Способ получения лошадиного @ - и @ -интерферона Советский патент 1991 года по МПК C12N15/20 

Изобретение относится к биотехнологии.

Способ получения лошадиного OL - у ft-интерферона заключается в том, ЧЕГО ткань печени лошади инкубируют $ присутствии буфера, рН 8,0, экстрагируют ДНК с использованием фенола диализом и осаждением ДНК этанолом, полученную ДНК центрифугируют при 40000 об/мин в буфере, рН 8,0, диали- зуют и осаждают этанолом ДНК длиной более 50 к.Ъ. (пар оснований), которую подвергают частичному перевариванию эндонуклеазой Sau ЗА в присутствии буфера, рН 7,5, полученные фрагменты фракционируют путем электрофореза, выделяют фрагменты длиной 10-23 к.Ь,, которые после дефосфори лирования клонируют в векторе

ЕМВЬЗ(-ЗА), полученную ген-библиотеку ДНК подвергают скринингу с помощью радиоактивно маркированных ин- терфероновых генов человека с выделением гомологичных последовательностей, при этом для получения fltf -ан- терферона Hind Ill-Фрагмент клона Eg-ftil лигируют с гидролизованным с помощью Stnal и дефосфорилированным вектором pUC9, полученными рекомби- нантными ДНК трансформируют бактерии Escherichia coli IM 101 и отбирают устойчивые к ампициллину клоны, содержащие плазмиду рАН50, далее плазмиду рАН50 обрабатывают Hind III-эндонук- леазой и лигируют с обработанными полинуклеотидкиназой SphI-связками, получают плазмиду рАН51, плазмиду рАНЗО гидролизуют PvuII, лигируют f

С

олигонуклеотидом 5 - TGTGACCTGCCTCAC, который предварительно обрабатывают полинуклеотидкиназой, денатурируют ДНК кипячением, удлиняют олигонук- леотидную затравку с помощью фрагмента Кленова в присутствии,dATP, dGTP, dCTP и dTTP, удаляют 3 -выступ инкубацией с Т4-ДНК-полимеразой в присутствии dATP, dGTP, dCIP и dTTP, далее фрагмент лигируют с олигонуклеотидами, 12-мером 5 -AGCTTAAAGATG и 8-мером 5 -САТСТТТА полученную ДНК обрабатывают эндо- нуклеазами Hind III и Bgl II полу- ценный фрагмент длиной 190 к.Ь. лиги руют с гидролиз о ванным Hind III и Bgl II вектором рАН51, полученную плазмиду рАН5 1/2 режут Sph I и Hind III и лигируют с Hind III -

Sph I или Hind III - BatnH I фрагментом плазмиды parpATER 103 с получением экспрессионной плазмиды рАН52 или рАН 52/2, или плазмчду рАН52 гидролизу ют эндонуклеазами Sph I и EcoRI, затупляют концы ДНК с помощью фрагмента Кленова в присутствии dATP, dGTP, dCTP и dTTP, получают ДНК длиной 1,1 к.Ь., плазмиду pBR 322 переваривают с помощью Pvu II и

EcoRI, затупляют концы ДНК с помощью фрагмента Кленова и дефосфорилируют с получением ДНК длиной 2,4 к.Ь., которую лигируют с ДНК длиной 1,1 к.Ь. с получением экспрессионной плазмиды рАН53, для получения р-интерферона Pvu 11-фрагмент отобранного клона Eg--ft&, лигируют с гидролизе ванным с помощью 5таа I и дефосфорилированным вектором pUC9, полученными рекомби- нантными ДНК трансформируют бактерии E.coli IM 101 и отбирают устойчивые к ампициллину клоны, содержащие плазмиду рАНбО, затем плазмиду рАНбО обрабатывают Hgi А1-эндонуклеазой и после выпрямления 3 -выступающих концов ДНК с помощью Т4-ДНК-полимеразы тупые концы лигируют с обработанными лолинуклеотидкиназой Sph 1-связками, полученную ДНК режут Sph I и Hind III полученный фрагмент длиной 1,85 к.Ь. лигируют с разрезанной Hind III и SphI плазмидой parpATER 103, получен кую плазмиду рАН61 режут BamHI и Sail с получением фрагмента длиной 1,3 к.Ь., которой лигируют с переваренной BamHI и Sail M13tnp9-фаговой . ДНК, полученную однонитевую ДНК лигируют с олигонуклеотидом

о

5

0

5

0

5

5 -GTGAACTATGACTTG, который предварительно обрабатывают полинуклеотидки- назой , денатурируют ДНК кипячением, удлиняют олигонуклеотидную затравку с помощью фрагмента Кленова в присутствии dATP, dGTP, dCTP и dTTP и полученную ДНК осаждают, оставшиеся од- нонитевые участки ДНК переваривают с помощью SI-нукпеаэы и полученную ДНК с тупыми концами лигируют с олиго- нуклеотидами, 12-мером 5 -AGCTTAAAGATG и 8-мером 5 -САТСТТТА, полученную ДНК обрабатывают эндонуклеазами Hind III и SphI, полученный фрагмент длиной Ц1 к.Ь. лигируют с Hind II - SphI фрагментом parpATER 103 с получением экспрессионной плазмиды рАН62, полученными экспрессионными плазмидами трансформируют штамм бактерии E.coli Ш 101 и трансформанты культивируют с последующим выделением и очисткой конечного продукта.

I

Пример 1. Получение экспрессионных плазмид рАН52, рАН52/2 и рАН53.

Стадия А. Выделение лошадиной ДНК.

Замороженную ткань печени лошади размалывают в жидком азоте до порошка и в течение 3 ч при 55°С инкубируют в 0,5 М этилеидинитрилтетpa- уксусной кислоты (ЭДТА), 10 мМ трис- НС1, рН 8,0, 0,5% додецилсульфата натрия (ДСН), 0,1 мг/мл протеиназы К (20 мл/г ткани). Полученный вязкий раствор освобождают от белка путем экстракции фенолом и трехкратной экстракции смесью фенола с хлороформом и изоамиловым спиртом (25:24:1 по объему), диализуют против буфера 50 мМ , рН 8,0, 10 мМ ЭДТА и 10 мМ хлористого натрия, ДНК осаждают двумя объемами этанола. После полного высушивания в вакууме ДНК растворяют в ТЕ-буфере (10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА) при 4 С и вместе с хлористым цезием в количестве 1,273 г/мл раствора центрифугируют в течение 62 ч при 20°С со скоростью 40000 об/мин. После полного удаления CsCl-градиента содержащие ДНК фракции диализуют против ТЕ-буфера, затем ДНК осаждают двумя объемами этанола, промывают 70%-ным этанолом, высушивают и снова растворяют в ТЕ-буфере (4°С).

