СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭШЕРИХИОЗНОЙ АГГЛЮТИНИРУЮЩЕЙ К-88 СЫВОРОТКИ Советский патент 1995 года по МПК A61K39/02 C12N15/00 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и представляет собой новый способ получения эшерихиозной агглютинирующей К-88 сыворотки.

Целью изобретения является совершенствование технологии промышленного изготовления эшерихиозной агглютинирующей К-88 сыворотки.

Поставленная цель достигается тем, что для получения эшерихиозной агглютинирующей К-88 сыворотки в качестве штамма-продуцента антигена К-88 используют штамм РМ 100, содержащий рекомбинантную плазмиду, которая наделяет клетку-хозяина способностью синтезировать антиген К-88 и придает ему признак устойчивости к ампициллину удобный селективный маркер, позволяющий избирательно отбирать из популяции микроорганизмов клетки, продуцирующие антиген К-88.

Штамм РМ 100 депонирован в коллекции микроорганизмов Всесоюзного государственного научно-контрольного института ветеринаpных препаратов Госагропрома СССР, регистрационный номер 420-37/16.

П р и м е р 1. Получение диагностической агглютинирующей К-88 сыворотки. Штамм РМ 100 высевают на мясопептонный агар (рН 7,2-7,4), содержащий ампициллин (100 мкг/мл) и культивируют при 37^оС в течение 24 ч. Полученную культуру проверяют на чистоту, смывают физиологическим раствором и готовят бактериальную взвесь с концентрацией микробных клеток (м.к.), равной 2 млрд. в 1 мл. Антиген вводят шести кроликам внутривенно четырехкратно с промежутками между инъекциями 6-7 дней нарастающими дозами:
1-я инъекция 2 ˙ 10⁹( ± 5 ˙ 10⁸) м.к.

2-я инъекция 4 ˙ 10⁹( ± 5 ˙ 10⁸) м.к.

3-я инъекция 6 ˙ 10⁹( ± 5 ˙ 10⁸) м.к.

4-я инъекция 8 ˙ 10⁹( ± 5 ˙ 10⁸) м.к.

Через 6-8 дней после последнего введения антигена производят кровопускание и получают от каждого кролика сыворотку, которую смешивают и консервируют азидом натрия (0,05 мг/мл).

П р и м е р 2. Получение рекомбинантной плазмиды с генами К-88. В качестве источников генов, кодирующих синтез антигена К-88, взят плазмидный штамм РМI, хранящийся в коллекции микроорганизмов Всесоюзного Государственного научно-контрольного института ветеринарных препаратов Госагропрома СССР, регистрационный номер 382-37/14.

Плазмидную ДНК выделяют традиционным методом. Молекулярное клонирование К-88 генов осуществляют с помощью эндонуклеазы Hind III в качестве реактора используют плазмиду рВR 322. Смесью Hind III фрагментов донорной плазмиды и вектора рВR 322 (10:1), обработанных лигазой фага Т4, трансформируют клетки штамма Е. соli HB 101. Учитывая, что вставка в Hind III сайта плазмиды рВR 322 приводит к инактивации тетрациклинового гена, для поиска гибридных плазмид анализируют клоны с фенотипом, Ар^r Tc^s* (Aр -4 устойчивость к ампициллину; Тс чувствительность к тетрациклину).

Среди выросших трансформантов был отобран клон с фенотипом Ар^rTc^s K-88⁺. Анализ плазмидной ДНК, выделенной из этого клона, позволяет выявить в нем рекомбинантную плазмиду размером 18,2 тыс. н.п.

При расщеплении гибридной плазмиды эндонуклеазой Hind III обнаруживают два фрагмента, один из которых соответствует вектору рВR 322 (4,3 тыс. н.п. ), второй клонируемой ДНК (13,9 тыс. н.п.).

Штамм E.соli НВ 101, содержащий гибридную плазмиду, обозначают РМ 100.

П р и м е р 3. Определение стабильности наследования гибридной плазмиды и сцепленности Ар^r и К-88 признаков в штамма РМ 100.

Бульонную культуру РМ 100 поддерживают в логарифмической фазе роста в течение 30 ч. В начале опыта, через 21 и 30 ч роста культуры, из нее делают высевы на чашки с МПА с таким расчетом, чтобы получить изолированные колонии. К 100 клонов из каждого высева изучают фенотип с тем, чтобы определить, какую долю с популяции штамма составляют клетки с рекомбинантными плазмидами. Для этого выросшие на среде клоны проверяют на устойчивость к ампициллину и на способность синтезировать антиген К-88. Все клоны, резистентные к ампициллину, одновременно синтезируют и антиген К-88. Наоборот, клоны чувствительные к ампициллину, не обладают способностью к образованию указанного антигена.

П р и м е р 4. Определение стабильности наследования антигена К-88 и признака ферментации раффинозы у штамма РМ1 (прототип). Ампулу лиофильно высушенной культуры штамма РМ1 вскрывают в асептических условиях, регидратируют в мясопептонном бульоне, инкубируют при 37^оС в течение 4 ч и высевают на МПА. Через 18 ч культивирования при 37^оС не менее чем у 100 изолированных колоний проверяют наличие антигена К-88 и способность сбраживать раффинозу. 11% испытанных колоний не содержат антигена К-88 и не сбраживают раффинозы (К-88 Raf^- фенотип), 24% колоний имели фенотип К-88⁺Raf⁺ и 65% соответственно К-88^- Raf.

Сравнение результатов, описанных в примерах 3 и 4, показываeт, что селекцией на среде с ампициллином (см. пример 2) можно избирательно отбирать клетки, синтезирующие антиген К-88, тогда как наличие Raf⁺ признака культуры (см. пример 4) еще не свидетельствует о ее способности синтезировать К-88 антиген.

Таким образом, использование предлагаемого изобретения позволит за счет упрощения приемов работы с производственным штаммом, повышения надежности метода его селекции и сокращения сроков приготовления антигена для иммунизации животных-продуцентов усовершенствовать технологию промышленного производства эшерихиозной агглютинирующей К-88 сыворотки, а также уменьшить материальные затраты, связанные с использованием дорогостоящего препарата раффинозы.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и представляет собой новый способ получения эшерихиозной агглютинирующей К-88 сыворотки. Целью изобретения является совершенствование технологии промышленного изготовления эщерихиозной агглютинирующей К-88 сыворотки. Для получения эщерихиозной сыворотки в качестве штамма продуцента антигена К-88 используют штамм РМ 100, содержащий рекомбинантную плазмиду, которая наделяет клетку хозяина способностью синтезировать антиген К-88 и придает ему признак устойчивости к ампициллину. 1 з.п. ф-лы.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭШЕРИХИОЗНОЙ АГГЛЮТИНИРУЮЩЕЙ К-88 СЫВОРОТКИ, включающий выращивание штамма-продуцента, приготовление антигена, гипериммунизацию кроликов, взятие крови у иммунизированных животных и получение целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью совершенствования технологии промышленного изготовления эшерихиозной агглютинирующей К-88 сыворотки, для иммунизации кроликов используют штамм E. coli РМ 100, содержащий рекомбинантную плазмиду с генами К-88 антигена. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве селективного фактора на стадии приготовления антигена при выращивании штамма РМ 100 используют ампициллин.