Способ выделения специфического фактора УШ Советский патент 1984 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к фракцио нированию крови, в частности к способам вьщеления специфического фактора УШ. Процесс свертывания крови является сложным физиологическим явлением, включающим взаимодействие многих веществ, содержащихся в обыкновенной цельной крови. Известно, что в некоторых организмах отсутствуют или же содержатся в слишком малом количестве определенные факторы, связанные с механизмом свертывания крови. У пациентов, страдающих классической формой гемофилии, в недостаточном количестве содержится антигемофиль ный фактор А (АГФ, фактор УШ). В организме пациентов, страдающих гемофилией В, отсутствует в крови плазменно-тромбопластиновый компон (ПТК, фактор IX), У небольшого чис ла страдающих гемофилией также не хватает так называемого фактора фо Виллебранда, родственного фактору УШ. Известен целый ряд иных факторов, играющих: важную роль в механ ме свертывания крови, отсутствие которых также может привести к нарушениям кровотечения, это,- напри мер, факторы II, УП и X. Последние три фактора совместно с фактором IX зачастую называют факторами протромбинового комплекса, В системе развития современных программ хранения крови, включаю щих сбор и складирование больших количеств крови и ее компонентов, отработка надлежащих систем консервирования стоит очень остро. Начиная с периода второй мировой войны вошло в практику хранение крови в растворе лимонной кислоты цитрата натрия и декстрозы, извест ного как ACD-bPood. Проблема консервирования крови сильно упрощается, если дна сводится к консервированию отдельных компонентов крови, поскольку легче достичь условий, необходимых для данного компонента, чем для цельной крови. Более того, совершенно излишне и даже вредно вводи в организм пациента большее число компонентов крови, чем требуется. Так, страдающим гемофилией и требующим определенных факторов свер тывания крови, лучше всего вводит только эти факторы или, по меньше мере, очищенный Концентрат этих факторов. Известно фракционирование факторов свертывания крови, в частности фактора УШ и факторов, родственных протромбиновому комплекс К ряду различных соединений, нахо дящих применение при таком фракци онировании, относятся, например, сульфат бария, гидроокись алюминия, полиэтиленгликоль, риванол-(6,9-диамино-2-этоксиакридинлактат ) глицин, ДЭАЭ-целлюлоза и ДЭАЭ-сефадекс ij . Однако данный способ является многостадийным и поэтому трудоемким. Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ выделения различных компо- . нентов крови,.в том числе и фактора свертывания УШ, из сыворотки или плазмы крови с помощью не Ьастворяющегося в воде поперечносжатого полизлектролита. Способ предусматривает контактирование исходной жидкости с нерастворимым в воде поперечно-сшитым полиэлектролитом - сополимером малеиновой кислоты или ее ангидрида и ненасыщенного мономера выбранного из группы, состоящей из этилена, стирола и изобутилена, со степенью замещения карбоксильных или ангидридных групп аминоимидами, выбранными из группы, состоящей из динизшего алкиламинонизшего-алкилимида и низшего алкилимино-ди-(низшего-алкилимида), где алкил содержит 1-5 атомов углерода, равной.2-100% общего количества указанных карбоксильных или ангидридных групп в сополимере, с последующим элюированием. Процесс выделения основан на адсорбционном взаимодействии выделяемого белкового продукта и Используемого полиэлектролита, имеющего в своей структуре электростатически заряженные группы . Однако при фракционировании фактора УШ определенными полизлектролитами, известным способом обнаружено, что применение выделенных факторов крови в стандартных опытах определения времени сгусткообразования вызывает значительное сокращение времени сгусткообразования. Эта предварительная активация выделенного компонента - фактора УШ Представляет собой серьезный недостаток при использовании этого материала в клинической практике. Такую преждевременную активацию наблюдают и на собаках при внутривенном введении этого фактора в организм собаки. Реакции состоят в следующих симптомах: изменение поведения - собака крутится в клетке в течение 24 ч.; реакция гемолиза, что проявляется в выделении гемоглобина с мочой; заметное сокращение ко личества тромбоцитов при одновременном повышении давления крови. Обнаружено, что эта преждевременная активация связана со структурой и составом адсорбирующего полиэлектролита, в котором могут содержаться свободные гидроксильные группы, способные к образованию водородных связей. Так, поли- i

электролит может содержать следующие структурные полимерные зыенья:

1. СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ФАКТОРА VIII из сыворотки или плазмы крови путем контактирования исходной жидкости с нерастворимым в воде поперечно-сшитым полиэлектролитом - сополимером малеиновой кислоты или ее ангидрида и ненасыщенного мономера, выбранного из группы, состоящей из этил1эна, стирола и изобутилена, со степенью замещения карбоксильных или ангидридных групп аминоимидами, выбранными из группы, состоящей из динизшего алкиламйно-низшего-алкилимида и низшего алкилиминоди-(низшего-алкилимида), где алкил содержит 1-5 атомов углерода, равной 2-10% от общего количества указанных карбоксильных или ангидридных групп в сополимере, с последующим элюированием, отличающийся тем, что, с целью устранения предварительной активации фактора VIII в процессе выделения, используют указанный сополимер, подвергнутый взаимодействию с алкоксиалкиламином, в котором алкоксигруппа и алкил содержат 1-5 атомов углерода, взятьем в количестве 50-85 мол.%. 2.Способ по п.1, о т л и ч аю щ и и с я тем, что используют СУ) указанный полимер, подвергнутый взаимодействию с метоксипропиламином. 3.Способ ПОП.1, отличающийся тем, что используют указанный полимер, прдвергнутый взаимодействию с метоксиэтиламином. 4.Способ по П.1, о т л и ,ч а ющ и и с я тем, что взаимодействие исходной жидкости с полиэлектролитом осуществляют при рН 5,5-9,5.

ш

СшиВан}ш,ая группа

где R - алкил с числом атомов углерода 1-5;

Z - двухвалентный углеводородный остаток с числом атомов углерода 2-18. Согласно известному способу полиэлектролит может содержать 2-100% аминоимидных связей, причем остающиеся карбоксильные группы - в ангидридной форме. Остаточные немодчфицированные полимерные ангидридные звенья превраицают в нейтральные группы или звенья путем взаимодействия непрореагировавших ангидридных звеньев с такими соединениями, как алкиламины, аминрспирты и спирты. В приведенной структурной формуле - функциональные аминоимидные связи показаны при Г, поперечно-сшивающие связи при III, а остающиеся карбоксильные группы в ангидридной форме показаны в состоянии превращения в нейтральные группы блокированием или взаимодействием с аминовым спиртом при II, вызывая образование оксиалкилимидных звеньев.