Готовый ДНК-препарат свободен от РНК и имеет длину более 50 к.Ь., что

определено путем электрофореза на 0,45%-ном агаровом геле.

Стадия Б. Частичное переваривание эндонуклеазой и фракционирование по размерам лошадиной ДНК.

50 мкг лошадиной ДНК двукратно ингибируют при 37°С с 1,6 ед Sau3A в 450 мкл реакционной среды (10 мМ трис-НС1, рН 7,5, 10 мМ хлористого магния, 1 мМ дитиотрейтола). Спустя 15, 25 и 40 мин отбирают по 150 мл раствора и смешивают с 15 мМ ЭДТА и путем нагревания в течение 10 мин при 70 С прекращают реакцию. После добавления 0,3 М ацетата натрия, рН 6,0, ДНК осаждают с помощью 2,5 объемов этанола После повтор ного растворения в ТЕ-буфере ДНК разделяют по величине путем электро- фореза в течение ночи на 0,45%-ном агаровом геле в ТВЕ буфере (10,8 г/л трис, 5,5 г/л борной кислоты, 0,93 г/л На2ЭДТА) примерно при 1 В/см с использованием маркеров величины Ј переваренная с помощью EcoRI и Hind III и с помощью Hind II лямбда ДНК) вырезают ДНК длиной 10 23 к.Ь., ДНК электроэлюируют в течение 3 ч при 300 В (буфер 0,1хТВЕ), очищают на колонке Элютип и дефосфо- рилируют следующим образом.

ДНК инкубируют в течение 30 мин при 37°С в 140 мкл реакционной среды (50 мМ трис-HCl, рН 9,5, 10 ммоль хлористого магния, 0,1 мМ ацетата цинка, 1 ммоль спермидина) вместе с 5 ед. кишечной фосфатазы крупного рогатого скота, добавляют следующие 5 ед фермента и инкубируют 30 мин После добавления ЭДТА до конечной концентрации 25 мМ ДНК экстрагируют однократно смесью фенола с хлороформом и иэоамиловым спиртом (25:24:1 по объему), двукратно смесью хлоро форма с изоамиповым спиртом (24:1 по объему) и трехкратно диэтиловым эфиром, осаждают этанолом, высушивают и растворяют в 0,1хТЕ-буфере.

Стадия В. Построение лошадиной ген-библиотеки ДНК

Дефосфорилированные длиной 10- 23 . фрагменты лошадиной ДНК клонируют в лямбда-векторе, лямбда- EMBL3 (или-ЗА) , с тупыми G-A-T-C- концами, полученными путем удаления внутреннего BamHI-фрагмента фаговой ДНК.

I

10

42956°

8 мкг фрагмента EMBL-3A лигируют примерно с 5 мкг фрагментов длиной 10-23 к.Ь. лошадиной ДНК длиной 10- 23 к.Ь. в присутствии 10 ед. Т4-ДНК лигазы, инкубируют в течение ночи при 14°С и один день при 4°С в 50 мкл реакционной среды (66 мМ , рН 7,2, 0,1 М хлористого натрия, 10 мМ хлористого магния, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ дитиотрейтола, 0,5 мМ АТФ). Продукт лигирования упаковывают в зрелые фаговые частит цы с использованием in vitro лямбда- упаковывающей системы

Компоненты этой системы, т.е. ультразвуковой экстракт (УЭ), лизат, получаемый путем замораживания-размораживания (ЛЗР), буферы Ml и А, приготавливают известным способом, 10 мкл продукта лигирования в течение 2 мин инкубируют при комнатной температуре вместе с 25 мкл УЭ, который так же,как и ЛЗР, в течение

25 30 мин инкубируют во льду, смешивают с 100 мкл ЛЗР и инкубируют далее в течение 60 мин при комнатной температуре Смесь разбавляют 150 мкл лямбда-разбавителя (100 мМ трис-НС1,

30 рН 7,5, 10 мМ сульфата магния, 1 мМ ЭДТА) и хранят при 4°С

Часть упакованных лямбда-фагов

15

20

титруют на Eocoli NM 528 SupF. В целом получают примерно 1 неза-

висимых лошадиных рекомбинантных ДНК Остаток упакованного материала размножают путем нанесения на содержащие штамм NM 528 и сульфат магния LB-агаровые пластины плотностью

30000 пятнообразующих единиц на 13,5 см пластины.

Стадия Г Скрининг лошадиной ген- библиотеки

По 10 мкг высокомолекулярной ло-

шадиной ДНК полностью переваривают с помощью EcoRI (Hind III), путем электрофореза разделяют в 0,8%-ном агаровом геле и переносят на нитро- целлюлозные фильтры Hind III-фраг-

мент плазмиды рЕКЗЗ длиной 845 к,Ъ., который содержит всю кодирующую белок область для зрелого человеческого р6 2АРС-интерферона получают маркированную Р-32 ДНК.

