Изобретение относится к биотеХно- логии, а именно к гибридомной технологии, и может быть использовано в медицине и биологии для тестирования кислотостабипьного ингибитора трипсина из мочи человека (МТИ) в биологических нидкостях.
В научной и патентной литературе описаны только поликлональные антите ла к МТИ. Такие поликлональные антитела обладают высокой аффинностью, однако каждая новая партия сыворотки в определенной степени будет отличаться от предыдущей из-за индивидуальных особенностей между подопытными животными, используемыми для получения сыворотки.
Цель предложенного технического решрння заключается в получении гибридного штамма, продуцирующего моно- клональные антитела (МКА) к трипсин- с&язывающему домену кислотостабильно- го ингибитора трипсина из мочи человека. Штамм получают следующим образом. В качестве антигена используют препарат МТИ, полученный из мочи больных нефритами сорбцией белков на анионообменнике с последующей очисткой аффинной хроматографией на химо- трипсин-сефарозе без предварительного разделения МТИ на молекулярные формы. Мышей линии BALB/c иммунизируют внутрибрюшинным введением 100 мкг препарата антигена в 0,1 мл физиологического раствора, забуферен- ного Фосфатами (ЗФР) (Ю нМ Na-фосфатный буфер, рН 7,2 - 7,, 150 мМ NaCl), в полном адъюванте Фрейнда
XI Ч
ш со
(200 мкл). Иммунизацию повторяют через 7 и И дней, вводя внутрибрюшин- но по 100 мкг того же препарата в 100 мкл ЗФР с неполным адъювантом
Орейнда (200 мкл). На 21, 22 и 23 дни после первой иммунизации мышам аппли- цируют по 100 мкг антигена в ЗФР внутрибрюшинно. На 23 день клеток селезенки иммунных мышей гибри- дизуют с клеток миеломы мыши Р, 0 с помощью 0,8 мл 50%-ного раст- ,вора полиэтиленгликоля (ПЭГ) мол.массы 3350 (на среде DMEM, рН 8,0), в течение 1 мин. После гибридизации и отмывания клеток от ПЭГа, клетки высевают в 9б-луночные панели по 2 И О5 клеток в лунку. Для культивирования и селекции гибридов используют среду RPMI-16 lO с добавлением 20% телячьей эмбриональной сыворотки, 10 М гипоксантина, М0 М амино- птерина и 1,6 1СГ5М тимидина. Гибриды-продуценты клонируют 2 раза методом конечных разведений, высевая по 0,1 и 1 клетке в лунку, содержащую 10 клеток селезенки. После двух клонирований практически 100% субклонов продуцируют антитела к МТИ. Наиболее продуктивный клон выводят в массовую культуру и обозначают М2. Штамм М2 депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Всесоюзной коллекции клеточных культур 2.10.90 под номером ВСКК/П/505 Л и характеризуется следующими признаками.
Культуральные признаки. Штамм выращивают в пластиковой посуде. Посевная доза 50-100 тыс. клеток в мл. Клетки пассируют 1 раз в 3 дня, кратность рассева 1:3. Культура суспензионная, в микрообъемах может выращиваться как монослой- нап. Стандартные условия культивиро- вания: среда RPMI-1640 с бикарбонатом и 20% телячьей эмбриональной сыворотки, | мН L-глутамина, 100 мкг/мл стрептомицина, 100 МЕ/мл пенициллина при 37 С в атмосфере 5% углекислого газа. Культивирование в организме животных: интакт,ным мышам линии BALB/c за 10 дней до инъекции штамма ввво- дят по 0,5 мл пристана в/бр. Штамм
инъекцировали внутрибоюшинно по 1-5- 106 клеток в 1 мл среды Игла. Обра- зование асцита - через 12-16 дней. Возможна по крайней мере двухкратная перевивка штамма.
0 5 0
. j- 0
5
5
Характеристика целевого продукта. Птамм продуцирует моноклональные антитела - иммуноглобулины класса IgG1. Эти антитела специфически реагируют с трипсинсвязывающим доменом кислото- стабильного ингибитора из мочи чело- , века.
Продуктивность штамма. Секреция моноклональных антител на %-k день культивирования зависит от посевной дозы и варьирует в диапазоне от 10 до 25 мкг/мл культуральной среды и от 5 до 10 мг/мл асцитической жидкости. Стабильная продукция антител сохраняется как минимум до 0 пассажей in vitro и при культивировании клеток в мышах в виде асцитной опухоли.
Контаминация. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микоплазмой не выявлено при окрашивании красителями на ДНК и тимидиновой метке культуральной среды.
Криокснсервирование. Клетки штамма консервируют по клеток/мл телячьей эмбриональной сыворотки с добавлением 10% диметилсульфоксида в пластиковых ампулах. Замораживание ампул проводят в программном замора- жиаателе по следующей программе: температуру снижают до 4°С в минуту до k С и по 1 в минуту до -АО°С. Клетки хранят в жидком азоте. Размораживание проводят быстро в водяной бане при 37 С. Жизнеспособность после размораживания - по включению трипаново- го синего 70%.
