Способ получения @ -интерферона лошади Советский патент 1991 года по МПК C12N15/23 

Изобретение относится к способу получения интерферона, в частности к способу получения лошадиного интерферона типа у.

Способ получения у-интерферона лошади заключается в том, что из печени лошади выделяют высокомолекулярную ДНК, которую обрабатывают эндонуклеазой Sau ЗА, полученные фрагменты длиной 10-20 т.п.н. отделяют, дефосфорилируют, клонируют в лямбда-векторе и выделяют ген интерферона из полученной геномной библиотеки ДНК, реклонируют ген в векторы экспрессии, полученными рекомбинантными ДНК трансформируют штамм E.coli с последующим выделением и очисткой целевого продукта.

Пример. Стадия 1. Выделение лошадиной ДНК.

Замороженную печень лошади размалывают в жидком азоте до тонкого порошка и в течение Зч при 55°С инкубируют в 0,5 М

этилендиаминотетрауксусной кислоте (ЭД- ТУК), 10 мМ трис-HCI, рН 8,0, 0,5% додецил- сульфата натрия (ДСН) и 0,1 мг/мл протеиназы К (20 мл/г ткани). Полученный вязкий раствор освобождают от белка путем однократной экстракции фенолом и трехкратной экстракции смесью фенола с хлороформом и изоамиловым спиртом (25:24:1 по объему), диализуют в растворе 50 ммоль трис-HCI, рН 8,0, 10 ммоль ЭДТУК, 10 ммоль хлористого натрия и ДНК осаждают двумя обьемами этанола. После полного высушивания в вакууме ДНК растворяют в ТЕ-буфе- ре (10 ммоль трис-HCI, рН 8.0, 1 мМ ЭДТУК) при 4°С, центрифугируют в растворе хлористого цезия 1,273 г/мл при 40000 об/мин в течение 62 ч при 20°С, фракции, содержащие ДНК, диализуют в ТЕ-буфере, ДНК осаждают двумя объемами этанола, промывают 70%-ным этанолом, высушивают и снова растворяют в ТЕ-буфере при 4°С

VI

О

ы

Полученный препарат ДИК свободен от РНК и имеет длину более 50 т.п.н. (определено путем электрофореза на 0,45%-ном агарозном геле).

Стадия 2, Частичное переваривание эн- донуклеазой и фракционирование по величине лошадиной ДНК.

50 мкг лошадиной ДНК вместе с 1,6 ед. Sau ЗА инкубируют при 37°С в 450 мкл реакционной среды (10 ммоль трис-HCI, рН 7,5, 10 ммоль хлористого магния, 1 ммоль дитиотреитола). Через 15, 25 и 40 мин отбирают по 150 мл аликвотной части и смешивают с 15 ммоль ЭДТУК и прогревают в течение 10 мин при 70°С для остановки реакции. После добавления 0,3 моль ацетата натрия, рН 6,0, ДНК осаждают с помощью 2,5 объема этанола. После повторного растворения в ТЕ-буферг ДНК разделяют по величине в ТВЕ-буфере (10-8 г/л трис, 5,5 г/л борной кислоты, 0,93 г/л динатриевой соли ЭДТУК) путем электрофореза при 1 В/см на 0,45%-ном агаоозном геле в течение ночи. ДНК расщепляют рестриктазами EcoR1 и Hind 111 и выделяют фрагменты ДНК длиной т.п.н. путем электроэлю- ации при 300 В в течение 3 ч (буфер 5 0,1 х ТВЕ), очищают на колонке марки Элютип Д и затем осаждают этанолом.

ДНК дефосфорилируют. Для Этого ДНК вместе с 5 ед. кишечной бычьей фосфатазы инкубируют в течение 30 мин при 37°С в 140 мкл реакционной среды (50 ммоль трис-НС, рН 9,5, 10 ммоль хлористого магния, 0,1 ммоль ацетата цинка, 1 ммоль спермидина), добавляют 5 ед. фермента и инкубируют в течение 30 мин. После добавления ЭДТУК до конечной концентрации 25 ммоль ДНК экстрагируют однократно смесью фенола с хлороформом и изоамиловым спиртом (25:24:1 по объему), двукратно смесью хлороформа с изоамиловым спиртом (24:1 по объему) и трехкратно простым диэтиловым спиртом, осаждают этанолом, высушивают и растворяют в 0,1 хТЕ-буфере.

Стадия 3. Получение библиотеки лошадиной геномной ДНК,

Дефосфорилированные длиной 10-23 т.п.н. фрагменты лошадиной ДНК клонируют в лямбда-векторе, например лямбда- EMBL3 или EMBL ЗА, с выступающими G-A-T-C-концами путем удаления внутреннего Barn Н1-фрагмента фаговой ДНК.

Вектор выращивают в штамме E.coli с супрессорным фактором SupF., например Е.соН NM 526, 538 или 539, в LB-бульоне с 5 ммоль сульфата магния, осаждают полиэти- ленгликолем и очищают путем двукратного центрифугирования при 45000 об/мин и 20°С в течение 40 ч с использованием хлорида цезия в качестве градиента плотности (0,71 г/мл раствора). После диализа в ТЕ-бу- фере фаговую ДНК освобождают от белка путем двукратной экстракции смесью фенола с хлороформом и изоэмиловым спиртом (25:24:1 по объему) и двукратной экстракции смесью хлороформа с изоамиловым спиртом (24:1 по объему), затем концентрируют путем осаждения этанолом.