Нитроцеллюлозные фильтры предварительно гибридизируют в течение 7 ч при 65°С в (0,9 М хлорисг того натрия, 50 мМ гидрогенфосфата

натрия 5 мМ ЭДТА, рН 7,4), 5 раст вор .Денхардта (0,1% Фиколла, 0,1% поливинилпирролидона, 0,1% альбумина сыворотки крупного рогатого скота), 0,1% ДСН, 20 мг/мл ДНК из спермы лосося и затем гибридиэируют .в таком же растворе, но без ДНК из спермы лосося, с использованием 13-10 срт маркированной пробы После инкубации при 65°С в течение ночи фильтры промывают четырехкратно в течение 1- 1,5 ч в 3xSSC (0,45 М NaCl, 45 мМ цитрата натрия), 0,1% ДСН при 65°С и экспонируют в течение 7 дней на рентгеновской пленке фирмы Кодак с помощью усиливающих пленок фирмы Кодэк Появлени-2 нескольких полос доказывает наличие семейства интер- фероновых генов у лошадей, как оно было ранее обнаружено у крупного ро- гатого скота, свиней и у человека

Поэтому для скрининга генов интерферона в библиотеке лошадиных ДНК применяются такие же условия гибридизации

600000 рекомбинантных лямбда-фагов наносят на содержащие штамм E.coli NM 528 пластины плотностью 30000 пятнообразующих единиц на 13,5 см пластины Четырехкратные нитроцеллюлозные реплики готовят с каждой пластины После высушивания в течение 2 ч при 80°С фильтры промывают в течение 1,5 ч при 65 С в 1 М хлористого натрия, 10 мМ трис- НС1, рН 8,0, 0,17. ДСН, предварительно гибридизируют в течение ночи и по 2 реплики каждой пластины гибри- дизируют в течение 24 ч с использова нием на 1 фильтр 1, сртп пробы радиоактивного оЈ-интерферона После трехкратно повторенного скрининга получают 8 клонов лошадиного { -интерферона, которые дают положительные сигналы гибридизации

Стадия Д Характеристика ре комби нантных фагов I

Из 7 гибридизирующихся с человеческим Об-интерфероном рекомбинантных ДНК готовят фаговую ДНК. ДНК переваривают рестриктазами EcoRI, BamHI, Hind III, PstI, Bglll, Sail, Smal и путем электрофореза разделяют в 0,8%-ном агаровом геле Величина гибридиризующих фрагментов определяется по способу Саусерна Положение рестрикционных мест внутри лямбда-

10

15

20

25

(

- 40

6429568

вставки определяют после частичного рестрикционного переваривания лямбда- ДНК, маркировки правых или левых тупых концов лямбда-ветвей синтетическими, маркированными Р-32 олигонук- леотидами и электрофореза в 0,45%- ном агаровом геле

Стадия Е Субклонирование гена лошади ного&б -интерферона

Рестрикцнонный фрагмент клона Eg-odl, который гибридизуется с маркером чело вече ско го об интерферона, субклонируют в векторе pUC9 плазми- ды pBR322. Вставка чужого ДНК-фрагмента приводит к прерыванию lac z-гена ft - галактозидазы и таким образом изменяет фенотип трансформированного плазмидой штамма E.coli IM 101 от lac до lac. Колонии бактерий с фенотипом 1ас отбирают по белой окраске.

Hind Ill-фрагмент длиной 3,2 к.Ь. из клона Eg-0Ј-l элюируют из агарового геля, очищают на колонке Элю- тип-Д, лигируют с 40 нг разрезанного с помощью Slal и дефосфорилирован- ного вектора pUC9 в примерно 10-кратном молярном избытке, трансформируют в E.coli IM 101 и наносят на LB-топ- агар с 0,2 мг/мл БХИГ (5-бром-4- -хлор-З-индолил-Д-О-галактозид) , 0,17 мг/мл ИПТГ (изопропилтиогалак- тозид) и 0,1 мг/мл ампициллина Белые колонии выращивают в 5 мл LB-бульона с О,1 мг/мл ампициллина в течение ночи при 37 С с последующим скринингом Полученную при этом плазмиду обозначают как рАН50.

Стадия Ж. ДНК-последовательность гена лошадиного Об-интерферона из клона Eg-Cil.

Hind Ill-вставку плазмидыvpAHSO длиной 3,2 к.Ь. подвергают анализу последовательностей по методу Санге- ра, 50 мкг плазмидной ДНК из рАН50 полностью переваривают рестриктазой Hind III, фрагмент длиной 3,2 , выделяют из 1%-ного агарового геля и очищают. 15 мкг этого фрагмента в 100 мкл среды лигирования лигируют /с 14 ед. Т4-ДНК-лигазы при 14°С в течение ночи и затем при 4°С следующие 4 дня Лигированную ДНК фрагмен- тируют с помощью ультразвука импульсами в 20 с в течение 140 с в ледяной бане. ДНК-фрагменты в течение 2 ч при 14°С в 250 мкл реакционной среды (50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ

30

35

45

50,

55

91642956Ю

хлористого магния, 1 мМ дитиотренто-ной репликативной формой бактериофагла, 0,5 мг/мл альбумина сывороткига М13тр8 и трансформируют E.coli

крупного рогатого скотэ, по О,1 мМIM 101. Однонитевую ДНК полученного dATP, dCTP, dCTP, dTTP) обрабатывают , рекомбинантного фага выделяют и пос15 ед.большого фрагмента полимеразы-1ле связывания с одним синтетическим

из E.coli (фрагмент Кленова) . Послеолигонуклеотидом осуществляют син

концентрирования путем осаждения второй нити в четырех отдельных

нолом ДНК разделяют в 1%-ном агаро-реакциях с использованием фрагмента вом геле и ДНК-фрагменты длиной 10 Кленова ДНК-полимеразы 1 из E.coli. О,,0 к.Ь. выделяют и очищают.Ниже приводятся нуклеотидная

Примерно в 10-кратном молярном избыт-Hind Ill-вставки плазмиды рАН50,

ке фрагменты лигируют с разрезаннойаминокислотная и полная нуклеотидная

рестриктаэой Smal и дефосфорилирован-последовательности Eg-рб-интерферона.

«л:.:ГГА Г111А5-1ГСЛГ1СИМ1СГТ5С 51еА:зАйА1Л «ГДЛ«ПГАОЧ:ТГ1СТГТ 7 ПСТ«тТ.А5Г М #{ 5С«М ™СЧШГга5ТШIU

ш «ть у:ллсбк; мгеетоис- чягессак: з

иТГО« ҐАТЈУ 7«ПСШШТ« АСАГКАСШ6ва« J

W-IS-I -3-IIJ

fet «I In fra tr In 1м Rtt «I In Til 111 In r Cri Hii S«r ll« Cy ttr U StrfFQjJip Ln Г9 n «

ATS ta ere ест ш tec ft cis «is ccc trt ITB ere crc c rsc rec rc TIC гст ств ш т SAC c;e en c «x ш

19ISИ23 3

J«r In Sly я Ш V) 7il Ln Ittt Ln In flf SI 1rt «г; Arf II Pr« P $«(cJTJlio lyi A$p Vf In lie fh (Ir