Несмотря на указанное блокирование остаточных ангидридных групп аминовым спиртом при II, обнаружено, что свободные гидроксильные группы, введенные таким о.бразом в полимерный каркас в виде оксиалк11лимидных групп при II (см.формулу), содействуют упомянутой прегщевременной активации фактора УШ, фракционированного этим типом полиэлектролита .

Предполагается, что активация

0 фактора УШ может быть частично связана с присутствием плазменных зимогенов или ферментов от активации зимогена в выделенной фракции фактора УШ. Эти зимогены, как

5 известно, активируются отрицательно заряженными поверхностями или гидроксилированными поверхностями, могущими образовать водородные связи, такие как коллаген. Указан0ные полимеры, содержащие свободные гидроксилы, способны образовывать внутри- и межцепочную связь с белками через образующиеся отрицательно заряженные БОНЫ.

Целью изобретения является уст5ранение предварительной активации фактора УШ в процессе выделения.

Указанная цель достигается способом выделения специфического фактора УШ из сыворотки или плазмы кро0ви путем контактирования исходной жидкости с нерастворимым в воде поперечно-сшитым полиэлектролитом сополимером малеиновой кислоты или ее ангидрида и ненасыщенного моно5мера, выбранного из группы, состоящей из этилена,стирола и изобутилена, со степенью замещения карбоксильных или ангидридных групп аминоимидами, выбранными из группы,

0 состоящей из динизшего алкиламинонизшего-алкилимида и низшего алкилиминоди-(низшего-алкйлимида), где алкил содержит 1-5 атомов углерода, равной 2-10% от общего коли5 чества указанных карбоксильных или

ангидридных групп в сополимере с последующим элюированием, причем используют указанный сополимер, подвергнутый взаимодействию с алкоксиалкиламином, в котором алкоксигруппа и алкил содержат 1-5 атомов углерода, взятым в количестве 50-85 мол.%.

Обычно используют указанный полимер, подвергнутый взаимодействию с метоксипропилг1Мином, или метоксиэтиламином.

Взаимодействие исходной жидкости с полиэлектролитом осуществляют при рН 5,5-9,5. Таким образом/ весьма-предпочтительным является перевод непрореагировавших ангидридных звеньев во время получения алкоксиалкилимидных единиц с применением алкоксиалкиламина, например метоксипропиламина Это ангидридное блокирование может нестись в любой последовательности синтеза полиэлектролита.

I

Полимеры типа ЭАМК (этиленангидрид малеиновой кислоты или сама кислота) на основе карбоновых кислот или их ангидридов, в частности олефиновые полимеры на основе малеиновой кислоты или ее ангидрида указанного типа. Сополимеры получают путем взаимодействия этилена или иного ненасыщенного мономера ил их смесей с ангидридом кислоты в присутствии перекисного катализатора в растворителе на основе алифатического или ароматического углеводорода, растворяющего мономеры, но не растворяющего полученный Промежуточный полимер. К соответствующим растворителям следует отнести бензол, толуол, ксилол, хлорированный бензол и т.п. Перекись бензоила обычно является предпочтительным катализатором. Другие перекиси: ацетила, бутирила, дитретичного бутила, лаурила и т.п. или же .тобой из множества аэо-катализаторов также удовлетворительны вследствие их растворимости в органических растворителях. Сополимер содержит, в основном, эквимолярные количества олефинового и ангидридного остатка. Он обладает степенью полимеризации примерно 8-10000, предпочтительно примерно 100-5000 при мол. массе около 1000-1000000, предпочтительно примерно 10000SOOOOO. Свойства полимера, как, например, молекулярная масса, регулируют выбором катализатора и регулировкой одной или нескольких переменных, таких, как соотношение реактивов, температура, концентрация катализатора или же добавлением регулирующих перенос цепи средств, .таких как дру зопропилбензол, пропионойая кислота, алкилальдегиды и т.п.

После образования исходного полимера ЭАМК его агрегатируют путем нагрева в инертном органическом растворителе при температуре примено 155-160С, но ниже точки размягчения полимера, в течение приблизительно 15 мин. Вследствие этой агрегации улучшаются фильтруемость качества при сушке и физические свойства полимера, используемого при получении полиэлектролита без существенного уменьшения способности его поглощать белок.

Однако для предлагаемого способа эта агрегация не играет существенной роли.

Упомянутый первоначально полученый полимер, агрегатированный или не агрегатированный, представляет собой поперечно-сшитый продукт, замещенный аминоимидными группами в последовательности, оптимизирующей свойства продукта, что осуществляется надлежащим распределением специфических групп внутри самих частиц.

Эти группы в общем основные и могут быть алифатическими или ароматическими. Предпочтительными алифатическими неразветвленными rpynnaiMH являются динизшие алкиламино-низшие алкилимидвые или низшиеалкилиминоди-(низшие-алкилимидные).

