Способ определения количества жизнеспособных клеток в сушеных дрожжах Советский патент 1988 года по МПК C12Q1/06 C12Q1/06 C12R1/865 

со

00 4ib

Од

яяЛ,

СП

Изобретение относится к аналитической биохимии и микробиологии, в частности к способам определения количества живых клеток сушеных дро- жей.

Цель изобретения - ускорение процесса определения.

Способ заключается в том, что степень электропроводности уплотненных до постоянной величины электропроводности регидратированных дрожжевых клеток зависит от количества живых клеток. При более высоком количестве неживых клеток наблюдается большая электропроводность уплотненной дрожжевой суспензии, так как пространств между суспендированными дрожжевыми клетками увеличивается и оно содержи больше электролитов. Межклеточное пространство увеличивается, если оболочка клетки не способна деформироваться, что свидетельствует о повреждении клетки. При одинаковом межклеточном пространстве электропроводность повышается, если из клетки диф(|)ундирует больше электролитов, что свидетельствует о том, что мембраны клетки повреждены в процессе высупшвания дрожжей.

Таким образом, электропроводность уплотнённой суспензии сушеных дрожжей свидетельствует о количестве живых клеток.

Сушеные дрожжи суспендируют в дистиллированной воде, перемешивают до получения однородной суспензии, зате центрифугируют в пробирке, на дне которой находятся параллельные к стенкам электроды. Центрифугирование про водят при оборотах центрифуги 1800- 4000 об/мин, диаметр ротора 30 см, внутренний диаметр центрифужной пробирки 20 мм, расстояние между электродами 1,5 мм. Затем измеряют электропроводность уплотненных между электродами дрожжевых клеток при 5 кГц, используя мост для измерения полной проводимости, и по калибровочной кривой определяют количество живых клеток.

Проводя измерения при 5 кГц, калибровочный график строят, откладывая на оси абсцисс активную электропроводность уплотненной водяной сус

пензии сушеных дрожжей, измеренной при 18-20 С, а на оси ординат - количество 7КИВЫХ клеток в яроцёнтах от общего числа дрожжевых клеток, кото5

0

0

электропроводностеи, 500 кГц и 18-20°С, а

рое определяется методом витального окрашивания. Для статической достоверности результат анализа каждого

образца получен путем подсчета не менее 1000 дрожжевых клеток.

В случае измерения электропроводности при 500 кГц калибровочный график строят, откладывая на оси абсцисс

соотношение реактивной и активной

измеренных при на оси ординат - количество живых клеток в процентах от общего числа дрожжевых клеток.

Центрифугирование проводят при оборотах центрифуги 1800-4000 об/мин.

При оборотах ниже 1800 об/мин клетки между электродами недостаточно уплотняются, в результате чего .между клетками остается пространство, участвующее в электропроводимости без участия клеток, что не позволяет достигнуть постоянную электропровод5 ность и дает искаженные результаты.

При оборотах центрифуги выше 4000 об/мин клетки могут дополнительно повреждаться, в результате чего между электродами может оставаться

0 только мембранный материал без электролитов; что также вызывает, неточные

результаты .

Время центрифугирования должно быть 2-7 мин. При меньшем времени центрифугирования не достигается уплотненность клеток, при которой электропроводность становится постоянной.

При центрифугировании выше 7 мин может изменяться электропроводность уплотненной суспензии, так как в результате жизнедеятельности из клетки в анаэробных условиях могут выделяться органические кислоты, увеличивающие электропроводность, что приводит к неточным результатам.

Способ поясняется конкретными примерами.

Пример 1. 40 мг сушеных дрожжей суспендируют в 1

5

5

0

5

мл дистиллированной воды при 18-20°С, перемешивают в течение 2 мин и центрифугируют в течение 5 мин. Затем определяют активную электропроводность уплотненной при 5 кГц между электродами водяной суспензии сушеных дрожжей, которая равна 0,3-10 /Ом-см. По калибровочному графику определяют количество живых клеток, которое равно 80%.

II р и м е р 2. 60 мг сушеных дрожжей суспендируют в 1,5 мл дистиллированной воды при 18-20 С и проводят определение как в примере 1. Электропроводность равна 1,0-10 /Ом-см и количество живых клеток соответственно 20%,

П р и м е р 3. 80 мг сушеных дрожжей суспендируют в 2 мл дистиллированной воды и проводят определение аналогично как в примере 1, Электропроводность равна 0,6-10 /Ом-см и количество живых клеток соответст- , венно 43%,

Пример4, 40 мг сушеных дрожжей суспендируют в 1 мл дистиллированной воды при 18-20 С, перемешивают в течение 2 мин и центрифугируют в течение 7 мин. Затем определяют соотношение реактивной и активной эЛектропроводностей уплотненной межд электродами водяной суспензии сушеных дрожжей при 500 кГц, которое равно 0,35, П о калибровочному графику (см, чертеж) определяют количество живых клеток, которое равно 57%,

Пример5, 60 мг сушеных дрожжей суспендируют в 1,5 мл дистилли- ,Q рованной воды и проводят определение аналогично как в примере 4, Соотноше0

5

0

5

Q

ние реактивной и активной электро- проводностей равно 0,50 и количество живых клеток соответственно 80%.

В таблице представлены данные определения содержания количества живых клеток в сушеных дрожжах в зависимости от времени и скорости центрифугирования. Определение проводилось как в примере 1,

Таким образом, использование предлагаемого способа сокращает процесс определения содержания живых клеток в сушеных дрожжах до 15 мин.

Формула изобретения

Способ определения количества жизнеспособных клеток в сушеных дрожжах, предусматривающий приготовление водной суспензии дрожжей и расчет количества жизнеспособных клеток, отличающийся тем, что, с целью ускорения процесса определения, суспензию дрожжей центрифугируют в течение 2-7 мин при 1800- 4000 об/мин, измеряют электропроводность уплотненных дрожжевых клеток и по ее величине рассчитывают количество жизнеспособных клеток с учетом предварительно построенного калибровочного графика.

Изобретение относится к микробиологии и аналитической биохимии, в частности к способам определения количества жизнеспособных клеток в сушеных дрожжах. Целью изобретения является ускорение процесса определения. Способ заключается в том, что сушеные дрожжи суспендируют в дистиллированной воде, затем центрифугируют в пробирке, на дне которой находятся параллельные к стенкам электроды, при 1800-4000 об/мин в течение 2-7 мин, после чего измеряют электропроводность уплотненных между электродами дрожжевых клеток и по калибровочной кривой определяют количество жизнеспособных клеток, 1 ил. 1 табл. i СЛ

2 3 4 5 6 7

2000

2000 2000 2000 2000 2000 2000

64

80 79 80 79 81 78

Электропроводность меняется,результаты искажены

Продолжение таблицы