KC tie esc я AW ETC m «те стс cie es см «те «5 « АТС тсс crc ттс тсс тес ств ил sec ASA ш esc ш ш ж

W43XЯМ43

Й1 Гго Sin fl« Vil fbt Atf (I; AM 51 П Ar« Lri fro Alt lit br Mi l HI tl« THr lit Sti SJe И П 4it IN

nt ccc s« «те m мс кс АЛ с« гтс си А« ест см «ее «тс тег see etc САГ м чх тс см см АТС пс сх стс и

70ПWСtoП

fl S«r Thr tif «1| Sir S«f «a III Trf to Ui S«r LM In 111 Lri Ln Tfr TV ftr In Туг Jlt He In TV fli In fit

nc AK iu «вес тез тп tec re та ад w sc стс о ж л пс ГАС «сг ш стс ш САС см ст$ «т ss cie SM w

IN1W- 11«(131Л13

Ui(r|ln.:(r tit Til (If VU ill 81 TV fri In IKt As П« Aip 5«f In LH III Vii Ar Arg Tjr П| tb V9 II

ta T6I CT A6C US M ПС KS CTf 6M SM «С CCt СП ATg A«C 6A6 6AC TCC CTS CTS GC7 tT6 W« ASA ТДС ITC CM АЫ JTC 174

:«шi«itsIM . is

Alt Ln Tjr In It в П« In IT ff S «( ff SI lit Та Arf Oil Ui tit Htt Ar| Str П S«r Str Sir Ttr DM

tCT СТС («Г СТв CM GAS AM Mft T«C AK СП ПТ «СС ТИ 6А5 АТС «ТС ASA SCA вМ АТС ATS ЛИ ТСС ПС ТП ТО ТСС АС ИС Ш

1Й

IM fr til 8«f

ГТС CCS CM AST TM (8М«Д«ЖГ6К«ОТШТСААиТЕ МТЮ7ПиП{ иТААТАТСАС tOTt

шмт« 1 хтб«гтвллтслттттаюшт1шт HW

тпАтлЈятлтйт«тт тАге т пАтптт«пбаАГАОГТАгет5САОтпАСдсгегАбгттАйтдгА№ u

штАптттстетшсАтПЗГтаийСтвтАбЛА 11Л

: Пат СаГЫГТвТиТАТТСААША6А«ТАЛА: ТАйЮТО1СТААбаТКПвТАиПЕ«Та«Ы 134

ГШГ|1т1ППТПСв(ТА«аГМ1МС«ТАДС1МПК1ГТиТМГТ6А«Т«ТТМиАЩПМА1ТААШU7

1ТМ1Я1МТвС 1 иМААМ1ПА5ТЮиЛТСТССХТ6аАТАПССА$ПТССААТПКА С 1712

ОТКЕА ЈА:5& ЕААТ«АЕААААС6ЖТТШДПСАТТеСТАЗ€АаТТСААССП«иАе9б6АбБАСАА IMI

Јг«$я:и1езтздЈгздсдт$тм5шттААКтсшАбААЕ«сод :о:о

и

5 1«езитстшбтитв5Алпис

тста мз ад: «54с;шш

«игтб :с итткц;бтимшт

гтйтстзглиттз САКСАсти:

«5й;;: сгк«г«1:и тгс1еда 51йадект™

ииэш пс вмюкм«оиштаа я :

18С СС«Л«С ТС1СйСТ51СааШСП«Т6« ™2

яаднтшв ииттиштааттемаш

«Я1 го «стбаытю«л« « « 5™

1642956

12

Изобретение относится к биотехнологии. Получают ген-библиотеку ДНК, ткани печени лошади, осуществляют скрининг с помощью радиоактивно мар кированных генов человека с выделением гомологенных последовательностей , клонируют к ДНК в случае Oi-ин- терферона в вектор pUC 9 с последую щим реклонированием к ДНК в вектор, parp ATER 103 и pBR 322 с получением экспрессионных плазмид, в случае ft-интерферона клонируют к ДНК в вектор pUC9, реклонируют фрагмент к ДНК, кодирующий -интерферон в плаэмиду parpATER 103 и конструированием экс- прессионной плазмиды рАН62, полученные плазмиды экспрессии трансформируют в штамм бактерий E.coli IM 101, трансформанты культивируют с последующим выделением и очисткой целевого продукта. 2 з.п. , 1 табл.

« :ПКГКШ;АА«СГГ

Стадия К. Конструкция экспрес- сионных плазмид рАН52, рАН52/2, рАН53.

20 мкг плазмиды рАНЗО (см. ста дню Е) переваривают с помощью 30 ед. Hind III и ДНК-фрагмент длиной 4,2 к.Ь., который содержит весь ген uil-интерферона, выделяют из агарового геля с помощью ДЕ81-бумаги и очищают. Для этого после разделе- ния ДНК-фрагментов в агаровом геле перед и после выделяемой ДНК-полосы вырезают щель, в которую вставляют полосу ДЕ81-бумаги. Электрофорез продолжают до тех пор, пока желаемый ДНК-фрагмент полностью не будет связан с передней полосой бумаги. Задняя полоса, предотвращает загрязнение более крупными фрагментами ДНК i

ДЕ81-бумагу со связанным ДНК-фрагментом промывают дважды в течение 5 мин в 400 мкл буфера с низким содержанием соли (0,2 М хлористого натрия, 25 мМ трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА) и затем ДНК дважды в течение 10 мин элюируют с бумаги ДЕ81 с помощью 200 мкл буфера с высоким содержанием соли (I M хлористого натрия, 25 мМ трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА) и осаждают 1 мл этанола. Концы Hind Ill-фрагмента снабжают связками Sphl. Для этого 0,2 мкг связки SphI вместе с 2 ед. полинуклеотидкиназы инкубируют в 10 мкл реакционной сред в течение 45 мин при 37 С (70 мМ трис-HCl, рН 7,6, 10 мМ хлористого магния, 1 мМ АТФ, 5 мМ дитиотреитола Sphl-связки лигируют с Hind

+

5

0

5

0

5

0

5

фрагментом с помощью 8 ед. Т4-ДНК-ли- газы в течение 20 ч при 4°С. Затем фрагмент инактивируют при 70°С и ДНК переваривают с помощью 30 ед. Sphl в общем объеме 100 мкл, экстрагируют фенолом и хлороформом и осаждают этанолом. ДНК лигируют и трансформируют E.coli НВ 101. Получаемую плаз- миду обозначают как рАН51 Она содержит ген рб1-интерферона с укороченной 3 -нетранслированной областью и дополнительным Sphl-местом разреза.