Исходные сополимеры ангидридов и другого мономера можно перевести в карбоксилсодержащие сополимеры путем взаимодействия с водой и их соли , С1ММОНИЯ , щелочных и щелочноземельных металлов и алкиламиновые соли - путем взаимодействия с соединениями щелочных и щелочноземельных металлов, аминами или аммонием. К прочим пригодньом производным приведенных полимеров относятся алкил или другие сложные эфиры, алкиламиды, диалкиламиды, фенилалкиламиды или фениламиды, полученные путем взаимодействия кабоксильных групп на полимерной цепи с выбранными аминами или алкилом, или фенилалкиловым спиртом, а также сложные аминоэфиры, оксиамиды и сложные оксиэфиры, где функциональные группы отделяют алкиленом, фенилом, фенилалкилом, фенилалкилфенилом или алкилфенилалкилом или иными арильными группами. Звенья, содержащие амины или аминосоли, включая группы четвертичных солей, обычно получают взаимодействием ка15боксильных групп .их ангидридных предшественников, где это возможно, с полифункциональными аминами, такими как диметиламинопропиламино, при повышенных температурах с образованием имидной связи с вицинальными карбоксильными группами. Такие дополнительные свободные аминогруппы тогда могут переводиться в их простые или же четвертичные соли. Частичные имиды исходного полимера, например типа ЭАМК, содержа щего карбоновую кислоту или ее ангидрид, получают нагревом ограни ченного количества вторичного или третичного амино-низшего-алкиламина с ангидрид- или карбоксилсодержащей формой полимера в соответств щем растворителе {например, ксилоле) при температуре примерно 140150 С до тех пор, пока больше не будет отниматься вода. Такая реакция одновременно дает имидные груп пы в соответствии с количеством добавленного амина; при этом снова образуются ангидридные группы для остатка полимерных звеньев. Таким образом образуются имид-полимерные продукты, для которых характер но содержание 2-100%-ных имидных связей, причем если образуются остаточные карбоксильные группы, то в виде ангидридов. Альтернативно частичный амидный полимерный продукт можно перевести в частичный имидный продукт путем нагрева частичного амидного полимерного продукта в вакууме при 140-150°С до прекращения отдачи воды. Такой имидный полимерный про дукт также. содержит, сравнимые количества имидных и ангидридных групп в зависимости от числа амидных-групп, первоначально содержащихся в исходном амидном полимерном продукте. Частичные вторичные или третичные амино-низшие-алкиламиды исходного полимера, например типа ЭАМК, содержащего карбоксильную кислоту или ее ангидрид, получают взаимодействием полимера с ограниченным количеством выбранного амина, взве шенного в таком растворителе, как бензол или гексан, с образованием производного полимера/ содержащего частичный амид и ангидрид кислоты, или же его соответствующего амидкарбоксилатного производного. Число амидных групп зависит от количе ства применяемого амина в сравнени с количеством используемого полимера. Такие амидполимерные продукты обычно содержат 2-100% групп причем остающиеся карбоксильные группы содержатся в виде кислотных или ангидридных групп. При необходимости может проводиться блокирование и деблокирова:Ние аминового звена реактива, применяемого при получении аминов или иминов. Остаточные немодифицированные полимерные звенья можно перевести в нейтральные группы или звенья путем взаимодействия с определенными нефункциональнЕЛМи группами, такими как алкиламины, аминоспирты и спирты. Альтернативно в полимере можно достичь дополнительно катионного характера путем введения мономеров, придающих основный или катионный характер, таких как С-винилпиридины, виниламин, различные аминозамещенные винилбензолы (или толуолы и т.п.), аминосодержащие акрилаты (или метакрилаты и т.п.), винилимидазол и сходные мономеры такого же рода. Таким образом, в любом случае полимерный продукт будет содержать остаточные активные реакционноспособные группы, которые могут принадлежать к различнейшим ти- , пам, включая смеси,при этом однако эти активные или реакционноспособные группы или остаточные ционноспособные места внутри полимера тем или иным образом содержат определенное процентное количество групп основного характера в целях придания полимеру необходимой основности. В частности, предпочтительные полимеры, соответствующие приведенным требованиям и свойствам, выбранны из группы, включающей сополимеры, содержащие этиленмалеиновуй кислоту или ее ангидрид, стиролмалеиновую кислоту или ее ангидрид, метилпентенмалеиновую кислоту или ее ангидрид и изобутиленмалеиновую кислоту или ее ангидрид. Как видно из сказанного, основные группы поликатионного или полиамфолитического электролита (ПЭ.) обладают имидным характером, включая динизшие-алкиламино-низшие алкилимидные группы, полученные путем взаимодействия динизшего алкиламино-низшего-алкилимида с карбоксильными группами предварительно полученного полимера или же полимеризацией ненасыщенного олефина с ненасыщенными кислотой или ее ангидридом, содержащими также предварительно полученные имидные группы в количестве не менее части ненасыщенного реактива - поликарбоновой кислоты. Имидные группы можно образовать поперечным сшиванием полимера с помощью низшей алкилимино-5ис -(низшего-алкиламина), который в процессе поперечного сшивания путем взаимодействия между конечными аминогруппами сшивающего агента и карбоксильными группами в полимерной цепи образует имидогруппы на обоих

концах сшивающей цепи с образованием желаемых низших-алкилимино-Su (низших-алкилимидных) связей. Другие группы, такие как динизшие-алкиламино-низшие алкиламидные, из которых путем наГрева при повышенных температурах могут быть получены требующиеся имидные группы, также могут присутствовать. Могу присутствовать и динизшиеалкиламино-низшие алкильные сложноэфирные группы, так же как и другие группы, если только в полиэлектролитной молекуле содержатся требуемые процентные количества имидных групп необходимого типа, равно как и остаточные кислотные группы исходной ненасыщенной кислоты или ее ангидрида в случае, если полиэлектролит представляет собой полиамфолит. Кислотные и имидные группы не обязательно должны присутствовать в полиэлектролите, они могут присутствовать в виде своих простых производных, -наприизер солей.

К алициклическим или ароматическим группам, которые могут быть замещены на агрегатированных полимерах типа ЭАМК, например, относятся амино-низший алкилпиридин, пиперидин, пиперазин, пиколин, пирролидин, морфолин и имидазол.

Эти группы могут быть замещены на агрегатированном полимере способом, аналогичным аминам с алифатической цепью, но с применением вместо циклических аминов, например, следующих соединений:

2-Аминопиридин;

2-Амино-4-метилпиридин;

2-Амино-6-метилпиридин;

2-(2-Аминоэтил)-пиридин;

4-(Аминоэтил)-пиперидин;

3-Амино- N-этилпиперидиН;

N-(2-Аминоэтил)-пиперидин;

N-(2-Аминометил)-1-этилпирролидин;

3-Пиколиламин;

4-Пиколиламин;

2-(Аминоэтил)-1-этилпирролидин;

N-(3-Аминопропил)-2-пирролидин;

N-(2-Аминоэтил)-морфолин;

N-(3-Аминопропил)-морфолин;

4-Имидазол.

Ангидридные блокирующие группы можно ввести в любой желаемой последовательности во время получения приведенных полиэлектролитов. Предпочтительно нх вводить после оразования поперечных связей и замещения желаемой функциональной аминоимидной группой. Таким образо можно блокировать любую свободную ангидридную группу путем применени избытка блокирующего агента. .

