоу ДНК-полимеразы I и дефосфорилировали с помощью бактериальной щелочной фосфатазы (С).

Фрагменты ДНК (А), (В) и (С), массой по 0,1 мкг каждый, растворили в 20 мкл реакционного раствора [50 ммоль/л трис-НСl (рН 7,6), 10 ммоль/л MgCl₂, 10 ммоль/л DТТ, 1 ммоль/л AТФ] и реакцию проводили в течение ночи при 4^оС в присутствии 180 единиц Т₄ ДНК-лигазы.

Реакционный раствор затем обработали по способу с использованием хлорида рубидия, описанному в Molecular Cloning, там же, с тем, чтобы получить плазмиду pТNCE3α (фиг.39).

Фрагмент ДНК(А), использованный в качестве источника хромосомного гена Г-КСФ, можно заменить на фрагмент ДНК примерно 1,78 тыс. оснований, который получили следующим образом: 20 мкг pML CEЗ α растворили в 100 мкл смеси 10 ммоль/л трис-НСl (рН 8,0), 7 ммоль/л MgCl₂, 100 ммоль/л NaCl, 7 ммоль/л 2-меркаптоэтанола и 0,01% бычьего сывороточного альбумина, раствор инкубировали при 37^оС в течение 5 ч в присутствии 20 единиц StuI, а затем подвергали электрофорезу через 1,2% агарозный гель.

Полученную таким образом плазмиду рТNCEЗ α использовали для трансформации клеток мышей С127 1, как в примере 24, и отобрали клоны, которые экспрессовали хромосомный ген человеческого Г-КСФ и которые обладали высокой способностью продуцировать Г-КСФ.

П р и м е р 39. Экспрессия хромосомного гена человеческого Г-КСФ в клетках СНО.

Как и в случае экспрессии в клетках С127, плазмиду рМL CEЗ обработали Stu I, выделили фрагмент ДНК примерно 1,78 тыс. оснований, альтернативно, ту же самую плазмиду обработали ЕсоRI, и выделили ЕсoRI фрагмент примерно 4 тыс. оснований. Любой фрагмент можно использовать в качестве источника хромосомного гена Г-КСФ.

Как и в случае экспрессии в клетках С127, плазмиду рМL CEЗα обработали Stu I, выделили фрагмент ДНК примерно 1,78 тыс. оснований, альтернативно, ту же самую плазмиду обработали ЕсоRI, и выделили ЕсoRI фрагмент примерно 4 тыс. оснований. Любой фрагмент можно использовать в качестве источника хромосомного гена Г-КСФ.

Фрагмент, используемый в качестве источника, обработали с фрагментом Кленоу ДНК-полимеразы I (а).

Как в примере 38, промотор SV40 (ЕсоRI ЕсoRI фрагмент) вырезали из рНGA410), чтобы получить фрагмент примерно 0,4 тыс. оснований, который аналогично обработали с фрагментом Кленоу ДНК-полимеразы (b).

В отдельной стадии плазмиду pAdD26SV pA [Kaufman, R.G. Sharp, Р.А. Mol. Сеll. Biol. 2, 1304-1319 (1982)] обработали с ЕсоRI, а затем с фрагментом Кленоу ДНК-полимеразы, и, наконец, дефосфорилировали посредством обработки бактериальной щелочной фосфатазой (с).

Фрагменты (а), (b) и (с), массой по 0,1 мкг каждый, растворили в 20 мкл реакционного раствора [50 миллимоль/л Трис-НСl (рН 7,6), 10 миллимоль/л MgCl₂, 10 миллимоль/л DТТ, 1 миллимоль/л АТФ] и реакцию проводили в течение ночи при 4^оС в присутствии 180 единиц Т₄ДНК-лигазы.

Реакционный раствор затем обработали по способу с использованием хлорида рубидия, описанному в Molecular Cloning, там же, с тем, чтобы трансформировать штамм DHI Е.coli. Из полученных Тет^r колоний отбирали те, которые содержали плазмиду pD26SVCEЗ α
Как показано на фиг.40, плазмида pD26SVCEЗα имеет ген КСФ, присоединенный к раннему гену SV40 и ген dhfr, присоединенный ниже по потоку от основного позднего промотора аденовируса.