Для того, чтобы встроить ДНК- последовательность зрелого лошадиного -ант ер феро на на нужном расстоянии от последовательности промотора, используют ДНК-фрагмент длиной 0,4 к.Ь. который выделяют из 200 мкг разрезанной PvuII плазмиды рАН50. 1 нмоль синтетического 1,5-мерного олигонук- леотида с последовательностью 5X-TGTGACCTGCCTCAC обрабатывают поли- нуклеотидкиназой Он содержит последовательность, которая кодирует первые 5 аминокислот зрелого Oil-интерферона из клона рАН50. 15-мер смешивают примерно с 7 пмоль PvuII-фраг- мента длиной 0,4 к.Ь. и в общем объеме 34 мкл кипятят в течение 5 мин, чтобы денатурировать двунитевую ДНК. После охлаждения связанную с одной- нитью олигонуклеотидную затравку в 70 мкл реакционной среды (50 мМ трис- HCl, рН 7,2, 10 мМ сульфата магния, 0,1 мМ дитиотреитола, 50 мкг/мл альбумина сыворотки крупного рогатого скота, 1 мМ dATP, dGPT, dCTP, dTTP) удлиняют с помощью 30 ед. фрагмента

Кпенова в течение 3 ч при 37°С. Для удаления возможного 3- выступа ДНК затем инкубируют вместе с 16 ед. Т4-ДНК-полимеразы в течение 20 мин

при 37°С в J20 мкл реакционной среды (33 мМ трис-ацетата, рН 7,9, 66 мМ ацетата калия, 10 мМ ацетата магния, 0,5 мМ дитиотрейтола, 0,1 мг/мл альбумина сыворотки крупного рогато- го скота, по 1 мМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP). Образовавшуюся ДНК с тупыми концами экстрагируют фенолом и хлороформом и осаждают при 0°С в течение 15 мин 0,45 М ацетата натрия и

0,6 об.ч. 2-пропанола. С полученной ДНК лигируют смесь олигонуклеотидов: 12-мера S -AGCTTAAAGATG, 8-мера 5 -САТСТССА,которая дает Hind Ill- место разреза и трансляционный старт кодон АТС. По 1 нмоль этих двух оли- гонуклеотидов лигируют с ДНК-фрагментом в 20 мкл с помощью 14 ед. лигазы в течение 40 ч при 4°С. После инактивации фермента при 70°С полу- ченную ДНК в 100 мкл разрезают с помощью 80 ед. Hind III и 20 ед. Bglll и ДНК-фрагменты длиной примерно 190 к.Ь. выделяют из 2%-ного агарового геля на Е81-бумагу и очищают. Полученный ДНК-фрагмент лигируют с 50 нг разрезанным Hind III-и Bglll рАН51-вектором и транслируют E.coli НВ 101. Из 65 полученных колоний выделяют 4 плазмиды, которые обладают желательным рестрикционным рисунком. Из них выделяют один Hind III - BamHI-ДНК-фрагмент, который подвергают анализу последовательностей по методу Сангера. Эту плазмиду обозна- чают как рАН51/2. 20 мгк плазмиды рАН51/2 разрезают рестриктазами SphI и Hind III, образовавшийся ДНК- фрагмент длиной 1,0 к.Ь. выделяют из агарового геля и лигируют с 40 нг

разрезанной с помощью Hind III- и Sphl-плазмиды рагрАТЕКЮЗ.

Полученную после трансформации E.coli HB 101 экспрессионную плазмиду обозначают как рАН52. Она содержит все необходимые для индуцируемой экспрессии зрелого лошадиного оЈ1 интерферона информации. Аналогичным образом из разрезанной Hind III

„

„

и Bam HI плазмиды рагрАТЕЕЮЗ полу1 чают экспрессионную плазмиду рАН52/2. Эта экспрессионная плазмида примерно на 0,2 . длиннее, чем рАН52, и

с

jg J5

20 25 30 ,,- до 45

50

55

дополнительно имеет сингулярное BamHI-место разреза.

В плазмиде рАН53 триптофановые промоторы, ген об 1-интерферона, устойчивый к ампициллину ген и начало репликации ориентированы в одном направлении.

Плазмиду рАН53 получают из плаз- мид рАН52 и pBR322 следующим образом.

10 мкг рАН52 разрезают с помощью SphI и EcoRI, ферменты инактивируют при 70°С и после добавления по 0,15 мМ dATP, dGTP, dCTP и dTTP ДНК- концы делают тупыми с помощью фрагмента Кпенова в течение 1 ч при 22 °С.

ДНК-фрагменты фракционируют по величине в агаровом геле и выделяют фрагмент длиной 1,1 к.Ь,, который содержит промотор и ген интерферона. 10 мкг плазмиды pBR322 переваривают с помощью EcoRI и Pvul; концы также выпрямляют с помощью фрагмента Клено- ва и затем дефосфорилируют с помощью фосфатазьг телячьего кишечника. ДНК-фрагмент длиной 2,4 к.Ь. выделяют из агарового геля. Оба полученных таким образом фрагмента ДНК лигируют с помощью Т4-ДНК лигазы и трансформируют E.coli HB 101.. Таким образом получают экспрессионную плаэмиду рАН53, которая, содержит два места распознавания EcoRI.

Пример 2. Получение экспрес- сионной плазмиды рАН62 для получения лошадиного Л-интерферона.

Стадии А-В осуществляют аналогично примеру 1.

Стадия Г. Скрининг лошадиной ген- библиотеки генов интерферона.

