Способ получения фактора УШ:С свертывания крови Советский патент 1988 года по МПК A61K35/14 

1

13751

Изобретение относится к медицине, в частности к области фракционирования крови и выделения препаратов свертывания крови.

Цель изобретения - увеличение выхода целевого продукта - фактора УШ:С.

Цель достигается за счет функционирования плазмы крови при опреде- ленных значениях рН с использованием двух водонерастворимых сшитых полиэлектролитных сополимеров, применяемых в присутствии экзогенного гепарина,

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Кровь человека переливают в пластмассовые мешочки, содержащие противосвертывающее ве- щество - CPDA-1 (цитратное, фосфатное, декстразовое противосвертывающее .вещество с адепином - антикоагулянт-США) , Отделяют плазму центрифугированием при силе 500-4000 g в течение 4 ч, при 20-24°С. Порции плазмы по 200 мл замораживают при .

Самозамороженную плазму подвергаю адсорбции при комнатной температуре с применением двух водонерастворимых сшитых полиэлектролитных сополимеров (смол) в присутствии экзогенного гепарина. Смола А - сополимер экви- молярных количеств этилена и малеино вого ангидрида, сшитый с 5 мол.% ме- тилиминобиспропиламина, содержащий 90 мол.% концевых диметиламинопро- пилимидных групп. Смола Б - сополиме этилена и малеинового ангидрида, сшитый с 5 мол.% диметиламинопропи- лимида, содержащий 5 мол,% концевых диметиламинопропилдиимидных групп,

В смоле Б все свободные карбо- : ксильные и ангидридные группы защищены метоксипропиламином.

До применения смолу Б предварительно обрабатывают следующим образом.

12 г смолы диспергируют в 200 мл 0,154 М NaCl, содержащего 0,1% альбмина сыворотки крови крупного рогатого скота (АСК). С помощью 1,0 М лимонной кислоты устанавливают рН 4,0. Диспергирование проводят в течение 3-5 мин при перемешивании. Суспензию отфильтровывают, фильтрат отбрасывают. Получают влажную смоля ную фильтр-прессную лепешку, кото

Q 5

0 5

О д

0 5

5

5

162

рую вновь диспергируют в 200 мл NaCl/ACK. Добавляя при перемешивании 1,0 М NaOH, устанавливают рН 5,8, Перемешивание продолжают еще 10 мин. Суспензию отфильтровывают, а влажную лепешку используют для последующего фракционирования.

Все растворы, используемые при . элюировании и в процессе фракционирования содержат 0,1% АСК,

Натриевую соль свиного гепарина используют в виде раствора ед/мя в физиологическом растворе.

Процесс фракционирования осуществляют следующим образом.

Один мешочек (т.е. 200 мл) свеже замороженной плазмы быстро оттаивают;, помещая его в перемешиваемую водянуш баню при З7 с. Затем добавляют в смесь 1 мл раствора гепарина (т.е, 200 ед), перемешивают смесь 3-5 мин„ Отбирают пробу для проведения испытания на коагуляцию (регистрируют объем и время). Контрольные пробы идентичны испытуемым, однако без добавления гепарина в плазме.

К плазме добавляют 70 мг смолы А, значение рН доводят до 8,0 с помощьг 1 М NaOH, выдерживая это значение рН при перемешивании смеси в течение 20 мин. Затем смесь фильтруют, полученный фильтрат содержит большую часть активности фактора УШ;С. Мокрую смоляную лепешку промывают 20 мл дистиллированной воды, перемешивают 5 мин, фильтруют и два полученных фильтрата собирают и испытывают на фактор УШ:С. Регистрируют объем активности для подсчета общего количества единиц-коагулирования.

К фильтрату добавляют предварительно обработанную смолу Б (12 г), . добавкой 1 М лимонной кислоты доводят рН до 5,8 и суспензию перемешивают 20 мин, выдерживая рН 5,8. Суспензию отфильтровывают, осадок промывают 200 мл 0,002 М NaCl. Затем осадок диспергируют в 200 мл 0,3 М NaCl, устанавливают рН 5,8, суспензию перемешивают 5 мин, снова фильтруют, промьшают осадок дополнитель- ньми 200 мл 0,3 М NaCl, а фильтрат отбрасывают.

