Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L-продуцент моноклональных антител против общего антигена клеток острого лимфобластного лейкоза Советский патент 1991 года по МПК C12N5/00 C12P21/08 

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано в диагностике острых лимфобластных лейкозов (ОЛЛ).

Цель изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток, продуцирующих моноклональные антитела (мо- нАТ) к общему антигену клеток ОЛЛ (ОАГ-ОЛЛ), не реагирующие с гранулоцита- ми .крови.

Штамм получают следующим способом.

Проводят гибридизацию клеток мышиной миеломы РЗХ63 Ад8.653 и клеток селезенки мыши линии BAIB/3, 3-кратно иммунизированной с 2-недельными интервалами клетками периферической крови больного с лимфоидным вариантом бласт- ного криза хронического миелолейкоза. Лейкозные клетки вводят в количестве 2 107 в хвостовую вену мыши. На 3-й день после последней иммунизации проводят слияние клеток селезенки мыши и мышиной миеломы РЗХ63 Ад8.652. В стерильных условиях извлекают селезенку иммунизиро- ва-нной мыши и клетки выдавливают в стеклянном гомогенизаторе Поттера. Взвесь клеток фильтруют через 2 слоя марли. Лимфоциты трижды отмывают средой 199 и сливают с клетками миеломы в соотношении 80 х 10б лимфоцитов к 5 х 10б

о

СА) 00

ON О

миеломных клеток. Смесь клеток помещают во флакон объемом 100 мл в объеме 20 мл среды 199, В этом флаконе клетки центрифугируют при 800 об/мин в течение 3 мин и инкубируют 20 мин при 37°С. Среду насухо отсасывают и к клеткам добавляют 3 мл 50%-ного полиэтиленгликоля с мол.мае. 1500. Через 75 с во флакон вносят 20 мл среды 199. Клетки 3 раза отмывают, не встряхивая, и инкубируют при 37°С в теме- ние 5 ч в 20 мл селективной среды ГАТ/ДМЕМ, содержащей 20% телячьей эмбриональной сыворотки, 2 мМ глютамина, 0,1 мг/мл гентамицина 0,0136 мг/мл гипо- ксантина, 0,000151 мг/мл аминоптерина и 0,00385 мг/мл тимидина. Затем клетки разливают по 0,2 мл в лунки 96-луночного плоскодонного плато. Среду меняют через 2-3 дня. Колонии возникают через 25 дней в 96 из 96 лунок. Отбор продуцирующих гибри- дом проводят в непрямой реакции поверхностной иммунофлюоресценции (РИФ) на клетках больного, использованных для иммунизации. Положительная реакция в 1 из 96 лунок. Затем супернатант этой гибриде- мы исследуют на клетках крови здоровых доноров. Клетки из лунки Г 4 дважды клонируют методом предельных разведений на фидере из тимоцитов и спленоцитов. При первом клонировании колонии вырастают в 8 из 12 лунок. Супернатанты во всех из них реагируют в РИФ с клетками, использованными для иммунизации. При втором клонировании колонии выравтают в 5 из 12 лунок, также все положительные в РИФ с клетками больного, использованными для иммунизации.

Полученный штамм обозначен ИКО-35.

Штамм гибридных клеток депонирован в специализированной коллекции переви- ваемых соматических клеток позвоночных Всесоюзной коллекции клеточных культур под номером ВСКК (II) 69 Д.

Культуральные свойства.

Для выращивания штамма используют пластиковую или стеклянную посуду. Во флакон объемом 45 см3 в 5 мл среды заливают по 5 105 клеток штамма. Пассаж 1 раз в 2-3 дня той же дозой. Штамм выращивают при 37°С на среде MEM в модификации Дульбекко, содержащей 15% телячьей эмбриональной или оленьей сыворотки, 2 мМ глютамина, 0,1 мг/мл гентамицина.

Титр антител определяют в непрямой реакции поверхностной иммунофлюоресценции на живых лимфоцитах крови. В качестве источника антител используют культуральную жидкость. Титр антител в культуральной жидкости 1:50,

Для выращивания штамма в виде асцит- ной опухоли пригодны самки мыши линии BAIB/C. Интактным мышам за 7-14 дней до прививки опухоли вводят внутрибрюшинно раздражитель (вазелин), клетки штамма инъецируют внутрибрюшинно по 107 клеток на мышь в 4,0 мл среды. Через 7-14 дней у мышей возникают асцитные опухоли. Объем асцита от одной мыши составляет 2-3 мл. Титр антител в асцитической жидкости - 104-105.

Кариологическая характеристика, Модальное число хромосом - 85. Маркерных хромосом не выявлено.

Продуктивность. Стабильность продуцирования антител сохраняется на протяжении 25 пассажей ин витро и 15 пассажей ин виво. Титр антител в культуральной жидкости 1:50, в асцитической жидкости - 10 .

Контаминация. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и при посевах на питательные среды. Заражение микоплазмой не выявлено при окрашивании красителями на ДНК и тими- диновой метке культуральной среды.

Криоконсервирование. Клетки штамма ресуспендируют в среде ДМЕМ, содержащей 15% телячьей эмбриональной или оленьей сыворотки. К суспензии клеток добавляют 10% ДМСО. Концентрация клеток (1-2) х 10 мл . Ампулы с клетками помещают в жидкий азот. Размораживают при 40°С в течение 70 с. Жизнеспособность клеток после размораживания 80-90%.