0 Для получения концевых фрагментов 2EMBL ЗА 50 мкг фаговой ДНК полностью переваривают с помощью Barn H1 в течение 2 ч при 37°С в 45 мкл реакционной среды (10 ммоль трис-HCI, рН 7,5, 10 ммоль хлорида

5 магния, 1 ммоль дитиотреитола), после чего реакцию прекращают путем добавления 15 ммоль ЭДТУК на 10 мин при 70°С. ДНК осаждают этанолом.

Во избежание повторного лигирования

0 средний фрагмент режут с помощью EcoR1 и отделяемый при этом олигонуклеотид удаляют путем осаждения изопропанолом.

Полученную ДНК полностью переваривают с помощью EcoR1 в течение 2 ч при

5 37°С в 450 мкл 10 ммоль трис-HCI, рН 7,5, 100 ммоль хлористого натрия, 10 ммоль хлористого магния и реакцию прекращают путем добавления 15 ммоль ЭДТУК и 10-минутного прогревания при 70°С. После

0 добавления ацетата натрия до конечной концентрации 0,3 М три больших фрагмента ДНК осаждают с помощью 0,6 объема изо- пропанола в течение 15 мин при 0°С, промывают 2 раза 0,45 М ацетата натрия (0,6

5 объема изопропанола) и однократно с помощью 0,3 М ацетата натрия (2.5 объема этанола) и растворяют в 15 мкл 0,1 х ТЕ-бу- фере. При этом линкеры Bam H1/EcoR1 осаждаются в растворе.

0Фрагменты EMBL ЗА (8 мкг) объединяют

примерно с 5 мкг лошадиной ДНК длиной 10-23 т.п.н, и 10 ед. Т4-ДНК-ли аэы и инкубируют в течение ночи при 14°С и один день при 4°С в 50 мкл среды лигирования (66

5 ммоль трмс-НС, рН 7,2, 0,1 М хлорида натрия, 10 мМ хлорида магния, 1мМ ЭДТУК, 5 мМ дитиотреитола, 0,5 мМ трифосфата аде- нозина - АТФ). Цитированную смесь ДНК упаковывают в зрелые лямбда-фаговые час0 тицы.

Компоненты этой системы, т.е. ультразвуковой экстракт (УЭ), лизат, получаемый путем замораживания - размораживания (ЛЗР), буферы М1 и А приготавливают изве5 стным образом. 10 мкл аликвотной части смеси лигированной ДНК инкубируют при комнатной температуре в течение 2 мин вместе с 25 мкл УЭ, который так же, как и ЛЗР размораживают во льду в течение 30 мин, смешивают с 100 мкл ЛЗР и инкубируют далее в течение 60 мин при комнатной температуре. Полученную смесь разбавляют 150 мкл лямбда-разбавителя (100 мМ трис-HCI, рН 7,5, 10 мМ сульфата магния, 1 мМ ЭДТУК) и хранят при 4°С.

Стадия 4. Клонирование и анализ последовательностей гена для лошадиного интерферона типа гамма.

Выделение клона полношго гена для лошадиного интерферона типа гамма,

Бактериальную культуру, растущую в течение ночи в LB-питательном растворе (10 г/л хлористого натрия, рН 7,4), содержащем 0,2% мальтозы, доводят до оптической плотности 2,0 (при 600 нм). По 0,5 мл этой суспензии инфицируют 50000 ед. лямбда- фагов библиотеки ДНК и с помощью слоя мягкого агара распределяют по LB-arapo- вым пластинкам, содержащим 10 мМ сульфата магния. Пластинки имеют диаметр 13,5 см. Скринингу подвергают всего 1,5 х 106 рекомбинантных лямбда-фагов. После инкубации в течение ночи при 37°С фаги каждой пластинки используют для приготовления двукратных репликонов на нитроцеллюлозе. После денатурации фаговой ДНК (1 мин 0,5 н.гидроокиси натрия, 1,5 М хлористого натрия), нейтрализации (2 раза в течение 3 мин в 0,5 М трис-НС, рН 7,5, 1,5 М хлористого натрия) и промывки (1 мин в буферах 2xSSC, 1xSSC, 0,15 М хлористого натрия, 15 мМ цитрата натрия) фильтры сушат на воздухе, ДНК фиксируют при 80°С в течение 2 ч. Фильтры промывают при 65°С в течение ночи в растворе 1,5 М хлористого натрия, 10 мМ трис-HCI, рН 8,0, 0,1 % ДСН, подвергают предварительной гибридизации при 65°С в течение 4-6 ч (раствор для гибридизации: 0,9 М хлористого натрия, 50 мМ гидроген- фосфата натрия, рН 7,4, 5 мМ ЭДТУК, 0,1% фиколла, 0,1% поливинилпмрролидона, 0,1% альбумина сыворотки крупного рогатого скота, 0,1 % ДСН, 20 мг/мл ДНК спермы лосося, подвергнутой ультразвуковой обработке и денатурации).

