Способ получения фракции сывороточного альбумина Советский патент 1980 года по МПК A61K38/38 

ЭАМК-сополимера. Полиэлектропитный сополимер предпочтительно превращают в солянокислую соль для достижения большей технологичности продукта,

П15вдпочтительный полиэлектролитный сополимер содержит около 5 метиламинобиспропиламиновых сшив иощих групп и около 90 дополнительных диметиламинопропиламиновых функциональных групп на 100 ед. ангидрида малейновей кислоты в ЭАМК-сополимере. Полиэлектролитный сополимер способен в Основном полностью адсорбирбжать йёсь альбумин кровяной фракции, йосле чего альбумин можно выделять с выходом выще 90% с 94%-ной чистотой, применяя способ горячей обработки и свлектив.ного элюирования.

Полиэлектролитные сополимеры смешивают с кровяной плазмой или сывороткой, или альбуминсодержащими фракциями крови, предпочтительно в концентрациях 1-5% сополимера, Регулировкой значения рН смолисто-белковой смеси на разные уровни вначале удаляют выборочные белки. При рН 5,5-7,5 смолой адсорбируются альбукин,Л и jS-глобулины и фибриноген, в то время как большая, часть У -глобулина остается не поглощенной и может быть выделена из остатка для терапевтических целей. Первоначальное выделение jp -глобулина осуществляют при рН 6, Часть поглощенных ир -глобулинов и фибриногена выделяют доведением рН смолисто-белковой смеси примерно до 4,7 с последующим сбором десорбированного Остатка.

Значение рН смолисто-белковой смеси затем доводят до 5,0-5,5 с нагревом до температуры примерно 65-72 0 в течение 1-4 ч, рН регулируют в пределах 5,2-5,3 с нагреванием смолисто-белковой смеси примерно при,72°С в течение 1 ч.

При осуществлении стадии горячей Обработки остаточные глобулины, в основном (/ ч -глобулины, денатурируются, в то время как альбумин не денатурируется и легко поддается выделению. После обработки нагревом рН доводят до 3,5-4,5 для элюирования из смолисто-белновой смеси желательного альбумина. Смолисто-белковую смесь перёд регулировкой рН охлаикдают, после чего значение рН доводят до 4, Выделяют гшьбумин осаждением, фильтрацией или центрифугированием, предпочтительным способом является фильтрёщия смолисто-белковой смеси с отрегулированным рН, промывка и сбор фильтрата в виде желательной альбуминовой фрак:ции, высокой степени чистоты. Регулировку рН , на необходимый уровень осуществляют обработкой кислотным

или щелочным буфером, например буфером на основе ацетата натрия - уксусной кислоты или же лимонной кислоты, в целях подкисления или обработкой бикарбонатом натрия или е гидроокисью натрия для подщелачивания. Предпочтительным является применение стабилизаторов альбумина, как натрийацетилтриптофанат и натрийкаприлат смеси смола-белок во

Q время обработки нагревом с учетом их стабилизирующих свойств.

Пример 1, Полиэлектролитный полимер состоит из смолистого продукта взаимодействия в основном эквимолярных частей этилена с ангид5 РИДОМ малейновой кислоты (АМК), поперечно метилиминобиспропиламином (МИБПА) и затем подвергнутого взаимодействию с диметиламинопропиламином (ДМПА) таким образом

0 чтобы образовалось около ,пяти МИБПАсшивающих групп и около 90 ДМПА-дополнительных групп на 100 ед. АМК в ЛМК-сополимере, и превращенного в солянокислую соль. Вначале полиэлект5 ролитный сополимер промывают в

0,04 М хлористом натрии. Плазму, полученную из смешанной человеческой крови, разбавляют с применением 3 частей воды на 1 часть плазмы,посQ ле чего примешивают 2 вес,% промытого полизлектролитного сополимера (2 г/100 мл). Значение рН смеси смола-плазма доводят до 6,0, затем 30 мин перемешивают, фильтруют и ,

промывают 0,002 М хлористым натрием. Фильтрат, в основном состоящий из у-глобулинов, р -глобулинов,фибриногена и ассоциированных кровяных факторов , выделяют из полученного смолисто-белкового остатка на фильтре,

Последний, содержащий адсорбированный альбумин, подкисляют до рН 5,2, Для достижения 0,012 М концентрации к адсорбированному СМОЛОЙ белку примешивают надлежащее количество стабилизатора на основе каприлата натрия, для достижения 0,002 М концентрации добавляют хлористый натрий. После этого в течение 1 ч при 10°С поглощенный смолой белок нагревгиот, потом материал фильтруют, фильтрат выбрасывают.