Характеристика целевого продукта.

Штаммы гибридных культивируемых клеток ИКО-35 продуцирует монАТ класса АдбЗ. Специфичность монАТ ИКО-35 определяют в непрямой реакции поверхностной иммунофлюоресценции по стандартной методике.

Моноклональные антитела ИКО-35 не реагируют с мононуклеарами крови здоровых доноров, гранулоцитами. Т- и В-лимфо- цитами, эритроцитами и тромбоцитами. В костном мозге здоровых людей монАТ ИКО- 35 определяют от 0 до 9% антигенположи- тельных клеток. В тимусе детей монАТ ИКО-35 определяют от 0 до 5% антигенпо- ложительных клеток. В то же время монАТ ИКО-35 реагируют со всеми ОАГ-ОЛЛ-поло- жительными бластными клетками больных ОЛЛ и хроническим миелоидным лейкозом в стадии властного криза. МонАТ ИКО-35 реагируют с ОАГ-ОЛЛ-положительной пре- В-клеточной линией Reh-б и не связываются с клетками линий К-562, Jurkat, Prise, HL-1, Molt-4, ML-1. Сравнение реактивности мо- нАТ ИКО-35 и монАТ I 5 доказывает их идентичную реакцию с клетками больных, но они

различаются по реакции с гранулоцитами крови,

П р и м е р 1. Ребенок, больной острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ), подвари- ант по ФАБ-классификации L 1.

Иммунологический фенотип областных клеток костного мозга:

ИКО-1(1а-антиген83%);

ИКО-01 (антиген недифференцированных бластов) 1%;

ИКО-10 (антиген ранних тимоцитов) 0% ;

ИКО-11 (LFA-1 антиген) 0%;

ИКО-ГМ1 (миелокюноцитарный антиген) 7%;

ИКО-Г2(х-гаптен)3%;

НАЕЗ - (гликофорин А) 0%;

НАЕ9 - (антиген эритробластов) 0%;

ИКО-20 (СД38 антиген) 8%;

ИКО-15 (антиген Е-рецептора) 68%;

СД5 (антиген Т-клеток) 1 %;

СД7 (антиген Т-клеток) 4%;

СД 10(ОАГ-ОЛЛ-антиген) 97%;

ИКО-35 (ОАГ-ОЛЛ - антиген) 95%;

Sig (поверхностные иммуноглобулины) 2%;

Cylg (цитоплазматические иммуноглобулины) 7,5%.

Иммунологический диагноз - общий ОЛЛ.

П р и м е р 2. Ребенок, больной ОЛЛ, подвариант по ФАБ-классификации L1.

Иммунологический фенотип бластных клеток.

ИКО-1(1а-антиген)76%;

ИКО-10 (антиген ранних тимоцитов) 0%;

0%,

0

5

0

5

0

ИКО-11 (LFA-1 антиген) 50%;

ИКОТ2 (миеломоноцитарный антиген)

НАЕЗ (гликофорин А) 0%;

НАЕ9 (антиген эритробластов) 0%;

ИКО-15(лиган Е-рецептор) 72%;

ИКО-20 (СД 38-антиген) 0,5%;

СД5 (Т-клеточный антиген) 35%;

СД 7 (Т-клеточный антиген) 25,5%;

СД10 (ОАГ-ОЛЛ-антиген) 76%;

ИКО-35(ОАГ-ОЛЛ-антиген) 17%;

Slg (поверхностные иммуноглобулины) 4%.

Иммунологический диагноз - Т-1-ОЛЛ.

Положительный эффект состоит в том, что монАТ ИКО-35, полученные с помощью предлагаемого штамма, определяют антиген ОАГ-ОЛЛ на бластных клетках, по процентному соотношению которых можно судить о иммунологическом варианте лейкоза.

Преимущество использования монАТ ИКО-35 по сравнению с прототипом (монАТ 15) состоит в том, что монАТ ИКО-35 не реагирует с гранулоцитами, что позволяет более точно идентифицировать экспрессию ОАГ-ОЛЛ на бластных клетках.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. BCKK (II) № 69 Д-продуцент моноклональных антител против общего антигена клеток острого лим- фобластного лейкоза.

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано в диагностике острых лимфобластных лейкозов (ОЛЛ). Цель изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток, продуцирующих моноклональные антитела (монАТ) к общему антигену клеток ОЛЛ (ОАГ-ОЛЛ), не реагирующие с гранулоцита- ми крови. Штамм получают гибридизацией клеток миеломы РЗ X63.Ag8.653 со сплено- цитами мышей BAIB/C, иммунизированных клетками периферической крови больного с лимфоидным бластным кризом хронического миелолейкоза. МонАТ отбирают по взаимодействию в непрямой реакции поверхностной иммунофлюоресценции с лейкозными клетками того же больного. Штамм культивируют на среде ДМЕМ с 15% сыворотки эмбриона коровы. 2 мМ глютамина и 0,1 мг/мл гентамицина. Клетки пересевают через 2-3 дня. Штамм прививается сингенным мышам в виде асцитных опухолей. Штамм продуцирует монAT класса lgC3. Титр монАТ в супернатантах 50, в асцитных жидкостях 10-10 . Штамм депонирован под номером ВСКК(И) № 69 Д. (Л С