Фильтрованный осадок вновь диспергируют в 200 мл растворителя для элюирования, содержащего 1,5 М NaCl, 0,.1 М лизин и.0,1% АСК. Устанавливают рН 6,0 и перемешивают суспензию

20 мин. Суспензию отфильтровывают и осадок промывают 20 мл растворителя элюирования, после -чего отбирают пробу фильтрата для испытания на коагуляцию, как указано в табл. 1

Фильтраты, содержащие 40-70% первоначальной свертывающей активности фактора УШ:С в очищенном виде, концентрируют и частично обессоливают, пропуская через полупроницаемые мембраны (Millipore Pellicon Cassette filtration system или Amicon Ш4 hollow fiber concentrator sys- tem.

Концентрированный раствор сушат вымораживанием и упаковывают для их хранения.

В табл, 1 приведены результаты нескольких проходов фракционирования с использованием собранной плазмы стабилизированной СРДА, иллюстрирующие благоприятное действие добавления гепарина к плазме в сочетании с использованием смол А и Б.

Определение фактора УШ;С осуществляют путем индикации начала процесса свертывания.Измеряют вторую производную скорости коагулирования (т.е. скорости изменения скорости коагулирования), В качестве контроля используют плазму, в которой отсутствует фактор УШ:С, при этом в качестве активатора используют эллаговую кислоту.

Определяют время коагулирования на серийных разбавлениях используемых фракционированных проб. Полученные результаты выражают как процент выделения активности фактора УШ:С, считая на степень активности первоначально собранной пробы плазмы. Первоначальная проба считается содержащей 1 ед активности коагулирования

фактора УШ:С на 1 мл. Каждое из испытаний начинали с общего количества 200 ед коагулирования. Наконец регистрируют кумулированную единицу и процент выделения активности после каждой обработки смолой.

Пример 2. Способ осуществляют, как описано в примере 1, за тем исключением, что к исходной плазме до обработки смолой Лик фильтрату до обработки смолой Б добавляют три разные концентрации гепарина.

Результаты представлены в табл. 2.

Формула изобретения

Способ получения фактора УШ:С свертывания крови путем фракционирования его из крови адсорбцией на водонерастворимом сшитом полиэлект- ролитном сополимере с последующим элюированием целевого продукта с адсорбента, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта, плазму крови при рН 8,0 смешивают с 0,035 мас.% сополимера этилена и малеинового ангидрида, сшитого в присутствии 0,1- t,0 МЕ/мл гепарина с 5 мол.% метили-., минбисопропиламина, содержащего 90 мол.% концевых диметиламинопро- пилимидных групп, с последующим отделением супернатанта, в который при рН 5,8 добавляют 6% сополимера этилена и маленнового ангидрида, сшитого с 5 мол.% метилиминобйспропиламина, содержащего 5 мол.% концевых диметил- аминопрошшимидных групп, при этом свободные карбоксильные и ангидридные группы блокируют добавлением метокси- пропиламином в присутствии 0,1- 1,0 МЕ/мл гепарина.

Таблица 1

Контрольныепробыбез добавки гепарина

145 72,5 88

13768,5 76

10653,0 41

44,0 38,0 20,5

144

105

127±20

72,0

52,5

63,7i10,1

84 93 76,0±21,0

Пробы, обработанные гепарином (1,03 ад/мл)

171 190 166 164 204 188±27,0

85,5

95,0

83,0

82,0

102,0

93,9±13,5

118

120 112 109 139 120±12,0

В пересчете на активность первоначальной плазмы.

Таблица 2

Количество добавленного гепарина. Активностьед/мл

1,0 J 0,5 0,1

Активность, выделенная из

смолы А, %91±6 81 96±14

Кумулированная активность,

выделенная из смолы Б, % 53±17 48 5315

Одна серия испытаний.

I

Составитель А. Агуреев Редактор М. Недолуженко Техред Л.Сердюкова Корректор М.Максимишинец

Заказ 622/57Тираж 655Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Продолжение табл.1

84 93 76,0±21,0

ом (1,03 ад/мл)

118

120 112 109 139 20±12,0

42,0 46,5 38,2+10,4

59,0 60,0 56,0 54,5 69,5 59,8±5,9