Гибридизацию осуществляют в свежем растворе с использованием 10б срт на фильтр с радиоактивно маркированной пробой человеческого гамма интерферона при 65°С в течение 20 ч. Фильтры промывают при 65°С в буфере 3xSSC, 0,1 % ДСН, сушат и подвергают ауторадиографии. После трехкратной очистки пятен идентифицируют пять лямбдэ-клонов, которые проявляют положительные сигналы гибридизации.

Из этих выделившихся рекомбиьантных фагов ДНК очищают известными приемами. После переваривания различными рестрикционными энзимами и последующего анализа по Саузерну фаговые ДНК характеризуют путем гибридизации пробой человеческого гамма-интерфероча. Выделя- 5 ют единственный гибридмзмрующийся ВгтН -фрагмент длиной 4,6 т п.и. клона лзмбда Eq- y2, который клонируют в место разреза Bam HI известной плазмидой pUC9.

0 После трансформации E.coli JM101 из полученных колоний по способу приготовления мини-препаратов получают плазмид- ную ДНК, которую характеризуют путем переваривания рестрикционными энзима5 ми. Плззмиду с желаемой вставкой Bam H 1 обозначают как рАН111, После введения в известные векторы М i 3м р8 или М13мр9 BamHI-вставки плазмиды рАН111 подвергают анализу последовз0 тельностей по дмдезокси-методу. Сравнение последовательностей с геном человеческого интерферона типа гамма показывает большую гомологию с некодирующими 5 - и 3 -областями. По этим

5 результатам заключают, что выделен полный ген лошадиного гамма интерферона.

Анализ последовательноегеГ. гена лошадиного интерферона типа гамма, выделенного из клочз лямбда Eq- v2

0Bam HI - вставку длиной 4,6 т.п. н. плазмиды рАН111 подвергают полному анализу последовательностей. Общую последовательность фрагмента Bam H1 определяют путем сочетания частичных последователь5 ностей субклонов М13, которые получают путем направленного клонирования ре- стрикционныхфрагментов(EcoR1. Hind 111, Pst1, Pst1 - Bgi11, Hind 111 - Bam H1) в соответственно разрезанные векторы

0 М13мр8 или М13мр9 Дальнейшие частичные последовательности получают за счет клонирования фрагмента Bam H1-Bgl 11 длиной 2,0т.п.н. или фрагмента Pst1 длиной 2,0 т.п.н. в вектор М13мр8. Оба фрагмента

5 ДНК разделяют на меньшие куски путем ультразвуковой обработки, концы ДНК делают тупыми путем инкубации ДНК-полиме- разой 1 из E.coli (фрагмент Кленова) в присутствии всех четырех дезоксинуклео0 тидтрифосфатов, каждый из которых применяют в количестве 0,1 мМ (реакционный буфер: 50 мМ трис-HCI, рН 7,5, 10 мМ хлорида магния, 1 мМ дитиотреитола, 0,5 мг/мл альбумина сыворотки крупного рогатого

5 скота, 1 ч, 25°С). После фракционирования в агарозном геле ДНК-фрзгменты длиной примерно 0,4-1.0 т.п.н. выделяют и лигиру- ют з место разреза Sma1 вектора М13мр8. Полученные последовательности обьединяют с помощью компьютерной программы с получением общей последовательности длиной 4664 пар оснований.

После анализа с использованием компьютера открытых рамок чтения и сравнения с генами интерферона типа гамма другого происхождения определяют кодирующую область гена гамма-интерферона лошади. Кодирующая область включает три интрона, причем первый кодирует гидрофобный сигнальный пептид длиной 20 аминокислот и 18 аминокислот полипептида зрелого лошадиного интерферона типа гамма (основания 366-479). Второй эквон кодирует аминбкислоты 19-41 (основания 1639-1707), третий экзон - аминокислоты 42-102 (основания 1803-1985), а четвертый экзон - карбоксиконец с аминокислотами 103-146 (основания 3307-3441). В положениях 4010 и 4020 находятся две сигнальные последовательности (ААТААА) для полиаде- нилирования мРНК. В положениях 86-88 полипептида для зрелого лошадиного гамма-интерферона находится единственное возможное место N-гликозилирования (AsN-Ser-Ser), которое совпадает с вторым местом N-гликозилирования (Asn-Gly-Ser) бычьего интерферона типа гамма. Неожидаемым образом полипептид для зрелого лошадиного гамма-интерферона содержит только один единственный цистеиновый остаток в положении 3, причем аналогично природным, человеческим и мышиным гам- магинтерферонам первые три аминоконце- вые аминокислоты (в .этом случае Tyr-Tyr-Cys) по всей поверхности протеоли- тически отщепляются в теле.

Стадия 5. Получение синтетического гена для зрелого лошадиного интерферона типа гамма.

Синтетический ген для зрелого лошадиного гамма интерферона конструируют в виде двух вариантов с использованием 16 различных олигонуклеотидов. Первый вариант кодирует зрелый интерферон с 146 аминокислотами плюс стартовый метионин, а второй вариант - на концевой аминогруппе укороченный на 3 аминокислоты (Туг-Туг- Суг) полипептид плюс с-артовый метионин, как в организме.