Наиболее предпочтительными блокирующими агентами являются метокс

пропиламин и метоксиэтиламин. Блокирующие ангидрид-агенты, такие как оксипропиламин и оксиэтиламин, являются недейственными для предотвращения предварительной активации факторов свертывания крови, фракционированных полиэлектролитами. Вместо них могут найти применение другие агенты, характерные для блокирования гидроксильной группы:

0 алкилирующие (например, диазометан),ацилирующие (например, ацетилхлорид) и этерифицирующие в сложный эфир (например, уксусная кислота) средства,

5 Пример.В 5-литровую колбу, оснащенную обратным холодильником, ловушкой Дина-Старка, мешалкой, емкостью для добавления реагента, термометром и оборудованием

Q для очистки азотом, загружают

193,05 г сополимера типа ЭАМК, содержащего этилен и ангидрид малеиновой кислоты, (1,5 моль, ангидридная основа) и 2700 мл ксилола.

5 Смесь перемешивают со скоростью 200 об/мин с помощью мешалки, оснащенной лопастями в 6,5 дюйма, и нагревают до температуры дефлегмации, которая колеблется в пределах 135-139 С в зависимости от содержания воды в ЭАМК и азеотропного удаления воды в течение периода дефлегмации. Шлам обрабатывают с обратным холодильником 60 мин при полном возрасте флегмы при 135°С.

5 После одного часа реактор охлаждают до 125с в атмосфере азота, добавляя 7,66 г (0,075 моль) диметиламинопропиламина (ДМАПА).Пере- мешивание продолжают в течение 1 ч

0 при 125С без обратного холодильника, после чего добавляют 10,89 г (0,075 моль) метилимино-бос-пропиламина (МИБПА), после чего всю смесь перемешивают еще 1 ч при .

5 Смесь затем нагревают с обратным холодильником (134°С) и выдерживают при этой температуре 7 ч, удаляя воду непрерывно азеотропной дистилляцией. Конечная температура

составляет 138 С. В общей сложности собирают 5,3 мл воды. Температуру шлама снижают до 115°С, добавляя затем 127,02 г (1,42 моль) метоксипропиламина (МОПА). Смесь перемешивают 1 ч без обратного холодильника при 115-J18c, после чего температуру повышают до 120 С в момент начала азеотропной дефлегмации ксилол-вода. Дефлегмацию выдерживают б ч, удаляя воду непрерывно азеотропной дистилляцией при конечной температуре 138 С и выходе 23,6 мл воды.

Продукт выделяют в виде свободного амина по следующему способу.

Указанный целевой шлам фильтруют в горячем виде (100°С), жмых еще раз растворяют в 2700 мл смеси (3:1) ксилола с этанолом, перемешивают с обратным холодильником 1 ч и фильт руют. Эту ступень повторяют второй раз,применяя экстракционную смесь 3:1 ксилола со спиртом. Затем снова фильтруют, жмых повторно растворяют в ксилоле (2700 мл) и перемешивают 1 ч при температуре дефлегмации с последующей фильтрацией. Экстрагирование ксилолом пов торяют еще раз, целевой жмых снова растворяют в 2700 мл гексана в теч ние 1 ч при комнатной температуре и фильтруют. Экстрагирование генсаном повторяют еще 3 раза, после чего целевой жмых сушат на воздухе в вальцовой мельнице с вращающимся перфорированным дном в течение 1 ч пропускают через сито с отверстиями 100 меш без дробления и сушат п вакуумом в течение ночи при 50°С. Получают 165 г тонкого продукта, проходящего через 100 меш-отверсти и 14 г более грубого продукта, не. проходящего через эти отверстия. Тонкий продукт испытывают, определяя присутствие в нем 8,09% азота и немедленно без трудностей дис пергируют в О,04-молярном рассоле. рН такой дисперсии (0,2 г продукта в 20 мл О,04-молярного рассола) составляет 8,10. Пример2. В целях переработ ки в виде гидрохлоридной соли целевой реакционный шлам примера 1 фильтруют в горячем виде,.после чего снова растворяют с обрат;НЫМхолодильником в смеси 3:1 кси|лола со спиртом два раза, снова растворяют с обратным холодильником два раза в ксилоле аналогично приме ру 1 и затем дважды экстрагируют при комнатной температуре в течение 1 ч каждый раз порциями по

Таблица 2700 мл ацетона. Фильтрованный продукт превращают в гидрохлорид повторным растворением в 2700 мл ацетона с последующим постепенным добав - лением при перемешивании в течение 10 мин 14 мл концентрированной 12 н. хлористоводородной кислоты. Домешивают затем еще 2 ч при комнатной температуре. Фильтрованный продукт затем сразу же промывают (в случае шлама - с перемешиванием) трижды подряд 10 л деионизованной воды в течение 2 ч каждый раз и наконец фильтруют. Оставшуюся на фильтре соль 4 раза раств.оряют повторно в 2700 мл ацетона (каждый раз в течение 1ч) в целях удаления воды, фильтруют, сушат на воздухе 30 мин . и затем в вакуумной печи при 55°С. Высушенный целевой продукт пропускают через сито.без дробления, причем 95% продукта проходит через отверстия в 100 меш; затем разливают по бутылям. Анализ: 7,79% азота и 2,62% хлора - ионистый хлорид. Получают 186 г продукта в виде соли, проходящей через отверстия 100 меш. Ее растворяют в О,04-молярном .рассоле (5 г на 120 мл) ; рН дисперсии составляет 3,85. П р и м е р 3. Повторяют пример 1, изменяя состав продукта добавлением разных количеств аминов примера 1. Работают по той же методике, что и в примере 1, но ни в одном случае к аминам не добавляют воды для облегчения хода процесса. Все продукты обрабатывают в виде свобод ных аминов, как в примере 1. Первый 11-часовой период дефлегмации ЭАМК в ксилоловом шламе осуществляют с полным обратным холодильником аналогично примеру 1 (без удаления воды) или же согласно таблице (с азеотропной дефлегмацией всей воды), Результаты синтеза по примерам 1-3 приведены в табл.13 .

Во время прогона 8 МИБПА добавляют в виде двух последовательных порций, каждую в течение 1-часового периода дефлегмации, в виде двухступенчатого сшивающего варианта перед удалением воды от реакции конденсации из ДМАПА и МИБПА.