Альбумин элюируют из оставшегося смолисто-белкового жлыха путем подJ кисления до рН 4,0 в 0,002 М хлористом натрии лимонной кислотой, затем 30 мин переманивают и фильтруют. Фильтрат собирают в виде желательной альбуминовой фракции с выходом 96,6% (в пересчете на концентрацию альбумина в первоначальной плазме) при степени чистоты 98,5%, Степень чистоты элюированного из смолы альбумина определяют агар-гель-злектрофорезом в буфере

5 на основе дизтилбарбитуровой кислоты при рН 8,6 с применением электро фореэного устройства. Счет производят при 600 нм с помощью денситометра. Синий типа Соогиачйе BrAttiAnt R 250 является протеиновым кря сителем высокой чувствительности. За счет высокой степени чувствительности синий типа Coomasste Br-«e, BEue К 250 допускает определение белковых npfiMeceft в альбуминовом продукте с очень большой точностью, а проведенный количественный анализ подтверждает получение альбумииа высокой степени чистоты.

Пример 2. Повторяют способ примера 1 за исключением того, что исходная плазма представляет собой AHF-обедненную плазму. Выход и степень чистоты альбуминового продукта в основном такие же, как в примере 1.

Пример 3. Повторяют способ примера 1 за исключением того, что I включают промежуточную стадию между первой фильтрацией и горячей обработкой в целях удаления дополнительных глобулинов и фибриногена из плазма. На этой промежуточной стадии рН смолисто-белкового остатка на фильтре от первой фильтрации доводят до 4,7 в 0,002 М хлористом натрии лимонной кислотой, перемешивая затем в течение 30 мин. Смесь фильтруют, прогвлвают и потом подверггиот обработке нагревом, затем стадиям примера 1. Фильтрат от обработки с достижением рН 4,7 содержит А и -глобулины и фибриноген, которые собирают для использования в различных известных терапевтических и диагностических целях. Целевой альбумин получают с выходом и степенью чистоты в основном аналогичными примеру 1.

Следуя способу выделения очищенH.ot-o альбуминового продукта, альбумин концентрируют до требуемого уровня, рН кокцентрированяого продукта доводят до физиологически приемлемого значения и содержания электролита, затем нагревают для уничтожения вирусов, доводят до прозрачного состояния фильтрацией или иными способами для получения клинически прягояного вещества, соответствующего требованиям, предъявляемым к обычно сывороточному материалу. К предпочтительному спосо-бу концеитрирова Ешя, применяемому на практике, от№э зятся лйофияиэация с последующим перхает ведением до желательной конце «1 рации, например 5 5 или 25%-ная у.р екфрафильтрация.

Предлагае1 1й сяфсо.б позволяет повысить выход целевого продукт даЗ 96,6% при степени чтстоты 98,5%.

20

Формула изобретения

Способ получения фракции сывороточного альбумина путем адсорбция

25 на нерастворимых в воде поперечно сшитых .полиэлектрсяитных сопопямерах этилена с ангидридом малеиновой кислоты с содержанием допсшнитепьных двяндатиламинопропиловых фун циональных групп с посяед5помям элю30ироваьием целевого продукта, о тличающийся тем, что, с целью повьвяения чистоты и выхода целевого продукта, адсорбцию проводят на сополимере при рН 5-5,5 и температуре 65-72 С в течение 1-4 ч и затем устанавливают рН смеси 3,54,5.

Источники информации, 40 принятые во внимание при экспертизе

1. ПатентСША 3555001, кл. 266-112, опублик. 1969.