Синтез гена гамма-интерферона лошади осуществляют в две стадии. На первой стадии осуществляют конструкцию первой части гена с использованием восьми олигонуклеотидов EG-1 - EG-8 до места разреза Sail, а на второй стадии - конструкцию второй половины гена с использованием шести олигонуклеотидов EG-9 - EG-14, размещенных от места разреза Sail до места разреза Bam H1. Для конструкции укороченного на три аминокислоты на концевой аминогруппе варианта лошадиного гамма- интерферона используют олигонуклеотиды Е6-15и EG-1 б вместо олигонуклеотидов EG1 и EG-2. Комплементарные олигонуклеотиды парами подвергают фосфорилированию на 5 -конце. По 100 пмоль обоих олигонуклеотидов (например, EG-3 и EG-4, EG-5 и EG-6 и т.д.) инкубируют Ч О ед. Т4-полинуклеотид0 ной киназы при 37°С в течение 10 мин в 9 мкл реакционного буфера (70 мМ трис-HCI, рН 7,6. 10 мМ хлористого магния, 5 мМ ди- тиотреитола), 2 мкКч ( ) АТФ. Затем добавляют 1 мкл раствора 10 мМ АТФ и

5 инкубируют при 37°С в течение 50 мин. Реакцию прекращают путем 10-минутного нагрева до 95°С. В целях предотвращения последующего связывания концов ДНК олигонуклеотиды EG-1, EG-15, EG-9 и EG-14 не

0 фосфорилируют. После инактивации пол- инуклеотидкиназы их смешивают с соответствующимкомплементарнымолигонулеотидом, нагревают до 95°С в течение 5 мин и охлаждают до комнатной

5 температуры. Смеси олигонуклеотидов EG-1 + EG-2 (или EG-15 и EG-16), EG-3 + EG-4, EG-5 + EG-6 и EG-7 + EG-8 объединяют, смешивают с 1 мкл 5 М хлористого натрия, нагревают до 70°С в теченине 5 мин и

0 охлаждают до комнатной температуры. К раствору добавляют 5 мкл 10 мМ АТФ, 2 мкл дитиотреитола, 1,5 мкл 10 х буфера лигиро- вания (0,66 М трис-HCI, рН 7,2, 1 М хлористый натрий, 100 мМ хлористого магния, 10

5 мМ ЭДТУК, 50 мМ дитиотреитола) и 80 ед. Т4 ДНК-лигазы и инкубируют при 4°С в течение 48 ч. За ходом реакции лигирования наблюдают путем разделения электрофорезом в 5%-ном полиакрилэмидном геле фраг0 ментов ДНК небольшой части реакционной среды и последующей ауторадиографми. Аналогично связывают один с другим шесть олигонуклеотидов EG-9 до EG-14. Реакцию прекращают экстракцией фенолом и хлоро5 формом, ДНК выделяют осаждением этанолом.

Стадия 6. Введение синтетического гена в плазмиду pRH-100,

10 мкг ллаэмиды pRH-ЮО расщепляют

0 рестри ктазой Sad в 100 мкл реакционного буфера и этим инактивируют путем 10-минутного нагрева до 70°С. ДНК обрабатывают фрагментом Кленова при 25°С в течение 30 мин в присутствии всех четырех дезокси5 нукле отидтрифосфзтов, каждый из которых берут в количестве10 мкМ. Реакцию прекращают экстракцией смесью фенола с хлороформом, ДНК концентрируют осаждением этанолом. В результате этой обработки за триптофановым промотором образуется тупой конец ДНК, который заканчивается трансляционным стартовым кодоном АТС. Линеаризированную плазмидную ДНК расщепляют рестриктазой ВатН1 и векторную часть выделяют электрофорезом в агароз- ном геле.

50 нг подготовленного таким образом плазмидного вектора pRH-ЮО смешивают с 20 пмоль лигированных олигонуклеотидов EG-1 до EG-8 и EG-9 до EG-14 и в 10 кмл буфера лигирования (66 мМ трис-HCl, рН 7,2, 100 мМ хлорида натрия, 10 мМ хлорида магния, 1 мМ ЭДТУК, 5 мМ дитиотрейтола, 1 мМ АТФ) инкубируют 1 ед. Т4-ДНК-лигазы при 14°С в течение 24 ч. Обработанные кальцием клетки E.coli 1M-101 трансформируют этой лигазной смесью и инкубируют при 37°С в течение ночи. Из полученных трансформатов выделяют плазмидную ДНК, структуру которой определяют ре- стрикционным анализом и анализом последовательностей вставки Hind 111-Bam H1, Плазмиду желаемой структуры для экспрессии зрелого лошадиного интерферона типа гамма обозначают как pEqG-YYC1. Анало- гичным образом олигонуклеотиды EG-15, EG-16, EG-3 до EG-8 и EG-9 до EG-14 клонируют в вектор pRH-ЮО с тем, чтобы получить укороченный на три аминокислоты лошадиный интерферон типа гамма. Плазмиду же- лаемой структуры обозначают как pEqG-QAA1.

Стадия 7. Экспрессия интерфероновой активности штаммом E.col HB101, содержащим плазмиду pEq-YYC1 или pEqG- QAA1.