Но 10 мкг высокомолекулярной лошадиной ДНК полностью переваривают с помощью EcoRI (Hind III), разделяют путем электрофореза в 0,8%- ном агаровом геле и переносят на нитроцеллюлозные фильтры. Готовят радиоактивно маркированную ДНК-пробу из PstI - BglII-фрагмента, кодирующего человеческий ft-интерферон кДНК-клона P1F12. Эта проба кодирует аминокислоты 48-166 зрелого 3-интерферона

Нитроцеллюлозные фильтры предварительно гибридизируют в течение 7 ч при 65°С в 5XSSPE (0,9 М хлористого натрия, 50 мМ гидрогенофосфата натрия, 5 мМ ЭДТА, рН 7,4), 5 X раст вора Денхардта (0,1% фиколла, 0,1%

поливинилпирролидона, 0,1% альбуми- на сыворотки крупного рогатого ско- та, 0,1% альбумина сыворотки крупного рогатого скота), 0,1% ДСН, 20 мг/мп ДНК из спермы лосося, затем гибридизируют в таком же растворе, но без ДНК из спермы лосося с использованием 13X10 ерш маркированной пробы После инкубации при 65°С в течение ночи, фильтры промывают четырехкратно в течение 1-1,5 ч в 3 х SSC (0,45 М хлористого натрия, 45 мМ цитрата натрия), 0,1% ДСН при 65°С и экспонируют в течение 7 дней на рентгеновской пленке 4ирмы Кодак с помощью усиливающих пленок фирмы Кодак.

Для скрининга генов интерферона в библиотеке лошадиных ДНК применяются такие же условия гибридизации.

600000 рекомбинантных лямбда- фагов наносят на содержащие штамм E.coli HM 528 плотностью 30000 пятно образующих единиц на 13,5 см пластины. Четырехкратные нитроцеллюлозные репликаты готовят с каждой пластины. После высушивания в течение 2 ч

PvuIII-фрагмент длиной 4,5 к.Ь., который гибридизуется; с пробой человеческого jb -интерферона выделяют очищают, лигируют по Smal сайту плаз

при 80°С фильтры промывают в течение

1,5 ч при 65°С в 1 М хлористого нат- 30 миды pUC9 и трансформируют E.coli

рия, 10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 0,1%Ш 101. Трансформант с желательной

ДСН, предварительно гибридизируют в

течение ночи и по 2 реплики каждой

пластины гибридизируют в течение

вставкой (рАНбО) выращивают и плазми- ду характеризуют.

Последовательность Hind III-фраг-

24 ч с использованием I к10 срт про- 35 мента, аминокислотная и нуклеотидная бы радиоактивного ft-интерферона напоследовательности Eg-Й-интерферона,

фильтр. После трехкратно повторен-рАНбО представлены ниже.

AASCrii:AlTCCrft3IITTCA6nATArT6rA6AIS6TT6AGSTI6CtA6ftfMrt6C -C;SAT6iKCISA«A ai«f3rSAT6rcneCTSISCA 6 101

тббЈ1ШгаАА т««АТбШАбПбА;и:АПйТ МАтатАб гу

«тМП666МТТАШСТ«Т СтаТ6ААААА6 ТТаШАСШ6АJJ1

АС7абТ«ТА5СЙ«ТтАШСАтАвтАтТ67ТСеТ1ШАтААСААТ «8

АСАТ«Ш КАЙТА68«ПТАМ6А1АСАвА8ТтА6А8АСТАС 5

Т66««СагаШАТААГ ТА6СОАС«1С/ША6 SoCTttiASSSASTAAASSCAACACTSneCTSTCTTWrC

М-15-10-5-II3

tt Пг Гут ATI Iff lit 1м Pro fot All Liu In LIB Cys Pit Sw tbf fhr Ma Leu Ser Til Asi Тут Asp let In Arf Sir Sin

АГ8 ACC TAC A6fi IЈ3 АТС CTC Ctt AI6 BCS CTC CT6 CIS 1ST ПС TCC ACS ACS 6CT ОТ ID STS AAC TAT VЈ П6 СП С68 tCC CAA Kb

1«13 иЗвЯ

Ui rf Sir Au Str AljfCrsllM Kt{ In In Ar; 61 a Lw Asa 61т la fn SIa flu Aifl TV Ntt,Asa Phc 61 я

C1B «4 A6C АЯ AAT T« SCA Ш CT6 AT6 CTC CIS J38 CA8 П8 AAT 6fiA ЙХ CtT CAA CSt I6C CCC ttS 6AC АСА ATS AAC ПС C« I7t

U«M -S3МИ

il Pro Sit Sli tit Sli Sin AU Slo 6la PD« Sli Irs 6U Asp All All Lea Vil fl( Тут 61 a Kit In (III TV Trp Jrij lit JTC CCT 6AS «A3 АП 6AG CAA KA O8 CAS ПС СДв ЛА6 6A6 «AT KT «CA Пв 6ТС АТС AT 6AS АТв CTC «в CAC ACC T6S СбГ АП fit

16

ного скрининга получают 6 клонов лошадиного А-интерферона, которые«дают положительные сигналы гибридизации.

Стадия Д. Характеристика рекомбинантных фагов.

Из 3 гибридизирующихся с человеческим /3-интерфероном рекомбинантных ДНК готовят фаговую ДНК.ДНК , переваривают с помощью EcoRI,, BatnHI, Hind III, PstI, Bglll, Sail, Smal и путем электрофореза разделяют в 0,8%-ном агаровом геле. Величина гибридизирующихся фрагментов опреде- ляется по способу Саусерна. Положение рестрикционных мест внутри лямбда- вставки определяют после частичного рестрикцийиного переваривания лямбды- ДНК, маркировки правых или левых тупых концов лямбда-ветвей синтетическими, маркированными Р-32 олигонук- леотидами и электрофореза в 0,45%- ном агаровом геле.

Стадия Е Субклонирование гена лошадиного fi -интерферона,

PvuIII-фрагмент длиной 4,5 к.Ь., который гибридизуется; с пробой человеческого jb -интерферона выделяют, очищают, лигируют по Smal сайту плаз0

вставкой (рАНбО) выращивают и плазми- ду характеризуют.