Плазмиду рАdD26SVpА обработали с ЕсоRI и BamHI, как в 2) примера 25 с тем, чтобы получить фрагмент ДНК (примерно 2 тыс. оснований), содержащий ген dhfr. Этот фрагмент привязали к фрагменту (а) и к ЕсоRI-Sal I-фрагменту рНGA410(Н) с тем, чтобы построить вектоp экспрессии Amp^r pDR CEЗα (фиг.40).

Клетки СНО трансформировали с полученными таким образом плазмидами pD26SVCEЗα и pDR CEЗα как в примере 25. Посредством повторной селекции при выращивании в присутствии метотрексата получили клоны штамма продуцирующего Г-КСФ.

П р и м е р 40. Анализ активности Г-КСФ у трансформантов (экспрессующих хромосомный ген человека).

Надосадочные жидкости культур клеток С127 и клеток СНО, которые были получены в примерах 38, 39 соответственно обработали как в примере 26, чтобы получить человеческий Г-КСФ, и проанализировали его активность. Результаты приведены в табл.11.

П р и м ер 41. Молекулярный вес и изоэлектрическая точка трансформантов.

Очищенные образцы КСФ, использованные для анализа аминокислотного состава в примерах 16, 20, 27, 33 и 37, использовали для измерений их молекулярных весов и изоэлектрических точек с помощью следующих способов.

1) Молекулярный вес.

Молекулярный вес КСФ определяли с помощью гель-электрофореза натрий-додецилсульфат-полиакриламидного гена (SDS-PAGE). Применяли электрофоретическую установку PROТЕАN^ТН (16 см, поставляемую фирмой "Bio-Rad Corporation", используя гель, изготовленный из полиакриламидного плиточного геля (Т 15% С 2,6%), размером 140 х 160 х 1,5 мм, при концентрации геля (Т 3% С 20% ). Денатурированный образец КСФ приготовили следующим способом: КСФ кипятили в течение 3 мин в растворе, содержащем 2% додецилсульфата натрия в 0,46 моль/л 2-меркаптоэтанола. После проведения электрофореза с 4 мкг образца при постоянном токе 30 миллиампер в течение 4 ч, гель удалили, и провели окрашивание с помощью 0,25% красителя бриллиантового голубого (Сoomassie Brilliant Blue R 250, производится фирмой "Сигма кемикл компани") для обнаружения полос. Следующие вещества использовали в качестве меток молекулярного веса после аналогичных обработок: фосфорилаза В (мол.м. 92500), бычий сывороточный альбумин (БСА, мол.м. 67000), овальбумин (ОVA, мол.м. 45000), карбоангидраза (мол. м. 31000), соевый трипсиновый ингибитор (мол.м. 21500) и лизоцин (мол.м. 14400).

В результате обнаружили единственную полосу, соответствующую молекулярному весу 185000 ± 1000, для каждого из образцов КСФ, полученных примере 16 [Е.сoli (KДНК (+VSE)] и в примере 20 [Е.сoli/KДНК (-VSE)] и единственную полосу, соответствующую молекулярному весу 19000 ± 1000, для каждого из образцов КСФ, полученных в примере 27 [C127, СНО/КДНК (+VSE)] в примере 33 [С127, СНО/KДНК (-VSE)] и в примере 37 (СOS/g ДНК).

2) Изоэлектрическая точка.

Изоэлектрическую точку КCФ по настоящему изобретению определяли с помощью устройства для изоэлектрического электрофореза в плоском слое FВЕ-3000 (изготовляемом фирмой "Фармация файн кемиклз"). После 2-часового электрофореза при постоянной мощности 30 ВТ (V_макс. 2000 В) на полиакриламидном геле (Т 5% С 3% 115x xмм 230 мм), содержащем формалит (рН 4 6,5, фирма "Фармация файн кемиклз" и 4 моль/л мочевины, КСФ зафиксировали с помощью 30% метанола/10% трихлоруксусной кислоты (35% сульфосалициловой кислоты и окрасили с помощью красителя бриллиантового голубого R-250 (Сoomassie). В качестве меток изоэлектрических точек использовали набор с низкими pI (pН: 2,5-6,5 поставляется фирмой "Pharmacia Fine Chemicals").