100 мл бактериальной культуры инкубируют при 37°С и при интенсивном встряхивании в следующей, не содержащей триптофана в среде (данные на литр среды): 10 г фосфата аммония, 3,5 г гидрогенфосфа- та калия, рН 7,3 с помощью гидроокиси натрия, 0,5 г хлористого натрия, 21 г Cas-аминокислот (подвергнутых кислотному гидролизу), 11 г глюкозы, 1 мМ сульфата магния, 0,1 мМ хлорида кальция, 1 мМ тиамина- HCI, 20 мг L-цистеина, 20 мгЗ-/3- индол акриловой кислоты. Кроме того, среда может содержать еще 50-100мг ампициллина. После инкубации среду центрифугируют при 4000 об/мин в течение 5 мин, осадок суспендируют э охлажденном буфере (50 мМ трис-HCl, рН 8,0, 30 мМ хлорида натрия), взятом в количестве 1/10. Клетки дважды в течение 30 с разрушают ультразвуком (при 20 кГц, 100 Вт) Остатки разрушенных клеток удаляют цен грифугированием в течение 10 мин при 10000 об/мин при 4°С и после стерилизующей фильтрации надосадочную жидкость проверяют на интерференовую

активность путем определения цитопатиче- ского эффекта везикулярного вируса стоматита (ВВС) или вируса энцефаломиокардита (ВЭМ).

Тест-система: клетки NBL-б (АТСС CCL 57, клетки лошадиного зпидермиса)/ВВС.

А 549 (АТСС CCL 185, клеточная линия опухоли легких человека)/ВЭМ. Титр нг клетках А 549 нормируют на международные единицы с помощью стандарта человеческого интерферона. Штамм E.coli CSR603 трансформируют плазмидами, бактерии селекционируют на содержащих ампициллин агаровых плитках. Для приготовления макси-клеток и маркировки протеинов клетки выращивают при 37°С до оптической плотности 0,5 при 600 нм в 15 мл среды (см. стадию 7) без индолакриловой кислоты и 10 мл этой культуры в качающейся чашке Петри, облучают в течение 5 с с помощью установленной на расстоянии 50 см от чашки лампой (15 Вт), после чего инкубируют при 37°С в течение 1 ч. Культуры смешивают с 100 мкг/мл D-циклосерина, инкубируют при 37°С в течение 14 ч, бактерии отделяют путем центрифугирования. Клетки дважды промывают 5 мл солевого раствора Хершей, в 5 мл среды Хершей суспендируют 20 мкг/мл индоакриловой кислоты и инкубируют при 37°С в течение 2 ч. К каждой культуре добавляют 5 мкКи/мл 35S- метионина (1000 Ci/ммоль) и встряхивают при 37°С в течение 1 ч. Клетки отделяют, лизуют в буфере для электрофореза, содержащем ДСН и 2-меркаптоэтанол, и протеиныразделяютв15%-номполиакригамидном геле.

Состав солеЕС-го раствора Хершей (на 1 л):

NaCI5-4 г

KCI3,0 г

,1 г

CaCl2 2H2015мг

MgCb 6H200,2 г

бНаО0,2 мг

КН2Р0487 мг

Трис-НС 12,1 г

рН7,4.

Состав среды Хершей (на 100 мл солевого раствора Хершей):

2 мл20% глюкозы

0,5 мл2% треонина

1,0 мл1 % лейцина

1,0 мл2% пролинз

1,0мл2% аргинина

0,1 MI0,1% тиамина

Ауторадиографию высушенного геля осуществляют 2 дня при -80°С на рентгеновской пленке с использованием усиливающей пленки. В качестве стандарта

(Л

олекулярного веса применяют смесь С- етилированных протеинов. В качестве контроля применяют плазмиду pER103, коорая содержит только промотор без гена интерферона, и плазмиду pER21/1, которая содержит две копии гена человеческого инерферона типа АльфзЗаго.

Стадия 8, Доказательство наличия гомологичных последовательностей в лошаином геноме с геном ЕдИФ-у.

30 мкг высокомолекулярной лошадиной НК (см. стадию 1) полностью переваривают с помощью 60 ед. соответствующего ре- стракционного фермента в 200 мкл реакционного объема и каждый раз 10 мкг этой разрезанной ДНК разделяют по вели- чине в 0,8%-ном агарозном геле. После переноса на нитроцеллюлозные фильтра, денатурации и фиксации ДНК каждый фильтр гибридизуют 17 ч при 65°С, бхбуфер SSC, 5 х раствор Денхардта, 0,1 % ДСН, 20 мкг/мл денатурированной ДНК из спермы лосося в присутствии примерно 6х106срт радиоактивно маркированной пробы.

В качестве пробы для ЕдИФ-у применяют фрагмент из плазмиды pEaG-YYd, кото- рый содержит последовательность/ кодирующую весь зрелый интерферон. Затем фильтры промывают 4 раза в течение 45 мин при 65°С с помощлью 0,3xSSC./45 мМ хлрида натрия, 4,5 мМ цитрата натрия, 0,1 % ДСН. Ауторздиографию осуществляют на рентгеновской пленке с использованием усиливающей пленки при -80°С 8 течение 7 дней.

Стадия 9. Экспрессия лошадиного интерферона типа ) в E.coli HB101/pEG- QAA2 и HB101/pEgG-QAA3.

Для достижения улучшенной экспрессии используют улучшенные экспрессион- ные векгоры и улучшенное место рибосомального связывания.