Последовательность Hind III-фраг-

7 73W«3W«

t. «П Irf In П «U S«r TV «If TfBfA 64 TV (It Vil in I I v l n« Ґl1 «« lw « J |Ј J1 ,,„

,-тс MA «и мт TTC KT we «т esc tee ш см MX Ate en ш мс cic en STB KA STC MI ere CAS STB еле CST ere м 10,1

M103tl«115IMИ

V AM In fli 61, lit Ret «« Ив И Str fcr TV Trp TV, lit LN «r« l« lyi LT Тут Sir И III S«r

о AAC CTS ess SAA ATA дтв t we «АЛ «с тсс лес тте e« «AC лсл ACC in СТБ м« AM тле ESA «s АТС тсв ни

О113КОИЗИ 1Я

;« Trr In L,« Mi 1Я LfJ Trr Sir «iR«lAU trp TV Vil Vil (la Ml 6I« «ft leu «r| In Ita « L J «У I

-.8 ГАС CIS «S КС ftAS Мб TSC ASC САСШбСС TE8 AM STS STC CAA SCS 6АЛ T6 CTC AS6 MC TT« КС ПС ttt AAC 65Я CTC I2J4

A143

а ere мс т« «итстсювсствсмсгсббдвй я тбствммтватвс твтспа 1S«

Л8С«ГЛ1166 БИАетА(ММтЮ1ППТТМТАаПАТ6ААПМСгаПТПСТ 1ТТАПТС

тс«мватвттйАтсжпмттшА5Автасс«€ШША«тбсм с:мс1бТААмт8тте

леттсиабмгпАлмгсшззшхАТба

ЗматгеевегвАС«ва5А58сгетв5«асА(Мбйешвстзс1кттстбсествТ8тсюжтстстб8се r i6Tc TciTa3tTTsttT66A6ci«icccTttTATCi6C6 ssiscTciЈCCTceccccAecttTCAACcec«eE:sfTe;AssATATTTCT6t6eccisw i«5

С«5 ТСССМ8СК1ТСТ686««Т6ТМвТв5Ы8ТаСПТАГ6в СТСГТСТТЕ:8АСД«С6А6СТ6Т СЙ6Гбге Й

К«С йС«АИ68«6ЙМИАСТеТВПТС6ТЙССССТСССАТСв«ХТ66ТТП6СТет

MSCC«SOTrcaCAAASC1 6«AAS6Ca«BTEtA6WSATTAS6TCeA6TCTC;fiBeCAST6M

-ACiMCSTrccc scTT;c«T:-:.5A;An6c;eArTTCCTA6SAECTCt i63ЈCAtcK4c;3c;T;ЈciscTTTTCT5TCTS SCTe;accc;tEc3A;cs; TRT Ar ZIP

СГЗНСГТаСАПАбСАСрвАТССБТСЪССгеСАЗССАМСТТ

Стадия Ж, Конструкция экспрессион ной плазмиды рАН62 для зрелого лошадиного /3 -интерферона.

30 мкг плазмиды рАНбО разрезают с помощью 30 ед. HgiAI в 1.50 мкл объема. После инактивации фермента при 70°С 3 -выступающие ДНК-концы затупляют в течение 30 мин при 37°С с помощью 1 ед Т4-ДНК-плазмиды (в присутствии по 1 мМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP) . На т.упые концы лигируют Sphl- связки, полученную ДНК разрезают с помощью SphI и Hind III. Образовавшийся ДНК-фрагмент длиной 1,85 к.Ь. выделяют из агарового геля и лигируют с 50 нг разрезанной Hind III и SphI плазмиды рагрАТЕЕЮЗ. Полученный после трансформации E.coli HB 101 клон содержит плазмиду рАНб1 Эта плазмида представляет собой промежуточную ступень для дальнейшего построения экспрессионной плазмиды. 20 мкг плазмиды рАНб1 разрезают BamHI и Sail и образовавшийся фрагмент ДНК длиной 1,3 к.Ь. выделяют из агарового геля, очищают и лигируют с переваренной рестриктазами BamHI и Sail M13mp9:u)

5

0

5

0

5

фаговой ДНК. После трансформации E.coli IM 101 из рекомбинантного Ml 3- фага (М13рАН61) выделяют однонитевую фаговую ДНК. 3 пмоль этой однонитевой ДНК смешивают с 38 пмоль 15-мерного олигонуклеотида 5 CTGAACTATGACTTG в 50 мкл 20 мМ трис-HCl, рН 8,0 и 10 мМ хлористого магния, нагревают до 95°С и медленно охлаждают до комнатной температуры. Олигонуклеотид точно связывают начиная с первого основания последовательности зрелого й-интерферона. Синтез двунитевой ДНК исходя из 15-мерной затравки осуществляют в 100 мкл объема после добавления по 3 мМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 15 ед. фрагмента Кленова в течение 1 часа при . После добавления 20 мМ ЭДТА ДНК экстрагируют фенолом и хлороформом и осаждают этанолом.

Остающиеся однонитевые участки ДНК переваривают с 150 ед. SI-нук- леазы в 400 мкл реакционной смеси в течение 2 ч при 14 С (14 мМ ацетата цинка, 30 мМ ацетата натрия, 250 мМ

19ч

хлористого натрия, 5% глицерина, рН 4,6). Реакцию прекращают путем добавления ЭДТА, экстрагируют фено- лом и хлороформом и ДНК осаждают этанолом. Полученную ДНК с тупыми концами лигируют со смесью олиго- нуклеотидов 12-мера 5; -AGCTTAAAGATG и 8-мера 5Г-САТСТТТА, образовавшую- ся ДНК разрезают Hind III и Sphl.

ДНК-фрагмент длиной 1,1 к.Ь. выделяют из агарового геля и лигируют плазмидой parpATER.103, разрезанной по Hind III- и Sphl-сайтам. После трансформации E.coli HB 101 получа 54 колонии. Из 9 изолированных из них плазмидных ДНК выделяют фрагме EcoRI - Sail длиной 1,3 к.Ь., который подвергают анализу последовательностей по методу Сангера. Полученную из него плазмиду обозначают как рАН62. Она позволяет осуществлять эффективную экспрессию зрелог лошадиного и-интерферона в E.coli.

Пример 3. Экспрессия ин- терфероновой активности штаммом E.coli HB 101, содержащей экспрес- сионную плазмиду рАН52, рАН52/2, рАН53 или рАН62.