П р и м е р 4, Если первоначальный 1-часовой период дефлегмации ЭАМК в этилене проводить в условиях азеотропной дистилляции, т.е. удаляя всю воду от этих реактивов перед последующими аминовыми реакциями, 40 то последние протекают с замедлением. В результате общее время завершения реакций процесса увеличивается. Путем добавления небольших количеств воды с различньа «1и аминами эту проблему 45

14

1082338

Продолжение табл. 1

можно решить. С применением способа по примеру 1 -проводят несколько прогонов, но в прогонах 7,8,10 и 11 удаляют воду от дефлегмации ЭАМК в ксилоле в течение первого часа, как в примере 3, (табл.1). В этих прогонах воду добавляют дополнительно с 3-аминами. Все прогоны обрабатывают как свободный амин примера 1. Результаты синтеза по примеру 4 даны в табл.2.

Таблица 2

МИБПА добавлен перед ДМАПА, во всех других случаях - наоборот; ГМДА - гексаметилендиамин, используемый в качестве сшивающего агента вместо МИБПА.

Пример 5. Оборудование примера 1. Загружают 193,05 г (1,5 мол ЭАМК и 2700 мл ксилола, нагревая все с обратным холодильником (137°С с перемешиванием при 200 об/мин, после чего дефлегмацию выдерживают 1 ч. За это время непрерывно всю воду удаляют из смеси азеотропной дистилляцией. В ловушке Дина-Старка собирают общее количество воды (1,6 мп Через час шлам охлаждают до , добавляя 7,66 г (0,075 моль) ДМАПА и выдерживая эту смесь 1 ч при 125°С, после чего добавляют смесь 21,70 г (0,15 моль) МИБПА и 1,5 мл воды. Смесь выдерживают еще 1 ч при 125°С, затем нагревают с обратнь1м холодильником ( и выдерживают при этой температуре, непрерывно удаляя воду ловушкой Дина-Старка,

0,5

206 1,0 207 2,0 214 4,0 219

Продолжение табл. 2

в течение 15 ч, собирая в общей сложности б,3 мл воды при конечной температуре 138°С. Шлам охлаждают до 125°С, затем добавляют 113,65 г (1,25 моль) МОПА, выдерживая полученный шлам еще 1 ч при . Температуру затем повьпиают до , продолжая удалять воду азеотропной дефлегмацией в течение 6 ч с получением ее 21,5 мл. Продукт переводят в гидрохлоридную соль по способу примера 2. Осуществляют 4 прогона с применением разных количеств концентрированной 12 н. хлористоводородной кислоты для определения действия избыточного И недостаточного количеств хлористоводородной кислоты на свойства продукта.

Результаты синтеза по примеру 5 даны в табл.3.

Таблица 3

8,24

1,77

1,70 8,10 3,00 2,76 8,22 3,32 8,21

3,37 3,40

Примерб. Повторяют способ .примера 5 за исключением того, что после взаимодействия ДМАПА и МИБПА вместо метоксипропиламина (МОПА) добавляют 85,77 г (1,27 моль) МОЭА (метоксиэтиламина). Получают

Пример 7. Применяют спосо примера 1, получая продукты, в которых избыточные ангидридные группы, остающиеся после взаимодействия ДМАПА и МИБПА, подвергают полному взаимодействию либо с оксиэтиламином, либо с 3-оксипропиламином, либо с 2-оксипропиламином (табл,5). Продукты получают и как свободные амины (с применением 585 (113 г) -7(15,25 г) 81(85,2 г) Этаноламин 781(85,2 г) - Примечани

2 продукта, один в виде свободного амина путем обработки способами примера 1, другой - в виде соли хлористоводородной кислоты обработкой способами примера 2. Результаты синтеза по примеру 6 даны в табл.4.

Таблица 4

способов примера 1),и как соль 5 хлористоводородной кислоты (с применением способов примера 2). Первый час периода агрегации ЭАМК в ксилоле с обратным холодильником осуществляют с аэеотропным удалением воды, причем в каждом случае МИБПА добавляют в виде смеси с 1,5 мл воды.

Результаты приведены в табл.5. Таблица 5 е: Все молярные соотношения составов в этом и остальных примерах - в пересчете на амин; поскольку сшивающий агент взаимодействует на обоих концах, его молярные количества вдвое больше рассчитанных на ангидридную основу. нее 7,75 1,85 Свободный 8,63. амин нее ,49 2,57

Примере. Получают целый .ряд полиэлектролитов, в которых содержание сшивающего агента (МИБПА) выдерживают при 5 мол,%, а блокирующим амином/ взаимодействующим с избытком ангидридных групп, в каждом случае является этаноламин в концентрации 85 мол.%. Функциональное звено, выполняющее потециальную катионную функцию, вьщерживают в количестве 5 моль-0, но природу и структуру функционального звена варьируют с помощью применения 16 различных реакдионноспособных аминов.

Во всех случаях применяют оборудование, ЭАМК и ксилол согласно примеру 1. Шлам нагревают до 9095°С, добавляя 10,89 г {0,075 моль МЙБПА с перемешиванием 1 ч при

Диметиламинозтиламин

Диэтиламиноэтиламин

Диметиламинопропиламин

Диэтиламинопропиламин

Диоксиэтиламинопропиламин

Дибутиламинопропиламин

2-Амино-5-диэтиламинопентан

2-Аминометил-1-этилпирролидин

З-Амино-Ы-этилпиперидин

N-2-Аминоэтилпиперидин

З-Аминопропил-2-пирролидон

N-2-Аминоэтилморфолин

N-3-Аминопропилморфолин

N-2-Аминбэтилпиперазин

2{2-Аминоэтил)пиридин

N-Фенилэтилендиамин

Э5®С. Затем добавляют 0,075 моль функционального амина и перемешивают 1 ч при 95°С. Шлам затем нагревают с обратным холодильником (134С) , удаляя полностью воду азеотропной дистилляцией при конечной температуре 139°С. Затем шлам охлаждают до 95°С, добавляя S7,05 г оксиэтиламина и перемешивая шлё1М 1 ч при . Затем температуру шлама

0 повышают до 134-С, полностью удаляя воду от реакции азеотропной дистилляцией до конечной температуры 139-140°С. Целевой шлам фильтруют в горячем виде и перераба5 .тывают в виде свободного амина по iспособу примера 1, сушат, дробят на шаровой мельнице и пропускают через отверстия 100 меш. Результаты синтеза даны в табл.6.