Анализ разделения полос при рН от 4 до 6,5 дал единственную полосу, соответствующую рI 6,1 для каждого из образцов КСФ, полученных в примерах 16 и 20, и дал три раздельных полосы, соответствующие рI 5,5, 5,8 и 6,1 для каждого из образцов КСФ, полученных в примерах 27, 33 и 37.

П р и м е р 42. Защитный эффект человеческого Г-КСФ против микробной инфекции.

Способ испытания 1. Защита против заражения Pseudomonas aeruginosa Эндоксан (Еndoхan, торговое название продукта фирмы Shionogi Co. Ltd.") вводили внутривенно в ICR мышей в возрасте 8-9 недель (самцы, масса тела 35,3 ± 1,38 г) при дозе 200 мг/кг. Затем мышей разделили на три группы, двум группам ввели с интервалами в 24 ч четыре подкожные инъекции (доза каждой 0,1 мл) раствора [1% пропанола в 0,5 (вес/объем) мышиного сывороточного альбумина и физиологическом солевом растворе] содержащего человеческий Г-КСФ (25000 или 50000 единиц/моль), в то время, как третьей группе вводили только растворитель по такой же схеме. Через три часа после последней инъекции мышей в каждой группе заразили Pseudomanas aeruginosa GNB-139 с помощью подкожной инъекции (3,9 x 10⁵ колонииобразующих единиц/мышь). Через двадцать один час после заражения в первые две группы ввели еще одну подкожную инъекцию раствора, содержащего человеческий Г-КСФ (25000 или 50000 единиц/мышь), а в третью группу ввели только растворитель.

Защитный эффект человеческого КСФ определяли путем подсчета числа мышей, которые выживали через 10 дней после заражения.

Получение клеточной суспензии.

Pseudomonad aeruginosa GNB-139 культивировали в течение ночи при встряхивании при 37^оС в жидкой среде для сердечных вливаний (торговое название "Difco"). Культуру суспендировали в физиологическом солевом растворе.

2. Защита против заражения Саndida Эндоксан (Еndoxan торговое название фирмы Shionogi Co. Ltd."), вводили внутрибрюшинно в мышей ICR в возрасте 8 недель (самцы, масса тела 40,5±1,60 г) в дозе 200 мг/кг. Затем мышей разделили на две группы, одной группе ввели с 24 часовыми интервалами четыре подкожных инъекции (доза каждой 0,1 мл) растворителя [1% пропанола и 10% (вес/объем) ICR мышиной сыворотки в физиологическом солевом растворе] cодержащего человеческий Г-КСФ (50000 единиц/мышь), в то время как другой группе вводили только растворитель по такой же схеме. Через четыре часа после последней инъекции, мышей в каждой группе заразили Саndida albicans U-50-1 (штамм, выделенный из мочи лейкемийных больных, любезно предоставленный Бактериологической лабораторией, университета Тохоку, медицинской школы) с помощью внутривенной инъекции (5,6 x 10⁵ колонийобразующих единиц/мышь). Защитный эффект человеческого Г-КСФ определяли путем подсчета числа мышей, которые выживали через десять дней после заражения.

Поучение клеточной суспензии.

Саndida albicand U-50-1 культивировали в течение ночи при встряхивании пpи 37^оС в содержащей дрожжевой экстракт жидкой среде Sabouraud (2% декстрозы из фирмы "Junsei Pure Chemicals Co. Ltd."; 10% триптоказного пептона, торговое название "BBL", 5% дрожжевой экстракт из "Difcо"; рН 5, 6). Культуру дважды промывали физиологическим солевым раствором и суспендировали в физиологическом солевом растворе.