100 мл бактериальной культуры и

кубируют при 37 С при интенсивном встряхивании вплоть до указанной в таблице оптической плотности при 600 нм в следующей, не .содержащей триптофана, среде (на 1 л среды):

10г фосфата аммония, 3,5 г гидро- генфосфата калия, рН 7,3, 0,5 г хлористого натрия, 21 г-CaS-аминокислот (кислотно-гидрализованных),

11г глюкозы, 1 мМ сульфата магния, 0,1 мМ хлористого калия, 1 мг тиани- на-НС1, 20 мг L-цистеина, 20 мг 3-й-индолакриловой кислоты (индуктора триптофаневого оперона). Кроме того, среда может еще содержить 50- 100 мг ампициллина. Затем бактерии

центрифугируют в течение 5 мин при 4000 об/мин, суспендируют в охлажденной льдом среде 50 мМ , рН 8,0 и 30 мМ хлористого натрия, взятой в количестве 1/10 объема культуры,и при охлаждении во льду в течение 30 с дважды обрабатывают с помощью ультразвука (20 кГц, 100 В). Остатки разрушенных клеток удаляют в течение 10 мин при 10000 об/мин (4°С) и после стерильной фильтрации надосадоч- ную жидкость исследуют на интерфе- роновую (ИФ) активность в общеприня

20

том опыте для определения цитопати- ческого эффекта везикулярного вируса стоматита (ВВС) или вируса энцефало- миокардита (ВЭЦК).

Результаты представлены в таблице

Титр на А549-клетки нормирован в международных единицах с использованием человеческого интерферона.

Формула изобретения

0

0

5

5

0

45

50

5

21

12-мером S -AGCTTAAAGATG и 8-мером 5 -САТСТТТА, полученную ДНК обрабатывают эндонуклеазами Hind III и Bglll, и фрагмент длиной 190 к.Ь. лигируют с гидролизов энным Hind III и Bglll вектором рАН51, полученную плазмиду рАН51/2 обрабатывают SphI и Hind III и лигируют с Hind III - SphI или Hind III - BamHI фрагментом плазмиды parpATER 103 с получением экспрессионной плазмиды рАН52 или рАН52/2 , или плазмиду рАН52 гидролизую эндонуклеазами SphI и EcoRI, затупляют концы ДНК с помощью фрагмента Кленова в присутствии dATP, dGTP, dCTP и dTTP, получают ДНК длиной 1,1 к.Ь., затем плазмиду pBR 322 переваривают с помощью PvuII и EcoRI затупляют концы ДНК с помощью фрагмента Кленова и дефосфорилируют с получением ДНК длиной 2,4 к.Ь., которую лигируют с ДНК длиной 1,1 к.Ь. с получением экспрессионной плазми- ды рАНЗЗ, для полученияOi-2-интер- ферона плазмиду р№63, получаемую путем субклонирования рестрикционного фрагмента EcoRI длиной 3,3 к.Ь, из лямбда-клона Eg-0616 в EcoRI сайт плазмиды pUC8, обрабатывают Bglll и BamHI и получаемый при этом фрагмент ДНК длиной 1,0 к.Ь., содержащий кодирующую последовательность для 0 2-интерферона 64-и аминокислоты, лигируют с большим фрагментом, содер жащим плазмидный вектор, промотор и кодирующую последовательность для первых 63 аминокислот зрелого интерферона, который получают в результате обработки Bglll- и BamHI-плазмиды рАН52/2, дефосфорилируют с помощью фосфатазы телячьего кишечника, продуктом лигирования трансформируют бактерии Escheri hia coli HB 101 с получением экспрессионной плазмиды рАН55, а для получения А-интерферона PvuII-фрагмент отобранного клона Eg-йб лигируют с гидролизованным с помощью Smal и дефосфорилированным вектором pUC9, полученными рекомби- нантными ДНК трансформируют бактерии E.coli IM 101 и отбирают устойчивые к ампициллину клоны, содержащие плазмиду рАНбО, затем плазмиду рАНбО обрабатывают HgiAI-эндонукпеазой и после выпрямления Зг-выступающих концов ДНК с помощью Т4-ДНК-полимера- зы тупые концы лигируют с обработанными полинуклеотидкиназой Sphl-связ

5622

ками, ДНК гидролизуют SphI и Hind III, полученный фрагмент длиной 1,85 к.Ь., лигируют с разрезанной Hind III и SphI плазмидой parpATER 103, полученную плазмиду рАН61 обрабатывают BamHI и Sail с получением фрагмента длиной 1,3 к.Ь., который лигируют с переваренной BamHI и Sail М13тр9-фа говой ДНК, полученную однонитевую

5

0

5

с

0

0

5

0

5

ДНК лигируют с олигонуклеотидом S -GTGAACTATGACTTG, который предварительно обрабатывают полинуклеотид- кинаэой, затем денатурируют ДНК кипячением, удлиняют олигонуклеотидную затравку с помощью фрагмента Кленова в присутствии dATP, aGTP, dCTP и dTTP и осаждают, оставшиеся однони- тевые участки ДНК переваривают с помощью SI-нуклеазы и ДНК с тупыми концами лигируют с олигонуклеотидами, 12-мером 5 -AGCTTAAAGAG и 8-мером Ь -САТСТТТА, полученную ДНК обрабатывают эндонуклеазами Hind III и SphI, фрагмент длиной 1,1 к.Ь. лигируют с Hind II - SphI фрагментом parpATER103 с получением экспрессионной плазмиды рАН62, экспрессионными плазмидами трансформируют штамм бактерии Е.со- li IM 101, культивируют штаммы-продуценты в жидкой питательной среде, выделяют и осаждают белок из культураль - ной жидкости с последующей очисткой хро мато г р афн ей

4,5 и хроматографией полученного су- пернатанта на катионите и элюциеи раствором ацетата аммония.

23

сульфата аммония 50%, трехкратным центрифугированием суспендированием полученного осадка в буферном раст jBOpe с добавлением полиэтиленгликоля после первого центрифугирования и в

164295624

сахарозном буфере после второго, с последующей очисткой центрифугиро,ва- нием, аффинной хроматографией с ис пользованием сахарозного буфера и хроматографией с обратной фазой.

Тест-система: NBIX6-клетки (АТСС CCL 57, клетки эпидермиса кожи лошади)/ВВС; клетки А549 (АТСС CCL 185, .клеточная линия река легких человека)/ВЭЦК

ин

4,2

6,06,0 5,75,7 3,03,0

1,8х10ь 2,0х10€ 1,8x10

1,1x10

5,2x10

5,2x10 7,6x1О4 6,2х104

2.6Х104