Очистка целевого продукта. Для получения препарата МКЛ в количестве, необходимом для проведения иммунохи- мических исследований, асцитную жидкость освобождают от клеточных эле- . ментов центрифугированием и добавляют сульфат натрия до конечной концентрации 18%. Осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 0,02.М NaH2P04, рН 8,0 и диализуют против этого же буфера. После диализа раствор наносят на колонку мм с DEAE-Tcxyopearl 650Н, уравновешенную тем же буфером. Антитела элюируют линейным градиентом NaH2rO, рН 8,0 10-160 мМ. Иммуноглобулины класса IgG1 элюируют в интервале 60-80 мМ, чистота препарата по данным электрофореза в полнакрил- амидном геле составляет не менее 95%.
1 P н мор 1 . В гункл гплиллор- винил-чк.ш %-пуьочноч пнсели для мик- рот и гроилини адсорбируют антиген I мкг на лунку в 100 мкл карбонатно- бикарбонатного буфера (0,02 М, рН9,6, буфер С) про V С в течение номи. Для определения неспецчфического связывания R контрольные лунки вносят плазму крови человека в разведении 1:1000 (100 мкл на лунку) в буфере С. После этого в лунках панели лля блокирования свободных мест связывания в течение 1 ч инкубируют 200мкл 0;0; %-ного раствора Tween-20 в ЗФР (буфер Б). После удаления буфера в лунки вносят по 50 мкл последовательных двукратных розведений антител М2 с концентрацией от 2700 до 0,325 нг в 1 мл буфера Б и инкубируют 1 ч при комнат- ной температуре. После этого панель отмывают три раза направленной струей водопроводной .воды и для проявления связавшихся в лунках МКА вносят в ячейки по 100 мкл раствора конъюгата пероксидазы хрена с антителами кролика к иммуноглобулинам мыши, разведенного в 1000 раз буфером Б, и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. После трехкратного отмыва- ния водой для определения связавшейся в лунках пероксидазы в лунки вносят по 100 мкл субстратной смеси (100 мкл раствора о-фенилдиамика 1 мг/мл в 10 мл 0,02 М растворе цитрата натрия, рН А, 5, с 10 мкл 30%- ного раствора Н2П2) и инкубируют при комнатной температуре ло развития коричневой окоаски в ячейках. Оптическую плотность раствора при длине волны 92 нм определяют с помощью автоматического микроспектрофотометра. Неспецифическое связывание при использовании плазмы крови человека отсутствует полностью, что свидетельствует о специфичности МКА к МТИ. При этом выявляется линейный участок концентрационной зависимости связывания МКА в интервале от 21 до 168,7 нг на 1 мл с антигеном, адсорбированным на пластиковой подложке. Кроме этого, по точке перегиба кривой можно определить, что константа связывания МКА с антигеном составляет не менее 42,2 нг/мл (0,26 нМ). Таким образом, полученные МКА не только высокоспеци- фичны по отношению к МТИ, но и высо- коаффинны, и поэтому могут быть использованы для р зработки иммунофер- ментного метода определения МТИ,
Q 5 0 5 0 5
5
0
5
0
П р и м о Р 2. ЛЛР .. пелЕ ния способности антител взаимодействовать с антигеном п жидкой Фазе используют метод конкуренции МТИ в растворе и МТИ, адсорбированным на полихлорвиниловой панели. Концентрацию МКЛ выбирают в верхней части линейного участка кривой, полученной в примере 1, т.е. 80 мкг МКЛ в 1 мл буфера Б. Такой выбор обеспечивает возможность проведения конкуренции в наиболее широком интервале концентраций растворенного МТИ. Содержащийся в растворе МТИ, если он способен конкурировать с адсорбированным на подложке МТИ, связывает часть молекул МКЛ и вследствие этого уменьшается связывание МКЛ с антигеном, адсорбированным на пластике. Это приводит к уменьшению связывания конъюгата пероксидазы хрена с антителами кролика к иммуноглобулинам мыши в лунках панели и соответственно уменьшится оптическая плотность при 92 нм в этих пунках.
D лунках панели адсорбируют МТИ и блокируют свободные места связывания как в примере 1. Затем в лунках осу- вляют двукратные последовательные разведения МТИ от 20 до 0,0/8 мкг/мл в 50 мкл буфера Бив каждую лунку вносят по 50 мкл раствора МКЛ, 00 нг/мл. Перемешивают и инкубируют 1 ч при комнатной температуре. Дальнейшую обработку лунок панели проводят как в примере 1: лунки отмывают водопроводной водой, инкубируют с разведением 1:1000 конъюгата пероксидазы хрена с антителами кролика к иммуноглобулинам мыши, отмывают водой и связавшуюся в лунках перокси- дазу выявляют с помощью субстратной смеси. Конкурируя с антигеном, адсорбированным на твердой фазе, за связывание с МКЛ, жидкофазный антиген снижает количество антител, остающиеся в конечном итоге связанными с твердой фазой. Таким образом показывают, что полученные МКА связываются с МТИ как адсорбированным на твердой фазе, так и в растворе. Зто свойство можно использовать для создания конкурентного иммуноферментного метода определения МТИ в биологических жидкостях.