Улучшенные экспрессионные векторы основаны на промоторе trp из Serratia marcescens (Sma), который в облгсти -35 путем замены основания (pRH281) приравнен к консенсусной области -35, или на гибридном промоторе trp, который имеет первую богатую А/Т область Е.coil (Eco) или вторую богатую А/Т область плюс промотор Sma (pRH282), В качестве места рибосомального связывания испочьзуют энтеротоксин II из E.coli.

pRH281/5.

Известным образом Синтезируют следующие олигонуклеотиды: Trp-1: 51 -AATTGACGCTG-31 ; Trp-3:51ATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTT-GACATTGCCTTCGCGAACCAGTTAACTAGTАСАСА-31 ;

Trp-5:51-AGTTCACGGCTCGAGACGGTAAGGAGGTTT

AATATGAGCTCGAATTCAT-31 ; Trp-2: 51 -TTAGCGATCAGCGTC-31; Trp-4:51-CGTGAACTTGTGTACTAGTTAACTGGTTCGCGAAGGCAATGTCAACCCTCTTTTTGCAAT

GTT-31 ;

Trp-6:51-CGATGAATTCGAGCTCATATTAAACCTCCTTACCGTCTCGAGC-31 ,

По 100 пмоль олигонуклеотидов Тгр-2 Тгр-5 раздельно фосфорилируют в 10 мкл реакционного раствора. Тгр-1 и -2, Тгр-3 и -4 и Тгр-5 и -6 подвергают гибридизации путем кипячения и медленного охлаждения. Растворы пар олигонуклеотидов соединяют и

добавлением Т4-ДКА лигазы. 3 мкг рАЕ153 режут с помощью EcoR1 и С1а1. После очистки большого фрагмента к нему прибавляют приблизительно 20 пмоль олигонуклеотидов и лигируют. Затем ДНК

трансформируют в E.coli HB101 и плазмиды из полученных колоний выделяют. Фрагмент Pst-Hind111, содержащий промотор, подвергают анализу последовательностей. После подтверждения желаемой последовательности выбирают плазмиду и обозначают как pRH281/5.

Последовательность промоторной части следующая:-35 5LGAATTGACGCTGATCGCTAAAACATTGT

GCAAAAAGAGGGTTGACATTGC

3 -CTTAACTGCGACTAGCGATTTTGTAACA CGTTTTTCTCCCAACTGTAACG

Xho1

/-10 Transkriptionsstart

CTTCGCGAACCAGTTAACTAGTACACAAGT- -TCACGGCTCGAGACGGTAAG GAAGCGCTTGGTCAATTGATCATGTGTTCA - -AGTGCCGAG CTCTGCCATTC RBS Sst1 EcoRi Cla i

GAGGTTTAATATGAGCTCGAATTCATCGAT-31

CTCCAAATTATAC.TCGAGCTTAAGTAGCTA-51

Преимуществами нового экспрессион- ного вектора являются оптимальная область - 35 в промоторе trp-Sma; единственное место Xho1 перед местом рибосомального связывания (МРС), что допускает замену

МРС на другое; экспрессионная плазмида содержит трансляционный старт ATG на расстоянии 5 нуклеотидов от МРС; G этого ATG является первым основанием последовательности опознавания Sst 1 (GAGCTC). Путем разреза с помщью Sst 1 и последую51щего получения прямого конца получают экспрессионный вектор с трансляционым стартом АТС, с которым можно лигировать чужой ген, начиная с первого основания рамки считывания; связь MPC-ATG не содержит ни G ни С; выбором последовательности олигонуклеотидов на 5 -конце разрушается первоначальное место разреза EcoRI, благодаря чему на З -конце промотора можно получать место мультиклонирования, состоящее из Sst1, EcoR1, Cla1 и Hind 111 (уже в рАТ153).

PRH282/5.

Аналогичным образом конструируют экспрессионный вектор pRH-282/5. Олиго- нуклеотиды Тгр-1 и Тгр-2 заменяют олиго- нуклеотидами Тгр-7 и Тгр-8: Trp-7;51VATTGCCCGTTCTGGATAATGTTTTTTGCGCCGACATCATCATGCT-3 ; Тгр-8:

TTAGCGATCAGCATGATGATGTCTCGGCGC AAAAAACATTATCCAGAACGGGC-31.

Последовательность промоторной части в pRH282/5 следующая:

51GAATTGCCCGTTCTGGATAATGTTTTTTGC-GCCGACATCATCATGCTGAT

з CTTAACGGGCAAGACCTATTACAAAAAACG - CGGCTGTAGTAGTACGACTA -35CGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACATTCCCTTCGCGAACCAGT GCGATTTTGTAACACGTTTTTCTCCCAACTGTAACGGAAGCGCTTGGTCAXho1

-10lTranskriptionsstart RBS TAACTAGTACACAAGTTCACGGCTCGACGG TAAGGAGGTTTAATATGAATTGATCATGTGTTCAAGTGCCGAGCTCTGCCATTCCTCCAAATTATACTSst EcoRI Clal G CTCG AATTCATCG AT-31 CG AG CTTAACTAG CTA-51

1 мкг pUC18 разрезают с помощью Bam H1 и5аИ,Из10мкгЕдСС)АА1 путем разреза с помощью Bam H1 и Sail выделяют и дефосфорилируют вторую половину гена лошадиного интерферона типау.20 нг вектора лигируют с 100 нг вставки и ДНК трансформируют в E.colt JM101. Плазмиду одной колонии анализируют путем переваривания рестрикционными энзимами и обозначают как рСМ1.

pCN3.