Таблица 6

Амины прогонов 1-7 являются примерами диалкиламиноимидного замещения в полиэлектролите, в то время как амины прогонов 8-15 представляют сббой примеры ретероциклического аминоалкилимидного замещения. Для оценки 3 из них обрабатывают как соль хлористоводородной кислоты. Применяют метод примера 1 а при переводе в соль работают по способу примера 2. Диметиламинопропиламин (прогон 3 выше) выбирают в качестве примера диалкиламинотиламинопропил- 85-Оксиэтил5-3-Aминo-N-этилпиперидин

То же 5 5-3-Аминопропил- 85-Оксиэтиламин , морфолин

5 То же

П р и м е р 9. При получении гидрохлоридных солей полиэлектролитов общего состава (5 мол.% сшивающего агента МИБПА, 5 мол.% трех различных функциональных аминоалкилимидных звеньев и 85 мол.% нефункциональных имидных звеньев) работают по методике примеров 1 и 2 (см.табл.7).

Примерю. Получают метоксипропилимидные производные сополимера, содержащего стирол и ангидрид малеиновой кислоты, как в примере 5 Оборудование то же, что и в приме- ре 1. nepBOHa4anbHiTo смесь 101,1 г

(0,5 моль) стирола - ангидрида малеиновой кислоты и 2,7 л ксилола нагревают с обратным холодильником при 135°С, азеотропно дистиллируя воду 1 ч и затем охлаждая до 125°С; затем добавляют 2,55 г

(0,025 моль) ДМПА, нагревая смесь без обратного холодильника 1 ч.

алкилимидного замещения, а 3-аминоN-этилпиперидин и N-3-аминопропилморфолин (прогоны 9 и 13 выше)в качестве примера гетероциклического с1миноалкилимидного замещения. Во всех трех случаях полиэлектролиты в виде соли получают с применением оксиэтиламина и метоксипропиламина в качестве третичного амина, взаимодействующего со всеми избыточными ангидридными группами. Эти продукты приведены в табл. 7.

Таблица 7

1,81

236

8,41

амин

85-Метоксипро- 186

2,62 7,79 пиламин

1,54

85-Оксизтиламин 238

7,37

85-Метоксипропил-244 8,19 1,20 амин

85-Метоксипро- 234 7,58 1,59 пиламин

Затем добавляют смесь 2,91 г (0,025 моль) гексаметилендиамина (ЩЦА) и 1,0 мл воды, продолжая нагревать с обратным холодильником 1.4. Через час снова добавляют 2,55 г ДМАПА (0,025 моль) и 1 ч нагревают при 125°С. Шлам затем нагревают до 135°с с обратным холодильником в течение 4 ч с азеотропной дистилляцией воды (собрано 1,25 мл). По.охлаждении до 125°С добавляют 40,56 г метоксипропиламина, нагревая затем шлам 1 ч до 125°С. Затем шлам нагревают с обратным холодильником () с азеотропной дистилляцией в течение 6 ч, удаляя тем самым 8,2 мл воды с помощью ловушки Дина-Старка. Продукт получают в виде гидрохлоридной соли с применением способа примера 2 и 5,0 мл концентрированной 12 н. хлористоводородной кислоты. Целевой 5 промытый продукт составляет 113,0 г 250 8,55 1,68

и по анализу содержит 5,27% азота 1,00% хлора.

Пример 11. Получают метилосипропилимидные производные сополимера, содержащего иэобутилангидрид малеиновой кислоты, как в примере 5, применяя оборудование примера 1. Исходная смесь 154,16 г (1,0 моль) изобутилена-а.нгидрида малеиновой кислоты и 2,7 л ксилола обрабатывают с обратным холодильником при 135°с при азеотропном удалении воды в течение 1 ч, после чего охлаждают до . После этого добавляют 5,11 г (0,05 моль) ДМАПА, нагревая шлам 1 ч при 120125°С без обратного холодильника. К этому шламу добавляют 7,.26 г (0,05 моль) МИБПА и 1,О мл воды, после чего смесь снова нагревают 1 ч при 120-125°С без обратного холодильника. После этого шлам нагревают с обратным холодильником (135°С), удаляя воду азеотропной дистилляцией в течение 4 ч. Конечная температура 137с, количество отобранной воды 1,20 мл. После снижения температуры шлама до 120 добавляют 84,7 г метоксипропиламина, нагревая смесь потом без обратного холодильника при 120-125°С 1 ч. После этого температуру шлама повышают для дефлегмации (135с) ,и 6 ч удаляют воду от реакции азеотропной дистилляцией. Конечная температура , количество собранной воды 16,3 мл. Продукт получают в виде гидрохлоридной соли с применением способа примера 2 с помощью 10,0 мл концентрированной 12 н. хлористоводородной кислоты. Целевой промытый и высушенный продукт составляет 186 г и содержит 6,44% азота и 1,25% хлора.

Пример12. В колбу емкостью 5 л, оснащенную обратным холодильником, ловушкой Дина-Старка, мешалкой, емкостью для добавления реактива, термометром и оборудованием для очистки азотным газом, загружают 193,05 г сополимера типа ЭАМК, содержащего- этиленангидрид малеиновой кислоты (1,5 моль .в пересчете на ангидрид) и 2700 мл ксилола. Смесь перемешивают при 200 об/мин с помощью лопастной мешалки (6,5-дюймовой) с нагревом до температуры дефлегмации. При этой температуре шлам выдерживают 60 мин с полным возвратом флегмы п 135°С. По истечении 1 ч реактор охлаждают до 125°С под азотом, добавляя затем смесь 10,89 г МЙБПА (0,075 моль) и 1,5 мл воды. Смесь затем нагревают с обратным холодильником (134-с) и выдерживают 1 ч при этой температуре, непрерывно удаляя воду азеотропно до конеч

ной температуры 137°С. Температуру реакционной смеси снова понижают до 125-с в атмосфере азота, добавляя затем смесь 153,3 г (1,5 моль) ДМАПА и 4,5 мл воды. Затем нагревают до 133-с, выдерживая при этой температуре 1-10 мин до начала дефлегмации. В результате реакции образуется вода. Перемешивание и нагревание с обратным

0 холодильником продолжают до завершения азеотропной дистилляции воды. Конечная температура 139С.

