6-(ТОЗИЛГЛИЦИЛ-L-ПРОЛИЛ-L-АРГИНИЛ)-АМИНОНАФТАЛИН-1-ИЗОБУТИЛ-СУЛЬФАМИД В КАЧЕСТВЕ СУБСТРАТА ДЛЯ ФЛЮОРЕСЦЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТРОМБИНА Российский патент 1997 года по МПК C07K5/08 C12Q1/37 

Изобретение относится к области биоорганической химии, а именно к новому 6-(тозилглицил-L-пролил- L-аргинил)аминонафталин-1-изобутилсульфамиду формулы:

в качестве субстрата для определения тромбина.

Для этих целей широко используется коммерческий субстрат Tos-Gly-Pro-Arg-pNA(pNH п-нитроанилид) (Chromozym TH). Однако данный субстрат недостаточно эффективен, так как обладает пониженной скоростью гидролиза при взаимодействии с тромбином.

Целью изобретения является повышение эффективности пептидильных субстратов.

Цель достигается новым соединением, представляющим 6-(тозилглицил-L-пролил-L-аргинил)аминонафталин -1-изобутилсульфамид. Для установления эффективности данного соединения в качестве субстрата проводят гидролиз с тромбином и определяют каталитическую константу (K_cat), константу Михаэля-Ментена (K_M) и их соотношение (K_cat/K_M)/1/. Как известно, чем выше K_cat/K_M, тем эффективнее субстрат, т.е. более короткое время гидролиза.

Изобретение иллюстрируется примерами.

Пример 1. 6-Фталимидонафталин-1-изобутилсульфамид.

Растворяют 11 мл (0,11 моль) изобутиламина и 14 мл (0,1 моль) триэтиламина в 500 мл ацетона и порциями в течение 10 мин добавляют 37,1 г (0,1 моль) фталимидонафталин-1-сульфонилхлорида. Реакционную смесь перемешивают при 20^oC в течение 4 ч. Ацетон отгоняют, осадок заливают 1 л воды, отсасывают продукт, промывают водой, сушат и перекристаллизовывают из метанола. Получают 32,4 г (выход 79,4%) продукта с т.пл. 150-153^oC.

Найдено, C 64,71; H 4,85; N 6,98; S 7,25. C₂₂H₂₀N₂SO₄.

Вычислено, C 64,69; H 4,94; N 6,86; S 7,85
Пример 2. 6-Аминонафталин-1-изобутилсульфамид.

Заливают 40,8 г (0,1 моль) 6-фталимидонафталин-1-изобутилсульфамида 500 мл метанола, прикапывают 5 мол (0,1 моль) гидразингидрата и кипятят 4,5 ч. Метанол отгоняют, остаток экстрагируют 2•200 мл кипящего хлороформа, экстракт упаривают и остаток перекристаллизовывают из метанола. Получают 20,3 г (выход 73,1%) продукта с т.пл. 48-50^oC, R_f 0,56 (этилацетат-хлороформ 1:1). ПМР (ДМСО) 0,70 (CH₃), 1,45(CH), 2,48(CH₂).

Найдено, C60,58; H 6,60; N 10,06; S 11,21. C₁₄H₁₈N₂SO₂.

Вычислено, C 60,41; Н 6,52; N 10,06; S 11,52
Пример 3. Бромгидрат 6-(N^α-бензилоксикарбонил)-L-аргиниламинонафталин -1-изобутилсульфамида.

Растворяют 3,89 г (0,01 моль) бромгидрата N^α -бензилоксикарбонил-L-аргинина и 2,78 г (0,01 моль) 6-аминонафталин-1-изобутилсульфамида в 15 мл сухого пиридина, добавляют 30 мл сухого толуола и последний отгоняют. Реакционную смесь охлаждают до -20^oC и добавляют раствор 2,02 г (0,01 моль) дициклогексилкарбодиимида (ДЦК) в 6 мл сухого пиридина. Реакционную смесь выдерживают при -20^oC в течение 0,5 ч, при 4^oC в течение 1 ч и при 20^oC в течение 20 ч. Отсасывают выпавшую дициклогексилмочевину, упаривают пиридин и остаток растворяют в 40 мл смеси хлороформ-пропанол (3:1). Раствор промывают 15 мл воды, 15 мл насыщенного NaCl, содержащего 1 мл конц. HCl, 15 мл 2%-ного водного аммиака и 15 мл воды, высушивают над безводным Na₂SO₄. Растворители отгоняют, остаток растирают с эфиром, отсасывают, высушивают и перекристаллизовывают из пропанола. Получают 6,17 г (выход 95%) продукта с т.пл. 118-126^oC, R_f 0,70 (бутанол-уксусная кислота-вода 4: 1: 2) (БУВ 412), /[α]20D

/_D ²⁰-13,5 (c 1, MeOH). ПМР (ДМСО) 0,70(CH₃), 1,50(CH), 2,45(CH₂).