3. Защита от заражения внутриклеточной паразитарной Listeria Эндотоксан (Еndotoxan, торговое название продукта фирмы Shionogi Co. Ltd.) вводили внутрибрюшинно в ICR мышей в возрасте 7 недель (самцы, вес тела 34,7 ± 1,24 г в дозе 200 мг/кг. Затем мышей разделили на две группы; одной группе с 24 часовыми интервалами вводили четыре подкожные инъекции (доза каждой 0,1 мл) растворителя [1% н-пропанола и 10% (вес/объем) ICR мышиная сыворотка в физиологическом солевом растворе] cодержащего человеческий Г-КСФ (50000 единиц/мышь), в то время как другой группе вводили только растворитель по такой же схеме. Через четыре часа после последней инъекции, мышей в каждой группе заразили Listeria monocytogenes 46 (любезно предоставленный микробиологической лабораторией медицинской школы университета Тохоку) посредством внутривенной инъекции 1,0 x 10⁷ колонийобразующих единиц/мышь. Защитный эффект человеческого Г-КСФ определяли путем подсчета числа мышей, которые выживали через 12 дней после заражения.

Получение клеточной суспензии.

Listeria monocytogenes 46 культивировали в течение ночи при встряхивании при 37^оС в жидкой среде для мозгового сердечного вливания (торговое название продукта "Difco"). Культуру суспендировали в физиологическом солевом растворе.

Результаты
l) Испытания 1,2 и 3 проводили с полипептидом. Г-КСФ Е.соli (+VSE), полученным в примере 16. Результаты приведены в табл.12, 13 и 14.

ll) Испытание l проводили с полипептидом Г-КСФ Е,coli (-VSE), полученным в примере 20. Результаты приведены в табл. 15.

lll) Испытание l проводили с очищенным образцом человеческого Г-КСФ, выведенным клетками CHO (+VSE), который был таким же, как и образец, использованный в анализе аминокислотного состава в примере 27. Результаты преведены в табл.16.

По существу, те же результаты были получены, когда испытание 1 проводили с очищенным образцом человеческого Г-КСФ, выведенного С127 клеткой, который был таким же как образец, использованный в анализе аминокислотного состава в примере 27.

IV) Испытание I проводили с очищенным образцом человеческого Г-КСФ, выведенного СНО клеткой (-VSЕ), который был таким же, как образец, использованный в анализе аминокислотного состава в примере 33. Результаты приведены в табл.17.

По существу, те же результаты были получены, когда испытание l проводили c очищенным образцом человеческого Г-КСФ, выведенного клеткой С127, который был таким же, как образец, использованный в анализе аминокислотного состава в примере 33.

Использование: изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению фактора, стимулирующего образование колоний гранулоцитов с помощью технологии рекомбинантной ДНК. Сущность изобретения: способ получения полипептида или гликопротеина, обладающего активностью человеческого фактора, стимулирующего образование колоний гранулоцитов, предусматривает получение двунитевой КДНК, комплементарной к информационной РНК /мРНК/, кодирующей полипептид, обладающий указанной активностью, и хромосомного гена человека, кодирующего полипептид, обладающий активностью фактора, стимулирующего образование колоний гранулоцита, встраивание гена в вектор, трансформацию полученной рекомбинантной ДНК клеток реципиентов, выделение и очистку целевого продукта. 40 ил., 17 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФАКТОРА, СТИМУЛИРУЮЩЕГО ОБРАЗОВАНИЕ КОЛОНИЙ ГРАНУЛОЦИТОВ, предусматривающий конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК, содержащей фрагмент ДНК, кодирующий фактор стимулирования образования колоний гранулоцитов, трансформацию штаммов Escherichia coli или культивируемых клеток животных рекомбинантной плазмидной ДНК, культивирование трансформантов и выделение целевого продукта, отличающийся тем, что конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК с фрагментом ДНК, кодирующим фактор стимулирования образования колоний гранулоцитов со следующей аминокислотной последовательностью, приведенной в описании.