Пример 3 Препарат трипсин- связывающего домена МТИ получают инкубацией раствора МТИ с трипсином в течение 8 ч при 37°С. МТИ и его фрагменты экстрагируют из реакционной
гм -ги З -nt M pat пзором Ж, l j. и пмдё- хромоtofоафнрц на гоимсин-сефа- PHTP. P ) чд« 1ение различных молекуляр- ннх cVirf f JM и его фрагментов провоят гс лырильтрпцией на сефадексе .-100. Концентрацию домена, мол. мзс- гл которого пике, чем у МТИ в 3,5 раа, принято выражать в ингибиторных диницах ((1C, 1 Hf 11,5 мкг чистоо домена), гак как эго упрощает сооставление данны, по конкуренции до- мена в растворе и МТИ, адсорбированного на пластине, за СВЯЗЫВЭНИР с МКЛ. Для определения специфичности моноклональных антител МКА к детерминанте, расположенной на трипсинсвязы- влющем домене молекулы МТИ, используют метод конкуренции за участки связывания. Процедуру осуществляют как в примере 2, но вместо двукратных разведений МТИ используют последовательные двукратные разведения домена от 0,09 до 6 ИЕ/мл буфе-- ра Б. Постоянное количество МКЛ (50 мкп, 80 нг/мл) добавляют к последовательным двукратным разведениям трипсинсвязывающего домена от 0,09 до 6 НЕ. Конкурируя с МТИ, ад- - сорбированным на твердой фазе, за связывание с МКЛ, домен снижает количество антител, остающихся в конечном итоге связанными с твердой фазой. Таким образом показывают, что МКЛ специфически связываются с трипсинсвя- зыпающим доменом молекулы МТИ.
Пример 4. Для установления возможности использования полученных МКЛ в клинических анализах с целью оп- ределения концентрации МТИ в моче человека исследуют 20 здоровых доноров и 10 больных почечными симптоматическими артериальными гипертониями (ПСЛГ) с достаточной и недостаточной Функцией почек.
Мочу смешивают с двумя объемами холодного ацетона, инкубируют 2 ч при О С, центрифугируют 20 мин, 3000 об/мин. Осадок растворяют в ЗФР, объем которого равен половине объема взятой мочи. Мммуноферментное определение проводят как описано в примере 2, за исключением того, что вместо
0
5
0
5
0
5
0
Ь
двукратных тс. сдорательшх
-i.W МТИ В ЛУНКИ ВНОСЯТ ДВУКРД1НЫС
nocne/i ;влтельные разведения (от 1/2 до 1/6М полученного раствора ацетонового осадка белков мочи человека. В качестве калибровочной кривой используют кривую, полученную в примере 2. Результаты исследований представлены в таблице.
Из данных таблицы следует, что определение МТИ в моче больных ПСЛГ с помощью иммуноферментного анализа позволяет достоверно различить группы доноров и больных с достаточной и недостаточной функцией почек. Предложенный метод с использованием МКЛ перспективен, так как различия в концентрации МТИ в моче больных с достаточной и недостаточной функцией почек являются выраженными и колеблются от Ц до 10 раз. Полученные антитела позволят воспроизводимо определять МТИ в белковых осадках мочи в
интервале концентраций 0, мкг/мл с помощью иммуноферментного анализа.
Таким образом, полученные МКА к трипсинсвязывакм-чему домену МТИ можно использовать для определения количества МТИ в биологических жидкостях человека и в частности в моче. Нет сомнений, что данное антитело может бить использовано и для реакции с ингибитором трипсина сыворотки крови человека, имеющим первичную структуру, аналогичную МТИ.
Штамм-продуцент получен на основе миеломной линии клеток мыши,, не синтезирующей собственных иммуноглобулинов и их отдельных цепей, что позволяет избежать возможных осложнений при очистке антител и гарантирует однородность конечного продукта.
Формула изобретения
Штамм гибридных культивируемых клеток животных Hus nusculus L. BCKK /П/ Г 505 Л, используемый для получения моноклональных антител к кислото- стабильному ингибитору трипсина из мочи человека.
91778183 10
Больные ПСЛГ, НТИ нкг/мл Доноры, МТИ
мкг/мл
достаточная недостаточная функция по- функция почек чек
п 5 п 5 , Mim
6,955,6
среднее, М±т
7,96±0,51 5,,0 3,810,8