Найдено, C 51,62; H 5,88; N 13,07; S 4,12; Br 11,84
Вычислено, C 51,77; H 5,74; N 12,94; S 4,94; Br 12,30. C₂₈H₃₇N₆BrSO₅.

Пример 4. Бромгидрат 6-L-аргиниламинонафталин-1-изобутилсульфамида.

Растворяют 6,50 г (0,01 моль) бромгидрата 6- N^α -бензилоксикарбонил)-L-аргиниломинонафталин-1-изобутилсульфаимда в 10 мл 3н. HBr в ледяной уксусной кислоте и выдерживают при 20^oC в течение 1,5 ч. Реакционную смесь выливают в 100 мл сухого эфира, выпавший осадок отсасывают, промывают эфиром, сушат. Сухой осадок растворяют в 10 мл воды, добавляют 50 мл бутанола и при встряхивании порциями по 15 мл 5%-ный водный NaHCO₃ до pH 7,5 водного слоя. Органический слой промывают 2•10 мл воды, бутанол упаривают, остаток растирают с эфиром, отсасывают, промывают эфиром, сушат и перекристаллизовывают из метанола. Получают 4,95 г (выход 96%) целевого продукта с т.пл. 158-165^oC, [α]20D

-2,0 (c 1; ДМСО), R_f 0,47 (БУВ 412). ПМР (ДМСО) 0,70(CH₃), 1,50(CH), 2,50(CH₂).

Найдено, C 46,68; H 5,94; N 16,38; S 6,12; Br 16,11
Вычислено, C 46,60; H 6,06; N 16,30; S 6,22; Br 15,50. C₂₀H₃₁SBrO₃.

Пример 5. 6-(Тозилглицил-L-пролил-L-аргинил)аминонафталин-1-изобутилсульфамид (1)
Растворяют 0,82 г (2,5 ммоль) Tos-Gly-L-Pro-OH, 0,35 г (2,5 ммоль) 1-гидроксибензотриазола и 0,51 г (2,5 ммоль) ДЦК в 18 мл охлажденного до -20^oC сухого диметилформамида (ДМФА). Реакционную смесь выдерживают при -20^oC в течение 0,5 ч, при 4^oC в течение 1 ч и заливают охлажденный до 4^oC раствор 1,29 г (2,5 ммоль) бромгидрата 6-L-аргиниламинонафталин-1-изобутилсульфамида. Перемешивают при 20^oC в течение 20 ч, отсасывают выпавшую дициклогексилмочевину, фильтрат выливают в 125 мл воды и образовавшуюся суспензию экстрагируют 3х15 мл смеси этилацетат-бутанол (1 1). Органический слой промывают 3х12 мл 5%-ного водного NaHCO₃, 10%-ного водного KHSO₄ и воды, растворители упаривают, остаток растирают с эфиром, отсасывают, сушат. Получают 1,40 г (выход 75%) хроматографически чистого целевого продукта с т.пл. 156 - 160^oC, [α]20D

-38,0 (с 1; ДМСО), R_f 0,61 (БУВ 412). ПМР (ДМСО) 0,65 (CH₃), 1,50(CH), 2,50(CH₂), 2,3(CH₃, Tos), 7,28(C₆H₄, Tos), 7,63(C₆H₄, Tos).

Использование нового пептидильного субстрата для анализа тромбина и установление его эффективности в сравнении с известным соединением приводятся в примерах 6, 7 и 8.

Пример 6. Определение времени 10%-ного гидролиза 6-(тозил-глицил-пролил-аргинил)аминонафталин-1-изобутилсульфамида.

A. Определение интенсивности флуоресценции 6-аминонафталин-1-изобутилсульфамида. Раствор 10 мкМ 6-аминонафталин-1-изобутилсульфамида в ДМСО разбавляют 0,02 н. трис-HCl буфером, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl, до концентрации 1 мкМ и помещают в кювету флуориметра. Записывают высоту полосы флуоресценции в максимуме , λ_возб.=352 нм на спектрофлуориметре "Hitachi MPF-4" (Япония). Высоту пика флуоресценции 6-аминонафталин-1-изобутилсульфамида принимают за 1.

Аналогично определяют интенсивность флуоресценции известной детектируемой группы (1-аминонафталин-5-сульфокислоты), которая составляла лишь 0,12 часть интенсивности флуоресценции детектируемой группы предложенного субстрата.