Первую половину синтетического гена вместе с местом рибосомального связывания конструируют из олигонуклеотидов:

5 5 EqG-1:5L

-AGCTTCCCTCGAGAGGTTGAGGTGATTTAT GCAGGCTGCTTTCTTTAAAGAAATCGAAAA CCTGAAAGAATACTTCAACGCTCGTAACCC 5 AGACGTTGGT-31:

EqG-2:5L

-GACGGTGGTCCGCTGTTCCTGGACATCCT GAAAAACTGGAAAGAAGACTCTGACAAAAA GATCATCCAGTCTCAG-31;

0 EqG-3:51-ATCGTTTCTTTCTACTTCAAACTGTTCGAAAACCTGAAGAAAGACAACCAGGTTATCCAGA AATCGATGGACACTATCAAAGAAGATCTGT TCGTTAAATTCTTCAACTCGTCGACTCCG-31

5 ;

EqG-4:

-AATTCGGAGTCGACGAGTTGAAGAATTTAA CGAACAGATCTTCTTTGATAGTGTCCATCG ATTTCTGGATAACCTGGTTGTCTTTCAGGTT

0 TTCGAACAGTTTGAAGTAGAAAGAAAACGA TCTGAGACTG-31 ; EqG-5:51-GATGATCTTTTTGTCAGAGTCTTCTTTCCAGTTTTTCAGGATGTCCAGGAACAGCGGACCA

5 CCGTCACCAACGTC- 31 :

EqG-6:

-TGGGTTACGAGCGTTGAAAGTATTCTTTCA GGTTTTCCATTTCTTTAAAG AAAG CAG CCT GCCATAAATCACCTCAACCTCTCGAGGA-31.

0 По 50 пмоль олигонуклеотидов фосфо- рилируют, а именно EqG-2 вместе с EqG-5 в 7 мкл, EqG-З и EqG-8 раздельно в 8 мкл. Реакцию прекращают .путем нагрева до 100°С. К EqG-З добавляют 50 пмоль EqG-4 (1

5 мкл), а к EqG-8 - 50 пмоль EqG-1 (1 мкл). Растворы еще раз нагревают до 100°С и медленно охлаждают. Растворы олигонук- леотидных пар соединяют и лигируют Т4- ДНК-лигазой в 30 мкл, 2 мкг pUC18

0 расщепляют EcoRI и Hindi 11, векторную часть очищают в геле и растворяют в 50 мкл воды. 40 нг вектора и около 2 пмоль лигиро- ванных олигонуклеотидов подвергают лиги- рованию в среде 10 кмл, Полученной ДНК

5 трансформируют клетки E.coli JM101, Вставка EcoR1-Hind111 некоторых из полученных плазмйд переклонируют в М13тр9 и устанавливают последовательность, Выбирают плазмиду с требуемой последова0 тельностью и обозначают как pGN3. pGN20.

Около 3 мкг pGN1 и pGN3 расщепляют Hindi 11 и Sail. Очищают в геле вставку pGNS H вектор (вторая половина гена Eq5 ИФ- у из pGN1). 0,2 мкг pGN3 лигируют примерно с 0,05 мкг вставки pGN3 и ДНК трансформируют в E.coli JM101. Плазмиду полученного клона выбирают после проверки рестрикционного рисунка и обозначают как pGN20.

pEqG-QAA2 или pEqG-QAA3,

Примерно из 10 мкг pGN20 выделяют Xho1-EcoR1 фрагмент, содержащий ген синтетического гамма-интерферона лошади вместе с местом рибосомзльного связывания зн еротоксинз III из E.coll. рЯН281/5 или pRH282/5 расщепляют рестриггаэамин Xhol и EcoRI. 20 нг вектора лигируют с 20 нг фрагмента, полученной ДНК трансформируют клетки E.coli НВ10, из которых затем выделяют плэзмиды и проверяют рестрикцмонным анализом. Выбирают плазмиду, которую обозначают как pEqG- QAA2 (вектор pRH281/5) или (вектор: pRH282/5).

Опыт по проверке активности интерфе- °рона типа гамма.

Росшую в течение ночи культуру Е.соН HB101/pEqG-QAA2 или HB101/pEqG-QAA3 разбавляют в соотношении 1:100 LB-буфе- ром (100 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л хлористого натрия. 50 мг/л ампициллина) и далее инкубируют при 37°С. После достижения оптической плотности 0,3 (600 нм) добавляют 50 мг/л ивдолакри- ловой кислоты и культуру инкубируют в течение дальнейших 2 ч при 37°С. Бактерии1 отделяют центрифугированием и разрушают путем ультразвуковой стерильной фильтрации., надосадочную жидкость испытывают на клетках NBL-6(ATCCCCL57) на активность гамма-интерферона, причем в качестве вируса используют везикулярный вирус стоматита. Лизаты обеих трансформированных бактериальных культур (Е.соН HB101/pEqG QAA2 или HBIOI/pEqG- QAA3) проявляют около 0,1-1 мпн ед,/мл мнтерфероновой активности. В качестве контроля испытывают идентично полученный лизат Е.соН HB101/pRH281. Этот контрольный лизат проявляет меньше чем 100 ед./мл.