Для получения гидрохлоридной соли приведенный шлам фильтруют в горячем виде, повторно растворяя жмых в 2700 мл смеси 3:1 ксилола со спиртом, перемешивая затем 1 ч с обратным холодильником и фильтруя в горячем виде. Этот прием повторяют при дефлегмации еще раз в течение 2 ч и третий раз в течение 3 ч, причем после каждого прогона фильтруют в горячем виде. Полученный экстрагированный продукт снова растворяют в 2700 мл

5 ацетона в течение 1 ч при комнатной температуре и фильтруют, после чего жмых снова растворяют в 2700 мл ацетона в течение 1 ч при комнатной температуре и фильтру0ют. Этот экстрагированный жмых растворяют в 2700 мл спирта при комнатной температуре и переводят в гидрохлоридную соль путем добавления в течение 10 мин 112 мл концентрированной 12 н. хлористоводородной соли с перемешиванием при комнатной температуре в течение 2 ч. Фильтрованный продукт после этого промывают(при наличии шлама - с перемешиванием) три раза подряд 10 л деионизированной воды (каждый раз по 2 ч) и фильтруют. Солевидный жмых сновка растворяют , 4 раза в 2700 мл ацетона, каждый раз по одному часу в целях удаления воды, фильтруют, сушат на воздухе 30 мин и в вакуумной печи при 55с в течение ночи. Целевой продукт состоит из 333 г проходящего через отверстия 100 меш про0дукта (не дробленого.) , содержащего 10,65% азота и 13,03% хлора в виде хлоридного иона.

Пример 13. Применяя обо.рудование и способ примера 1 полу;чают пробу-образец полиэлектролита с содержанием только звеньев сшивающих агентов МИБПА и МОПА, т.е. без ДМАПА или других функциональных аминов.

Смесь 193,05 г ЭАМК и 2700 мл ксилола нагревают с обратным холодильником 1 ч с удалением воды при 135°С в количестве 1,2 мл. Этот шлам охлаждают до 125°С, добавляя 5 затем 13,37 г (0,150 моль) МОПА

с перемешиванием при 125 С в течение 1 ч. После этого за два приема добавляют; МИБПА - сначбша в количестве 21,79 г (0,150 моль) и 1,5 МП вод с перемешиванием 1 ч без обратного холодильника при 125 С с последующим повышением температуры до 135°С и удалением воды азеотропно с обратным холодильником и течение 4 ч. Удаляют 7,4 мл воды. По охлаждении до 125с добавляют вторую порцию МИБПА в количестве 21,79 г (0,150 моль) и 1,5 мл воды с нагревом шлама при 125С в течение 1 ч без обратного холодильника. При 183с осуществляют второй процесс удаления воды азеотропной дефлегмацией, удаляя 5,7 мл в течение 7 ч. Шлам снова олаждают до 125с, добавляя 60,23 г МОПА, перемешивая при 125°С 1 ч и, аэеотропно удаляя воду с обратным холодильником (135-138°С) в течение 8 ч в количестве 16,2 мл. Целевой шлам фильтруют в горячем виде и перерабатывают в виде свободного амина с применением способа примера 1. Продукт состоит из 260 г вщества, содержащего 8,57% азота.

Пример 14. Проводят адсорбцию фактора УШ сгусткообразования из плазмы крови человека различными полиэлектролитами по примерам 1-13 с элюированием и выделением фактора УШ из полимерного комплекса.

Плазма крови человека, используемая для исследования фракционирования, представляет собой свежезамороженную плазму из цельной крови доноров. Общее содержание белков такой плазмы колеблется в пределах 60-80 г .на литр, причем более высокие концентрации наблюдаются летом, а не зимой.

Полученные звенья представляют собой либо О--положительиые либо А-положительные по типу.

Фактор IX сгусткообразования может быть удален из плазмы первым до адсорбирующего фактора УШ. При этом процесс будет включать следующие, стадии:

в полиэтиленовый мерный цилиндр и выливают в 2-литровый полиэтиленовый химический стакан.

5 пластине. Фильтрат сохраняют.

5 (4,25 см) так же, как в полиэтиленовый стакан.

Q удален на следующих стадиях.

Для пропускания через сито применяют 10 мл аликвотн этой плазмы без фактора IX в ходе последующего фракционирования фактора УШ.

5 При соответствующих модификациях оборудования этот же общий способ применяют при удалении фактора УШ из 1-литровых порций неразбавленной плазмы, не содержащей факР тора IX.

154-молярного рассола, доводят рН до 4,0 или 1,0 н., или 1,0-моляр5 ной лимонной кислотой. Лимонная кислота предпочтительнее вследствие стабилизирующего действия на фактор УШ. в случае применения аминовой формы полиэлектролита рН

0 следует регулировать хлористоводородной или лимонной кислотой. вЪли же применять предварительно полученную форму соли хлористоводородной кислоты, рН будет приближать5 ся к 4,О. Все последующие приемы с применением 10-миллилитровой аликвоты осуществляют в полипропиленовых или поликарбонатных центрифугах емкостью 50 мл. Перемещивают

п очень маленькими магнитными стержнями.

2000 об/мин и выбрасывают всплывший продукт.

ступени 8 пять мин при 2000 об/мин и выбрасывают всплывший продукт.

С применениемнадлежащих модифицированных приборов и оборудования для фильтрации- и незначительных отклонений от процессов промывки и элюирования фракционируют фактор УШ в объеме 1 л (от ступени 6), используя 60 г полиэлектролита на 1 л плазмы. Снова на фильтрате ступени 14 проводится биоиспытание по определению фактора У (не адсорбированного), а на фильтрате ступени 18 - по выделению фактора УШ.

Пример 15. Для сопоставления выходов описанных смол относительно выделения фактора УШ из неразбавленной плазмы крови человека методикой примера 14 и оценкой уровня активации полученного таким образом фатора УШ проводят два опыта.

Выделение или выход фактора УШ.

В качестве модификации опыта получения тромбопластина (ТСТ) проводится двухступенчатый биоопыт измерения фактора УШ. В основном, в этом опыте измеряют время, необходимое для образования сгустков стандартной плазмы-субстрата (свежей, обедненной тромбоцитами) после выделения из продукта среднего уровня сгусткообразования, посредством контролируемого по времени добавления факторов сгусткообразования из других источников. Факто 1Ы, необходимые для обычного

времени сгусткообразован-ия в опыте ТСТ в пробирке (12-20 с), это факторы XII, XI, IX, ХШ, У, фосфолипид и хлористый кальций. Эти факторы получают из исходных смесей хлористого кальция, сыворотки крови человека для факторов XII, XI и IX, сыворотки крови крупного рогтого скота для фактора У и хлороформный экстракт человеческого мозга для фосфолипида с применение шкалы времени, после чего добавляют обедненную тромбоцитами плазму. Время образования сгустков целевой плазмы-субстрата замеряют автоматически. Перед последним добавлением плазменного субстрата добавляют свежий плазменный контроль (та же плазма, что и фракционирования фактора УШ) или целевые элюенты фактора УШ в соответствующем разбавлении в качестве измеряемого источника фактора УШ.