Б. В том же буфере приготавливают 100 мкМ раствор субстрата 6-(тозил-глицил-пролил-аргинил)аминонафталин-1-изобутилсульфамида, добавляют 1 нМ тромбина в таком же буфере и определяют время, необходимое для достижения такой же флуоресценции, как и в части А опыта, т.е. время 10%-ного гидролиза субстрата. Время равно 155 с.

В. Определение времени 10%-ного гидролиза субстрата 6-(тозилглицил-L-пролил-L-аргинил)-аминонафталин-1-изобутилсульфамида. В кювету флуориметра помещают 1,8 мл 1 мкМ раствора субстрата 6-(тозил-глицил-L-пролил-L-аргинил)-аминонафтали-1-изобутилсульфамида в том же буфере, добавляют 0,2 мл 1 нМ раствора тромбина в том же буфере и измеряют рост интенсивности флуоресценции при λ_фл.=470 нм (λ_возб.=352 нм) в течениe времени, фиксируя время, необходимое для 10% -ного гидролиза. Степень гидролиза определяют по флуоресценции образующегося 6-аминонафталин-1-изобутилсульфамида. Время 10%-ного гидролиза определено 0,3 мин.

Пример 7. Определение времени 10%-ного гидролиза 4-(тозил-глицил-пропил-аргинил)нитроанилида.

Приготавливают 100 мкМ раствор субстрата 4-(тозил-глицил-пролил-аргинил)нитроанилида в таком же буфере, как и в примере 6, добавляют тромбин (концентрация в растворе 1 нМ) и при 405 нм измеряют возрастание оптической плотности раствора до 0,098, т.е. до достижения 10 мкМ концентрации п-нитроанилина, что соответствует 10%-ному гидролизу субстрата. Время, необходимое для этого, равно 460 с.

Из примеров 6 и 7 видно, что предложенный субстрат почти в 3 раза по времени гидролиза превосходит прототип.

Пример 8. Определение константы Михаэля-Ментена (K_M) и каталитической константы (K_cat) Chromazum TH в реакции с тромбином.

Приготавливают растворы Chromozym TH различной концентрации (S) в 0,02 М трис-HCl буфера, pH 7,4, 0,15 М NaCl. 2 мл раствора термостатируют при 25^oC в кювете спектрофотометра, прибавляют I нМ тромбина в таком же буфере, измеряют рост оптической плотности при 405 нм в течениe времени и из этого определяют скорость реакции V. Данные приведены в табл. 1.

Из полученных данных строят график в координатах 1/S, 1/V (см. чертеж). Пересечение полученной прямой с осью абсцисс дает значение 1/K_m, а ординат значение 1/V_max.

Как видно из графика
Отсюда: K_м=13,8 μм, v_max=14,1 нм^-1 с.
По формуле где E концентрация тромбина (моль/л) и ровна 1 нМ, получают величину каталитической константы:
K_cat 14,1^-1 с.

Аналогично рассчитывают указанные константы для предложенного субстрата. Только скорость реакции гидролиза с тромбином определяют флуоресцентным методом аналогично примеру 6.

Константы K_M, K_cat и их соотношение приведены в табл. 2.

Новый субстрат для определения тромбина флуоресцентным методом превосходит известный почти в 3 раза по времени 10%-ного гидролиза (примеры 6 и 7) (см. 155 и 460 с соответственно).

Эффективность по соотношению констант K_cat/K_M повышается в 3,6 раза (пример 8, табл. 2) (ср. 3,85•10⁶ и 1,02•10⁶ соответственно).

Использование: в биохимии в качестве субстрата для флуоресцентного определения тромбина. Сущность изобретения: 6-(тозилглицил-L-пролил-L-аргинил)-аминонафталин-1-изобутилсульфамид. Реагент 1: tos-Gly-L ProOH. Реагент 2: бромгидрат - 6 -L -аргиниламинонафталин-1-изобутилсульфамид. Процесс ведут в сухом ДМФА в присутствии 1-гидроксибензотриазола и дициклогексилкарбодиимида. Выход 75%, [α]20D

-38,0 (C1, ДМСО), Т.пл. 156-160^oC. Описываемый субстрат превосходит известный субстрат для определения тромбина (Chromozym TH) почти в 3 раза по времени 10%-ного гидролиза. 2 табл., 1 ил.

6-(Тозилглицил-L-пролил-L-аргинил)-аминонафталин-1-изобутил сульфамид формулы

в качестве субстрата для флуоресцентного определения тромбина.