Формула изобретения

Способ получения -интерферона лошади, закпючающийся в том, что v, печени лошади при рН 8,0 экстрагируют ДНК с использованием фенола, элгаат дичямзуют ДНК осаждают этанолом, центрифугируют в буфере рН 8,0, дизлизуют и осаждают этанолом ДНК размером более 50 т.п.н,, полученную ДНК расщепляют эндонуклеазой Sau ЗА при рН 7,5, Фракционируют с помощью электрофореза, выделяют фрагменты длиной 10-23 т.п.н., дефосфорилируют их и клонируют в векторе EMBL 3 (-ЗА), путем скрининга клонированных фрагментов ДНК отбирают фрагмент, гомологичный гену гамма-интерферона человека, отобранный фрагмент размером 4,6 т.п.н. расщепляют рестрмктазой Bam HI, встраивают в вектор pUC9, полученными рекомби- нантными ДНК трансформируют бактерии Escherlchia coll JM101, отбирают плазмиду рАН111, содержащую Bam H1, синтезируют

фрагмент, состоящий из 14-ти олигонуклео- тидоа EG 1 - EG 14, который встраивают в плазмиду рННЮО по сайту рестрикции Sac путем затупления выступающих концов ДНК обработкой фрагментом Кленова в при0 сутствии четырех дезоксинуклеотидтрифос- фатов и дополнительным гидролизом Ват Н1, далее полученной рекомбинантной ДНК трансформируют бактерии Е.соН JM101, продукты трансформации, содержащие

5 плазмиду pEqG-YYC1 или pEqG-QAA1, культивируют, анализируют на интерфероновую активность выделенный и очищенный ионообменной хромаюграфией и гель-хроматографией белок, синтезируют олигонуклеотиды

0 Тгр 1-6 или Тгр 7-8 со следующими нуклео- тидными последовательностями: Тгр-1: 5 -AATTGACGCTG--3 : Trp-3:51-ATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTT

5 GACATTGCCTTCGCGAACCAGTTAACTAGT АСАСА-31 ;

Trp-5:51-AGTTCACGGCTCGAGACGGTAAGGAGGTTTAATATGAGCTCGAATTCAT-31 ;

0 Тгр-2: 5 -TTAGCGATCAGCGTC-3 : Trp-4:51-CGTGAACTTGTGTACTAGTTAACTGGTTCGCGAAGGCAATGTCAACCCTCTTTTTGCACA ATGTT-31 ;

5 Trp-6:51-CGATGAATTCGAGCTCATATTAAACCTCCTTACCGTCTCGAGC-31 ; Trp-7:51-AATTGCCCGTTCTGGATAATGTTTTTTGCGC

0 CGACATCATCATGCT-3 ; Тгр-8:5-TTAG CGATCAG CATGATGATGTCGG CG САА AAAACATTATCCAGAACGGGC-3 затем получают фрагменты, кодирующие

5 промотор и место рибосомного связывания, лигируют их с большим фрагментом разрезанной EcoRI и СЫ плазмиды рАТ153, трансформируют полученной ДНК штамм бактерии E.coii HB101 и выделяют плазми0 ды pRH281/5 или pRH282/5, параллельно вектор PUC18 обработанный Bam H1 и Sail эндонуклеазой, лигируют с второй половиной синтетического фрагмента, полученного в результате переваривания плазмиды

5 EqG-QAA1 эндонуклеазами Bam H1 и SaM и дефосфорилирования, полученной ДНК трансформируют бактерии Е.соН JM101 и выделяют плазмиду pGN1 или вектор pUC18, обработанный эндонуклеазами EcoRI и Hind 111, лигируют с олигонуклеогидами EqG-1 - EqG-6 или EG3 - ЕС6,пол- учениой ДК трансформируют бактерии E.coli JM101, выделяют плазмиду pGN3, плаэмиды pGN1 и pGN3 обрабатывают Hind 111 и Sail, подвергают гель-очистке с последующим лигированием, трансформируют полученной ДНК бактерии E.coli JM101 и выделяют плазмиду pGN20, далее выделяют Xho1-EcoR1 фрагмент ДНК, содержащий синтетический гену-интерферона с местом

рибосомного связывания E.coll Enterotoxln И, который лигируют с плазмидами pRH 281/5 и pRH 282/5, обработанными Xho1 и EcoR1, эндонуклеазами, полученной ДНК трансформируют штамм бактерии E.coli НВ101, продукты трансформации, содержащие плазмиду pEqG-QAA2 или pEqG-QAA3, культивируют с последующим выделением интерферона и его очисткой путем ионообменной хроматографии и гель-хроматографии.

Изобретение относится к способу получения нового интерферона, в частности к способу получения лошадиного интерферона типа у. Способ получения у-интерферона лошади заключается в том, что из печени лошади выделяют высокомолекулярную ДНК, которую обрабатывают эндонуклеэ- зой Sau ЗА, полученные фрагменты длиной 1020 т.п.н. отделяют, дефосфорилируют. клонируют в лямбда-векторе и выделяют ген интерферона из полученной библиотеки ДНК, реклонируют ген в векторы экспрессии, полученными рекомбинантными ДНК трансформируют штаммы Е. coli с последующим выделением и очисткой целевого продукта.