Составляют стандартные кривые с применением стандартизованной плазмы известного содержания фактора УШ с содержанием 1 единицы фактра УШ на мл. Стандартные кривые наносят на миллиметровую бумагу в координатах: время образования crycTKQB в секундах против единиц активности фактора УШ на мл (разбавления указанного плазменного контроля). По этим стандартным кривым получают содержание фактора УШ в единицах/мл для испытуемых проб-образцов.

Стандартные кривые составляют для каждодневных прогонов при определении фактора УШ.

Весь опыт заключается в определении времени и температуры с применением фиброметра BBL Fibro- meter Fibro System ТМ, поставляемого BBL Division of Becton, Dickinson and Co., Cockeysvil1e, Mary Band и оснащенного двумя обогревательными блоками .ThermaE Prep Bofck и автоматической пипеткой контроля времени.

Био-испытание на активацию фактора УШ.

Опыт предназйачается для замера относительного времени активации фактора УШ вне плазменных условий в качестве модификации описанного опыта на частичное тромбопластиновое время. В этом тесте добавляют только фосфолипид и хлористый кальций к субстрату, обедненному тромбоцитами, Время сгусткообразования замеряют на указанном фиброметре путем добавления соответствующих разбавленных растворов фактора УШ в плазменный суб - страт. Не активированный контроль (плазма) в этом тесте дает сроки сгусткообразования в 190 с. Волее

быстрое сгусткообраэование(150 с) говорит об активации или же о присутствии активирующих ферментов. В каждом прогоне определения активации применяют два контроля препаратов быстрого сгусткообраэова ния, а также плазменный контроль и буфер.

Био-испытания на выделение проводят с остающимся от ступеней 14 и 18 (пример 14) продуктом, в то время, как опыты на активацию проводят с остающимся от ступени 18 продуктом. Все остающиеся продукты соответствующим образом разбавляются в имидазоловом буфере с получением целевого рассола с молярностью ниже 0,08.

Пример 16. Выход фактора УШ и активации продуктов, полученных в примерах ,с применением 10 мл продукта фракционирования плазмы примера 14.

Широкий спектр получения в примерах 1-13 продуктов испытывают на фракционирование фактора УШ и активацию способом примера 14, подвергая био-испытаниям на эти два па

Свободный амин0,6

Лимонной кислотой

,4

--0,4

рН доведен до5,8

НС1

2 2

0,8 0,5

0,4 прогон 2

0,5

0,4

раметра по способу примера 15. Приведенные дальше результаты действительны для фракционирования с применением 10 мл плазмы и 0,1-0,8 г ПЭ на 10 мл плазмы. Предварительной настройкой значения рН для полиэлектролитов, полученных и применяемых в виде аминов (ступень 7, пример 14), во время процесса фракционирования получают in situ соль, применяя для этого хлористоводородную или лимонную кислоту указанным образом.

Как указано в примере 14, плазма меняется от смеси к смеси, а также зимой или летом относительно общего содержания белков. Аналогично изменяются и различные звенья плазмы, применяемые для этих исследований, а именно по содержанию фактора УШ: от 0,8 до 1,3 звена на мл (пример 15, опыт 1). Время сгусткообразования плазмы по опыту на активацию (пример 15, опыт 2) колеблется между 185 и 240 с.

Результаты испытаний приведены в табл.8.

Таблица

0,72 299 Нет 0,56 270 -0,62 273 регулирования

Без предварительного лимонной кислотой доведения рН до 4,0

259

Нет 272 Есть 104 113

0,53 98

3 прогон 1 Свободный амин 0,5 ---2 - - 0,4 3 - - 0,6 -- 4 0,6 5 - - 0,6 с -

0,6

-. -

7

I I I

- - 0,5

8 0,6

-4

9

- -

10

I I

I I

11

1Свободный амин

2- - 0,5

0,5

4-- 0,5

5Свободный амин 0,5

,5

,4

8- -0,5

,5

0,5

прогон 1 HCg

I I 0,5

- - 0,5

0,5 0,5

рогон 2 -

Продолжение табл.8

198

0,49

Нет

ой кислотой

- -

270 0,56

I I 308 0,65

ной кислотой

I - « 324 0,50 0,90 317

Без испытания

0,60 340 Нет

Лимонной кислотой 0,78 269 -0,80 317 -Без испытания

Без испытания

Нет

Лимонной кислотой

I I

Лимонной кислотой

1 I

Нет

Вез регулирования

I

-

Есть I I I 2 3 4 прогон 5 Свободный амин 0,5 - с. 7 -«-t 8 9 О,5 нес - 10 - I.. 11 -I - 12 13 --.i 14 15 16 Без испы Лимонно i Лимонной Без испыт - Лимоннойтания 0,54 272 Нет кислотой 0,,64 279 - кислотой0,59 244 ания .. I I 0,43 252 ислото

Пример17. 2 образца фактора УШ, полученных с применением полиэлектролита примеров 1 и 7 (прогон 2), сравнивают относительно токсичного действия путем внутривенного вливания гончим собакам.

Продолжение табл.8

Опыты проводят на животных весом 8-9 кг; фактор УШ получают в стеРилизованной воде (10 единиц на мл). Единичные дозы по 100 единиц (100 мл) вводятся каждой собаке .Получены результаты, приведенные в табл.9.

371082338

Таблица 9

Крутится в

Нормальклетке расноестройство ЦНС)

Нормаль- Значительно ное пониженное (1-24 ч).

Без изме- На 60%

нений ниже (1-24 ч)

НормальПульсный

Без изменений(1-24 ч)

Красные шач

рики

То же

38

Продолжение табл. 9

Без изменений

Нормальный(1-24 ч)

По бедренному катетеру, подключенному к записывающему физиографу для замера пульса и кровяного давления

По гемоцитометру. По счетчику CouEter. Прогон по системе Technicon

SMAC (18 биоопытов). Технико-экономическая эффективность способа заключается в получении специфического фактора УШ без предварительной активации. Время сгусткообразования при использовании выделенного данным способом специфического фактора УШ значительно увеличивается, что обепечивает возможность эффективного использования данного компонента крови.